PCR检测深部致病真菌感染的研究

目的探讨PCR在可疑深部真菌感染临床标本检测中的应用。方法对60份临床标本分别进行传统真菌培养以及真菌通用引物PCR和三重PCR检测。结果真菌培养阳性共19份，其中白念珠菌10份、烟曲霉2份、新生隐球菌2份、其他菌株5份（包括光滑念珠菌2份、热带念珠菌2份、克柔念珠菌1份）；真菌通用PCR检测共有21份阳性，经三重PCR检测共有15份阳性，分别为白念珠菌10份、烟曲霉3份、新生隐球菌2份。PCR方法与传统培养方法相比，检出率差异无统计学意义。结论PCR检测可疑深部真菌感染临床标本快速简便，稳定性好，敏感性和特异性均较理想，适合临床实验室常规使用。     

聚合酶链反应检测深部致病真菌的实验研究

目的 建立能用于临床实践的检测常见致病真菌的聚合酶链反应(PCR)方法.方法 设计了以热启动PCR为基础的实验方法,首先用真菌通用引物对标本进行单重PCR,若阳性,再用白念珠菌、烟曲霉和新生隐球菌的种特异性引物进行三重PCR来检测这3种常见致病真菌.结果 对9属55种78株常见深部真菌均扩增出260bp的DNA片段,而对细菌和人DNA均未扩增出目的 片段,具有高度特异性和敏感性,该方法操作简便且成本低.结论 以热启动PCR为基础的单重PCR和三重PCR方法可能成为临床上深部真菌感染理想的快速诊断工具.     

多重PCR诊断甲真菌病的实验研究

目的初步建立多重PCR诊断甲真菌病的方法。方法选择3对引物(真菌通用引物、皮肤癣菌特异性引物和酵母特异性引物)建立三重PCR体系,采用红色毛癣菌、白念珠菌和短帚霉摸索反应条件和验证体系的适用性;并用红色毛癣菌来测定反应的灵敏度。结果筛选得到的真菌通用引物NS、皮肤癣菌特异性引物CHS1和酵母特异性引物ACT1有较好的通用性和特异性;在适宜的反应条件下,无论对单模板,还是多模板,该反应体系均能扩增出目的片段,未见明显非特异片段的干扰;该反应体系的检测灵敏度为102cfu/ml。结论多重PCR技术是一种快速、敏感和特异诊断甲真菌病的方法。     

多重PCR技术快速鉴定血培养阳性标本中酵母菌菌种的应用研究

目的：探讨多重PCR技术在快速鉴定引起真菌血症的重要医学酵母菌中的应用。方法：扩增酵母菌位于18S rRNA和5．8S rRNA基因之间的内转录间区（ITS）1的片段,以及白念珠菌位于ITS2区的特殊DNA片段,建立多重PCR方法,并鉴定血培养液中的酵母菌。结果：通过扩增片段长度分析显示光滑念珠菌482bp,季也蒙念珠菌248bp,近平滑念珠菌229bp,白念珠菌218bp和110bp,热带念珠菌219bp,新生隐球菌201bp,克柔念珠菌182bp。采用多重PCR方法共检测29例患者47份血培养阳性标本共50个分离株,其中白念珠菌27株,热带念珠菌8株,光滑念珠菌4株,近平滑念珠菌4株,新生隐球菌2株,克柔念珠菌1株,季也蒙念珠菌1株,均与培养鉴定结果一致,实验敏感性96％（47／50）,特异性100％。多重PCR实验检测全过程共需8h。结论：多重PCR方法快速、敏感、特异,有助于播散眭念珠菌感染的早期诊断,具有较好的应用前景。     

8867株深部真菌感染分离株的菌种分析

目的：分析我院1991～2011年疑诊深部真菌感染的分离株的菌种情况,了解其动态变迁,为临床医生对深部真菌感染性疾病的诊治提供帮助。方法：统计、分析1991～2011年我科真菌室接受的疑诊为深部真菌感染的临床标本中分离出的真菌,并对前后十年白念珠菌、非白念珠菌,马尔尼菲青霉的感染率进行比较。结果：从27801份标本中分离出阳性标本8794份,阳性率31.63％,分离出26个菌种,共8867株真菌。分离出的菌株主要有：白念珠菌,热带念珠菌,光滑念珠菌,近平滑念珠菌,其他念珠菌,曲霉菌,新生隐球菌,申克孢子丝菌,马尔尼菲青霉,着色真菌等。2001～2011年间与1991～2000年间比较,白念珠菌构成比下降（礸2＝62.3）,而非白念珠菌（礸2＝125.9）和马尔尼菲青霉（礸2＝5.1）构成比上升,均具有统计学差异（P值均＜0.05）。结论：白念珠菌和非白念珠菌是深部真菌感染的主要致病菌。后十年来,白念珠菌的构成比显著下降,非白念珠菌、马尔尼菲青霉构成比显著上升。     

PCR法和传统方法对体液标本中致病真菌的检测比较

目的评价PCR方法诊断深部真菌感染的敏感性和特异性。方法应用真菌通用引物ITS4和ITS86对83例临床体液标本中的致病真菌进行PCR法快速检定,并与传统方法检验的结果进行比较。结果直接PCR扩增的阳性率与传统方法差异无统计学意义。结论采用ITS通用引物PCR法可准确、特异、快速、敏感地检测深部致病真菌。     

多重RT-PCR诊断甲真菌病的体外模拟研究

目的:拟建立多重RT-PCR诊断甲真菌病的方法。方法:采用Trizol提取真菌的RNA;选择3对引物(真菌通用引物,皮肤癣菌特异性引物和酵母特异性引物)建立3重RT-PCR体系,采用红色毛癣菌、白念珠菌和短帚霉摸索反应条件和验证体系的适用性;并用红色毛癣菌来测定反应的灵敏度。结果:(1)所采用的真菌通用引物28srDNA、皮肤癣菌特异性引物ACT和酵母特异性引物ACT1有较好的通用性和特异性;(2)在适宜的反应条件下,无论对单模板,还是多模板,该反应体系均能扩增出目的片段,未见明显非特异片段的干扰;(3)该反应体系对模拟临床标本的检测灵敏度为102cfu/mL。结论:多重RT-PCR技术可在较短时间内检测出皮肤癣菌、酵母和霉菌等,并可判断菌的活力,将为临床快速诊断和及时、合理地治疗甲真菌病和其他真菌性疾病提供参考。     

抗白念珠菌芽管单抗MAb03.2C1-C2特异性及临床初步应用研究

目的分析抗白念珠菌芽管胞壁外膜抗原单克隆抗体MAb03.2C1-C2的特异性及其应用于实验室检测的可行性。方法用临床分离白念珠菌、致病非白念的念珠菌的孢子、菌丝及常见的酵母菌、细菌做抗原包被,用间接免疫荧光(IIF)方法,对单抗特异性进行分析。取临床口腔念珠菌病患者的真菌涂片菌丝阳性的标本,用IIF方法检测。结果MAb03.2C1-C2仅与白念珠菌芽管或菌丝特异性地结合,与白念珠菌的孢子不发生结合。13种非白念的念珠菌孢子和菌丝、新型隐球菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌均不能与该单抗相结合。59例口腔念珠菌病真菌涂片IIF试验阳性的标本最终鉴定为白念珠菌(100%)。结论MAb03.2C1-C2对白念珠菌芽管有高度的特异性,并可用于口腔念珠菌病真菌涂片中白念珠菌的早期诊断。     

巢式PCR检测石蜡包埋组织中着色霉、孢子丝菌和马尔尼菲青霉

目的 评价巢式PCR对不同深部真菌感染组织石蜡包埋标本检测的价值。方法 收集着色芽生菌病、孢子丝菌病、马尔尼菲青霉病及其他深部真菌病石蜡组织标本共44份,行组织病理观察并提取石蜡组织标本中DNA。使用针对着色霉、孢子丝菌及马尔尼菲青霉核糖体DNA特定区域的特异性巢式PCR引物,分别对所提取的真菌DNA进行扩增。分析巢式PCR对这3种病原真菌扩增的敏感性和特异性,并与组织病理检查方法比较。结果 20例着色芽生菌病组织蜡块中8例扩增阳性,10例孢子丝菌病组织蜡块中7例扩增阳性,10例马尔尼菲青霉病组织蜡块均扩增阳性,其余对照深部真菌病组织蜡块扩增均为阴性,巢式PCR检测3种真菌的敏感性分别为40%、70%和100%,特异性均达到100%。组织病理检查3种真菌的阳性率分别为95%、70%、80%。结论 巢式PCR扩增石蜡包埋组织中的真菌DNA是诊断深部真菌病的一种方法,尤其适用于诊断马尔尼菲青霉病。     

聚合酶链反应技术检测申克孢子丝菌的实验研究

目的研究申克孢子丝菌的种特异性引物聚合酶链反应鉴定方法,从而为临床孢子丝菌病的分子诊断奠定基础。方法采用根据申克孢子丝菌几丁质合成酶基因1序列设计合成的一对寡核苷酸引物,分别对26株申克孢子丝菌(包括1株标准株,7株实验室保存株,18株临床分离株)及6种6株普通真菌(分属于3个菌属)的基因组DNA进行PCR扩增。结果扩增产物选择性的从26株申克孢子丝菌基因组DNA中获得,而对念珠菌属、毛癣菌属、小孢子菌属的6株普通真菌基因组DNA均为阴性。结论采用以申克孢子丝菌几丁质合成酶基因1序列为基础的聚合酶链反应法鉴定申克孢子丝菌特异、简便、快捷,可用于临床诊断。     

白念珠菌MAb03.2C1-C2特异性验证及临床研究

目的进一步验证抗白念珠菌芽管单克隆抗体MAb03.2C1-C2(MAb)的特异性及在临床中的应用价值,为今后的实验研究和应用性研究打下基础。方法用白念珠菌标准株,重庆、九江两地不同地域中临床分离的白念珠菌、非白念念珠菌、常见的酵母菌和实验室保存的金黄色葡萄球菌、绿脓假单胞菌做抗原包被,间接免疫荧光(indirect immunofluorescence,ⅡF)方法,对单抗MAb03.2C1-C2特异性进行分析。取临床口腔及阴道念珠菌病患者真菌涂片菌丝阳性的标本,MAb03.2C1-C2作为I抗,用ⅡF方法检测。结果200例被检临床病例中,84例口腔念珠菌病和51例阴道念珠菌病真菌涂片ⅡF试验阳性的标本中,最终鉴定均为白念珠菌。38例口腔念珠菌病和27例阴道念珠菌病中标本最终鉴定为非白念念珠菌或新型隐球菌。MAb03.2C1-C2仅与白念珠菌芽管或菌丝特异性地结合,与白念珠菌的孢子及其他念珠菌种的假菌丝和孢子均不发生结合,也不与金黄色葡萄球菌发生反应。61例标本8种临床分离的非白念念珠菌的孢子和菌丝不能特异性地与单抗结合;分离的4例新型隐球菌及金黄色葡萄球菌、绿脓假单胞菌均不能与该单抗相结合。结论进一步证实了MAb03.2C1-C2对白念珠菌芽管高度专一的特异性,并可用于口腔念珠菌病及阴道念珠菌病真菌涂片中白念珠菌的检测。     

多重PCR-反向线点杂交技术在检测女性念珠菌和阴道毛滴虫感染中的应用

目的建立和评价多重PCR-反向线点杂交技术(mPCR-RLB)快速同时检测阴道毛滴虫和念珠菌感染的方法。方法分别选择阴道毛滴虫特异性DNA重复序列设计一对特异性引物,以念珠菌属28srRNA至5.8s rRNA间隔序列Ⅱ(ITS2)为靶基因设计一对检测念珠菌的通用引物,构建二重PCR同时扩增阴道毛滴虫、白色念珠菌、热带念珠菌、克柔念珠菌、光滑念球菌、近平滑念珠菌、都柏林念株菌DNA,然后与通过氨基标记固定在尼龙膜上的各特异性寡核苷核探针杂交,并对女性阴道试子标本进行检测。结果多重PCR可同时扩增阴道毛滴虫、白色念珠菌、热带念珠菌、克柔念珠菌、光滑念球菌、近平滑念珠菌、都柏林念株菌临床或标准菌株DNA,上述念珠菌标准菌株可扩增出302～441bp DNA片段,阴道毛滴虫临床株可扩增出262bp DNA片段。6种念珠菌和阴道毛滴虫的特异性寡核苷酸探针可分别与其相应的PCR产物杂交。通过对150例女性阴道试子进行检测,mPCR-RLB检测念珠菌的阳性率为47.33%,阴道毛滴虫的阳性率为6.67%,二者同时阳性率为1.33%。而培养法检测念珠菌阳性率为36.00%,阴道毛滴虫的阳性率为2.00%,二者同时阳性率为0.67%。明显高于培养法(P<0.05)。结论多重PCR-RLB可快速同时检测念珠菌和阴道毛滴虫,为女性阴道炎的临床诊断提供了一种可靠的方法。     

马尔尼菲青霉临床分离株的rDNA ITS序列分析

目的 为设计马尔尼菲青霉种特异性引物,探讨马尔尼菲青霉病更加确切的诊断方法.方法 实验菌株为北京大学真菌和真菌病研究中心保存的4株马尔尼菲青霉,来源于国内不同地区.用真菌通用引物ITS1和ITS4 PCR扩增马尔尼菲青霉rDNAITS,扩增产物纯化后直接测序,测序结果在基因库核酸序列数据库进行同源序列搜索,并依据序列对比、分析.结果 4株临床分离的马尔尼菲青霉的rDNA ITS序列相同.与国外来源于美国、印度尼西亚、法国、澳大利亚的马尔尼菲青霉rDNA ITS序列基本一致.马尔尼菲青霉与荚膜组织胞浆菌、新生隐球菌、念珠菌的rDNAITS序列差异较大,青霉和曲霉属间rDNAITS的序列相似性较低,而青霉种间rDNAITS序列的差异不大.结论 不同来源的马尔尼菲青霉菌株间乃至不同青霉的种间的rDNA ITS序列均具有较高的同源性,提示该区可能不适于作为靶基因来设计马尔尼菲青霉的种特异性引物或探针.     

重要条件致病真菌感染组织免疫组化研究

目的 探索在组织中鉴定重要条件致病真真的组织病理学方法。方法 以实验小鼠白念珠菌感染组织和可疑念珠菌、隐球菌和曲霉感染的临床组织病理标本进行ＰＡＳ染色和免疫组化染色，并比较了两种方法的敏感性。结果 兔抗白念株菌多克隆抗体、兔抗新生隐球菌多克隆抗体和鼠抗曲霉单克隆抗体可以分别鉴定组织中的白念珠菌、新生隐球菌和曲霉。免疫组经和ＰＡＳ染色的敏感性差异无显著性。结论 免疫组化为组织中确定真菌和鉴定真菌种属     

EnVision免疫组织化学二步法在诊断深部真菌感染上的应用

观察微波EnVision免疫组织化学二步法检测临床常见的几种深部真菌感染的敏感性与特异性，选用鼠抗曲霉单克隆抗体、免疫新生隐球菌及兔抗白念珠菌多克隆抗体，分别对34例深部真菌感染的福尔马林固定，石蜡包埋切片进行PAS染色、微波EnVision免疫组织化学标记。结果示免疫组织化学染色示16例可疑曲霉感染14例阳性，11例可疑隐球菌感染全部阳性，7例念珠菌感染6例阳性，菌体染色清晰几无背景。结论：微波EnVision免疫组化二步法应用于深部真菌感染检测具有高敏感、低背景、快速简便的特点，在真菌病的临床病理诊断中具有很好的应用价值。     

PCR结合基因扫描分析技术对几种深部真菌病致病菌的快速检测及鉴定

目的 用PCR法快速鉴定22种(23株)深部真菌病致病菌种。方法 应用荧光标记的真菌通用引物ITS4与ITS86对22种(23株)深部真菌病致病菌种的菌悬液进行PCR扩增，扩增产物经ABI PRISM^TM377测序仪及基因扫描分析软件精确测定片段大小，与对照组——相应菌种采用传统方法抽提DNA后扩增片段的扫描分析结果相对照。结果 ①17种致病菌种菌悬液经ITS4、ITS86扩增出单一的片段(除了构巢曲霉和黑曲霉、白念珠菌和类星形念珠菌、裴氏着色真菌和皮炎外瓶霉片段长度相同)。②菌悬液扩增片段的扫描分析结果与其DNA扩增结果相近，差异无显著性。③整个检定过程仅需6h。结论 采用ITS通用引物及菌悬液PCR检测法，结合基因扫描分析技术可准确、特异、快速、敏感地检测并鉴定出22种深部真菌病致病菌种，这将有望成为快速诊断深部真菌病的一种方法。     

真菌病

20 0 0 2 2 38　病原真菌菌种的五年调查及分析 /章强强(上海医大华山医院皮肤科真菌室 )…∥中国皮肤性病学杂志 .- 2 0 0 0 ,14(1) .- 38统计数字结果表明 ,皮肤癣菌病的主要病原菌仍为红色毛癣菌 (70 .70 % ) ,其次为犬小孢子菌(10 .85% )和须癣毛癣菌 (9.13% )。在深部真菌中 ,白念珠菌比例最大 (6 5.92 % ) ,近平滑念珠菌、热带念珠菌分别占 1.6 2 %及 1.0 9% ,孢子丝菌、新型隐球菌有所增长分别占 2 .35%、1.99%。呼吸道曲霉感染中 ,以烟曲霉为主 (31% )。表 1参 1　 (张孝友 )2 0 0 0 2 2 39　 182 3例门诊浅部真菌病病原真菌的分离…     

新生隐球菌格鲁比变种、新生变种和格特隐球菌的多重聚合酶链反应鉴定

目的 建立一种基于核糖体基因内间隔区（IGS）的多重聚合酶链反应（PCR）,用于快速鉴定新生隐球菌新生变种、格鲁比变种和格特隐球菌。方法 选取新生隐球菌和格特隐球菌IGS中变异度最高的Ⅰ区（IGS1）为靶点,经ClustalW2多重比对,并结合Oligo6软件在不同序列位点设计针对新生隐球菌新生变种、格鲁比变种和格特隐球菌的引物用于多重PCR分析。通过51株新生隐球菌（VNⅠ-VNⅣ和VNB基因型）和41株格特隐球菌（VGⅠ-VGⅣ基因型）对该方法进行验证,并将该方法与已报道的CGB显色培养和采用特异性引物GPA1A、CLA4D和SOD1gattii扩增格鲁比变种、新生变种和格特隐球菌的单一引物PCR方法进行比较。结果 基于IGS的多重PCR分析成功鉴定所有92株新生隐球菌和格特隐球菌,对其他常见致病酵母的扩增均阴性,显示所设计引物较高的特异性;已报道的基于GPA1A和CLA4D引物PCR分别在鉴定2株和1株格特隐球菌时出现假阳性结果;CGB培养基在鉴定1株格鲁比变种和1株新生变种时出现假阳性结果。上述方法在鉴定时均未出现假阴性结果。结论 建立的多重PCR可快速准确地鉴定新生隐球菌新生变种、格鲁比变种、AD杂合子和格特隐球菌,且优于已报道的单一引物PCR 或CGB显色培养法。     

新生隐球菌变种问ITS序列差异的研究

目的 利用真菌核糖体基L大1内转录间隔区(ITS)序列分析和系统进化学分析来研究新生隐球菌上海变种的地位及变种问ITS序列的差异.方法 采用真菌通用引物ITS1、ITS4对12株新生隐球菌不同变种标准株的ITS片段进行PCR扩增和测序,结合基因库等数据库中11株新生隐球菌标准株的ITS序列,用CLUSTAL W1.83软件多重比对分析序列的差别,MEGA3.1软件处理数据绘制系统进化树.结果 新生隐球菌变种之间ITS序列存在明显差异,存在6种亚型;gattii变种ITS序列存在4种亚型.中国发现的新生隐球菌上海变种S8012与gattii变种在表型及分子生物学研究均存在显著的差异,但仍属于变种内差异.结论 我国发现的上海变种S8012归入gattii变种的ITSC型,原gattii变种RV20186归人gattii变种的ITSF型.     

PCR法扩增角鲨烯环氧化酶鉴定白念珠菌的研究

目的：通过扩增角鲨烯环氧化酶基因的开放读框,进行PCR来鉴定白念珠菌。方法：根据白念珠菌角鲨烯环氧化酶基因的开放读框中编码1MSSVKY^6的序列设计上游引物5‘－ATGAGTTCAGTTAAGTATG－3‘,编码^492NEIVR^496的序列设计下游引物5‘-CTATCTTACAATCTCGTTC-3‘,对白念珠菌ATCC11006,22株临床分离株,7株其它致病性念珠菌,8株致病性丝状真菌,1株新生隐球菌及1份人的基因组DNA进行了PCR扩增,并对PCR产物用酶切方法鉴定,结果：所有23株白念菌均可获得约1．5kb大小的PCR产物,16株其它致病性真菌及人的DNA标本均无扩增产物,PCR产物经BamHI酶切,产生两个大小分别约为1．0kb和500bp的片段。结论：利用设计的引物,扩增角鲨烯环氧化酶基因的开放读框,可以特异地鉴定白念珠菌。