逆转录病毒载体介导的反义白介素1β转换酶(ICE)部分阻断激活诱导的T细胞凋亡

激活T细胞在机体清除肿瘤细胞起主要作用,然而激活T细胞在杀灭肿瘤细胞的同时也伴有自身凋亡,在肿瘤治疗中难以达到足够数量激活的T细胞来杀灭肿瘤细胞,因此,阻断激活T细胞凋亡,增加激活T细胞数量,有望提高肿瘤免疫治疗的疗效.本研究应用CD3诱导Jurkat细胞系凋亡作为激活T细胞凋亡模型,应用逆转录病毒载体将反义ICE转染Ju-rkat,观察反义ICE对CD3及抗Fas单抗诱发Jurkat细胞的凋亡影响.为此本研究构建了一个反义ICE的逆转录病毒载体(pPS-3-neo-反义ICE),并转染Jurkat细胞系,发现Jurkat细胞ICE蛋白表达量下降,并部分阻断CD3及抗Fas单抗诱导Jurkat凋亡.这些结果表明应用反义技术可阻断ICE基因表达,并部分阻断CD3及抗Fas单抗诱导Jurkat细胞凋亡,因此,应用反义ICE进行基因治疗可望阻断激活T细胞凋亡,提高肿瘤的免疫治疗疗效.     

Lipofectin介导bcl-xL反义寡核苷酸抑制鼻咽癌细胞增殖活性的研究

目的　观察并探讨阳离子脂质体 (L ipofectin,L ip)介导的 bcl- x L 反义寡核苷酸 (antisenseoligodeoxynucletide,ASODN)对鼻咽癌细胞株 CNE- 1、CNE- 2 Z细胞体外抑制增殖活性的影响。方法　人工合成硫代修饰型 bcl- x L 反义寡核苷酸 (ASODN) ,与 L ip混合制备成 L ip+oligodeoxynucletide(ODN)复合物 ,处理鼻咽癌细胞株 CNE- 1、CNE- 2 Z细胞 ,用 MTT比色法检测细胞存活状态 ;流式细胞术检测细胞凋亡。结果　 ASODN处理细胞 3 6小时 ,于 40 0 μm ol/ L 浓度条件下鼻咽癌细胞的增殖受到明显抑制 ,且这一抑制作用随着浓度的增加与时间的延长而加强 ,与硫代修饰型随机序列对照寡核苷酸 (sequence control ODN,SCODN)组及单独脂质体组比较 ,差异有显著性 (P<0 .0 5 )。结论　 bcl- x L 反义寡核苷酸可显著抑制鼻咽癌细胞株 CNE- 1、CNE- 2 Z细胞体外增殖活性 ,其抑制作用可能通过封闭 bcl- x L 基因表达实现 ,bcl- x L 反义寡核苷酸有可能成为一种潜在性的基因治疗药物用于鼻咽癌的治疗     

Bcl-2反义寡核苷酸诱导胃癌细胞凋亡的研究

目的　探讨反义寡核苷酸（ＡＳＯＤＮ） 对ｂｃｌ２ 基因的表达调控及诱导胃癌细胞凋亡的作用。方法　应用ＭＴＴ方法比较两条人工合成的ＡＳＯＤＮ 直接作用及其以脂质体（ＤＯＴＡＰ） 为载体对胃癌细胞的抑制效果。应用流式细胞术和ＲＴＰＣＲ 方法检测ＡＳＯＤＮ 对ｂｃｌ２ 蛋白和ｍＲＮＡ 表达量的调控。应用相差显微镜、电子显微镜、流式细胞术等方法,观察ｂｃｌ２ ＡＳＯＤＮ 诱导ＢＧＣ８２３ 胃癌细胞凋亡的效果。结果　ＭＴＴ实验显示两条ＡＳＯＤＮ 抑制胃癌细胞增殖的作用呈浓度和时间依赖性,且靶位点于ｍＲＮＡ蛋白编码区（ＡＳＯＤＮ２） 和以ＤＯＴＡＰ 为载体的ＡＳＯＤＮ 对胃癌细胞的增殖抑制效果为佳。ＡＳＯＤＮ作用于胃癌细胞,降低ｂｃｌ２ 蛋白和ｍＲＮＡ 表达。ｂｃｌ２ ＡＳＯＤＮ处理胃癌细胞,观察到肿瘤细胞缩小、凋亡小体出现、染色质浓缩、凋亡峰等凋亡特征性改变。结论　ｂｃｌ２ ＡＳＯＤＮ可降低ｂｃｌ２ ｍＲＮＡ和蛋白表达,诱导胃癌细胞凋亡     

TC—1基质细胞系促进逆转录病毒介导的小鼠骨髓造血细？…

目的：摸索逆转录病毒介导的理想的造血细胞基因转染体系。方法：以人多药耐药基因１及增强型绿色荧光蛋白基因为报告基因,比较了小鼠骨髓细胞与病毒包装共培养、与骨髓基质细胞系ＴＣ－１共培养及单纯上清感染等不同体系的转染效率。结果：与单纯上志染法相比,ＴＣ－１基质细胞可明显提高外源基因的转染效率。３组中,以与病毒包装细胞共培养组转染效率最高。结论：骨髓基质细胞介导基因转染的方法,既可促进靶基因的转染效率,又     

肾透明细胞癌白细胞介素1β转换酶表达的研究

目的：研究肾透明细胞白细胞介素1β转移酶（interleukin β converting enzyme,ICE)的表达情况。探讨它在肾细胞癌（RCC)细胞凋亡中的作用机制。方法：采用免疫组织化学方法检测41例肾透明细胞癌组织和21例癌旁正常肾组织的ICE表达，对3例阳性细胞含量大于10％的肾癌组织进行ICE和TUNEL复杂。结果：ICE均为细胞质表达。正常肾组织阳性细胞含量为59．8％，肾透明细胞癌组织阳性细胞含量为10．4％，二者差异有显著性（P＜0．001），肿瘤组织的ICE表达随病理分级的增高而降低。ICE和TUNEL复染显示二者不具有一致性。结论:ICE在RCC细胞凋亡早期发挥作用，与RCC的发生，发展有关。     

bcl-2硫代反义寡核苷酸提高胃癌细胞凋亡的敏感性

OBJECTIVE: To study the effect of bcl-2 anti-sense oligonucleotide on the sensitivity of gastric cancer cells to Fas-mediated apoptosis. METHODS: Gastric cancer cell line MKN45 was transfected with bcl-2 anti-sense oligonucleotide, and expression of bcl-2 was examined by Western blotting. Agonistic Fas antibody was used to induce apoptosis detected by TUNEL staining and flow cytometry. RESULTS: Bcl-2 expression in MKN45 cells transfected with bcl-2 anti-sense oligonucleotide was markedly inhibited. When cultured with antibody apoptosis index of the anti-sense oligonucleotide-treated MKN45 cells was 55.6% +/- 4.7% (n = 5), which was significantly higher than that of the control (8.4% +/- 2.1%, n = 5). CONCLUSION: Expression of bcl-2 in gastric cancer cells may antagonize Fas-mediated apoptosis.     

反义端粒酶RNA对SMMC7721肝癌细胞系的作用

目的　观察反义端粒酶RNA对SMMC 772 1肝癌细胞系的作用 ,探讨抗端粒酶治疗在原发性肝癌治疗中的意义。方法　采用脂质体介导的方式将潮霉素抗性的反义端粒酶RNA真核表达载体PBBS2 12 /hTR转入SMMC772 1肝癌细胞中 ,经潮霉素筛选 ,克隆细胞株扩增鉴定后 ,采用TRAP PCR ELISA及FCM、电镜检测反义端粒酶RNA对SMMC 772 1细胞端粒酶活性和细胞凋亡的影响。结果　TRAP PCR ELISA法检细胞端粒酶活性的检测结果为 :实验组吸光度值为 0 .482 ,对照组吸光度值为 2 .86 1;FCM检测细胞凋亡结果为 :实验组 13 .8% ,对照组未见有凋亡峰形成 ,电镜观察发现转染反义端粒酶RNA的SMMC772 1细胞具有典型的凋亡细胞形态 ,细胞发生较多的凋亡。结果表明反义端粒酶RNA显著抑制SMMC772 1肝癌细胞的端粒酶活性 ,并且对其有显著的促凋亡作用。结论　反义端粒酶RNA能有效地抑制肝癌细胞端粒酶活性 ,同时显著促进癌细胞凋亡。借助抑制细胞端粒酶活性的手段来达到阻止肿瘤生长的目的 ,为肝癌的治疗提供了新的途径。     

逆转录病毒载体介导的γ—干扰素基因在人肝癌细胞中的表…

以逆转录病毒载体将人源γ－干扰素基因转导入４种不同的人肝癌细胞株，经Ｇ４１８抗性筛选均获得了阳性克隆。ＰＣＲ和ＲＴ－ＰＣＦ结果均表明ＩＦＮ－γ基因已在基因组ＤＮＡ中整合并表达。ＴＦＮ－γ生物活性检测结果表明，在基因修饰的４种不同个体人肝癌细胞株及同－细胞株的５种不同克隆中，分泌的ＴＦＮ－γ活性有较大差别。     

β1整合素反义寡核苷酸抑制卵巢癌细胞粘附侵袭的实验研究

目的　观察β1整合素反义寡核苷酸对高侵袭性人卵巢癌细胞系CAOV3粘附侵袭的抑制作用。方法　合成的β1整合素反义寡核苷酸 (asODN)用脂质体转染入CAOV3细胞中 ,通过RT PCR、流式细胞术、MTT法、聚碳酸酯膜侵袭试验测定 β1整合素mRNA和细胞表面β1整合素蛋白表达及癌细胞粘附力、侵袭力的变化。结果　asODN组β1整合素 / β actinmRNA辉度值比值为 (0 .4 4 9± 0 .0 2 9) ,与对照组为 (0 .6 0 8± 0 .0 10 )相比 ,显著下降 (P <0 .0 1) ;流式细胞术检测asODN组平均荧光指数为(2 .4 30± 0 .10 4 ) ,较对照组 (6 .15 6± 0 .0 77)明显下降 (P <0 .0 1) ;asODN组粘附力为 0 .0 86± 0 .0 0 6 ,较对照组 (0 .137± 0 .0 19)显著下降 (P <0 .0 1)。asODN组穿透聚碳酸酯膜的细胞数为 16± 2 ,较对照组 (32± 4 )亦有显著差别 (P <0 .0 1)。而随机序列寡核苷酸 (rODN)组上述各指标较对照组无明显变化。结论　CAOV3细胞 β1整合素的表达与粘附侵袭能力密切相关 ,asODN能有效抑制CAOV3细胞 β1整合素基因的表达 ,从而抑制蛋白质合成 ,降低其粘附侵袭性。     

c-myc反义寡核苷酸对胃癌MKN-45细胞株生物学影响的研究

目的:观察c-myc反义寡核苷酸(ASODN)对胃癌MKN-45细胞株的生物学影响。方法:采用脂质体介导c-myc反义寡核苷酸转染人胃癌细胞系,用四甲基偶氮唑盐法(MTT法)评价对细胞增殖的影响,免疫细胞化学ABC方法检测转染后c-myc蛋白的表达;流式细胞仪(FCM)观察细胞凋亡;RT-PCR及免疫组化方法检测c-myc基因表达变化。建立荷瘤小鼠模型,通过皮下瘤体内注射药物观察肿瘤体积和抑瘤率的变化。结果:c-myc基因反义寡核苷酸转染MKN-45细胞后,ASODN在0.25～4μmol/L的浓度范围内对MKN-45细胞均有不同程度的增殖抑制作用,作用48h后抑制率为11.2%～23.6%,且呈一定的剂量依赖性;FCM分析结果显示,转染后能诱导胃癌细胞凋亡,G0/G1期细胞增多;免疫细胞化学显示,c-myc蛋白水平明显降低,阳性表达率为(64.9±5.68)%;动物实验显示,ASODN可以抑制荷瘤小鼠肿瘤细胞的生长,肿瘤生长抑制率达41.5%。结论:c-myc基因反义寡核苷酸能明显抑制胃癌MKN-45细胞增殖、诱导细胞凋亡和下调c-myc蛋白水平。     

重组人催乳素（rhPRL）在huPBL／SCID嵌合模型中对人直肠癌的治疗效？…

通过体内实验进一步证实ｒｈＰＲＬ对体免疫功能的调节作用，以及用于过继细胞免疫治疗的可能性。     

腺病毒介导的CD／5FC自杀基因疗法对小鼠结肠腺癌的治疗？…

大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶ＣＤ可以将前体药物５ＦＣ代谢为毒性产物５ＦＵ，具有抗肿瘤作用。本课题我们观察了腺病毒介导的ＣＤ／５ＦＣ自杀基因治疗对小鼠结肠癌生长的治疗作用并探讨其作用机理。结果表明，首次，ＣＤ／５ＦＣ自杀基因疗法小鼠结肠癌ＣＴ２６体内外生长均具有显著的抑制作用，４０％的荷瘤小鼠经过治疗后长期存活；其次，我们还研究了自杀基因疗法治疗肿瘤时可能涉及的免疫机理。结果发现在以ＣＤ／５ＦＣ系统治疗结肠     

bcl-2硫代反义寡核苷酸提高肺癌细胞对Fas介导细胞毒作用的敏感性

Ｆａｓ系统介导的细胞凋亡是细胞免疫反应所致细胞毒作用的重要途径。有研究证明 ,即使小细胞肺癌细胞存在Ｆａｓ蛋白的表达 ,而且肿瘤侵袭淋巴细胞中有相应的ＦａｓＬ ,也不会诱导癌细胞发生大量凋亡[1 ] 。这可能与肺癌细胞中ｂｃｌ 2基因高表达有关 ,但目前研究尚少。我们用ｂｃｌ 2硫代反义寡核苷酸抑制小细胞肺癌细胞系的ｂｃｌ 2基因表达 ,观察激活型Ｆａｓ抗体对其凋亡的诱导作用 ,以探讨ｂｃｌ 2反义寡核苷酸用于肺癌治疗的价值。一、材料与方法1 小细胞肺癌细胞系∶细胞株ＮＣＩ Ｈ6 9,同时表达ｂｃｌ 2蛋白和Ｆａｓ蛋白。2 硫代…     

脂质体介导c-myc反义寡核苷酸对乳腺癌MCF-7细胞生物学行为的影响

目的研究c-myc反义寡核苷酸(ASODN)经脂质体LipfectAMINETM(LR)介导转染对MCF-7细胞中c-myc蛋白表达及细胞增殖、凋亡的影响。方法用四甲基偶氮唑盐法(MTT法)评价脂质体介导c-myc ASODN对细胞增殖的影响;免疫细胞化学ABC方法检测转染前后c-myc蛋白表达;流式细胞仪(FCM)定量分析细胞凋亡。结果ASODN/LR转染与正义、错义寡核苷酸相比,显著抑制MCF-7细胞增殖(P<0.01)。FCM分析结果显示,转染后可见明显细胞凋亡峰,72h相点细胞凋亡率达(28.76±2.09)%。免疫细胞化学显示c-myc蛋白水平明显降低,阳性表达率为(21.40±1.16)%。结论LR介导c-myc ASODN能明显抑制MCF-7细胞增殖、诱导细胞凋亡和下调c-myc蛋白水平。     

介导反义cyclin D1的重组腺病毒的构建及其对人肺腺癌细胞的作用 *

目的:构建介导反义cyclin D1的重组腺病毒,研究其对人肺腺癌细胞内的细胞周期、增殖和凋亡的影响.方法:将cy-clin D1基因反向克隆于穿梭质粒载体pAdCMV中,通过脂质体与pJM17共转染293细胞,经同源重组产生编码反义cyclin D1的重组腺病毒.体外观察和检测重组腺病毒感染人肺腺癌细胞系GLC-82和SPC-A-1以及人胚肺二倍体细胞2BS后,细胞周期的改变、凋亡的发生和相关基因表达的变化.结果:构建并扩增、纯化得到编码反义cyclin D1的重组腺病毒Ad-AS cyclin D1,滴度达1×10~(10)pfu/ml.肿瘤细胞感染Ad-AS cyclin D1后,RT-PCR分析显示cyclin D1基因表达下调;同时出现了明显的G1期阻滞和凋亡,凋亡相关基因bcl-2和bax基因的表达分别出现下调和上调;人胚肺二倍体细胞感染Ad-ASmyc后无上述变化.肿瘤细胞体外克隆形成能力Ad-AS cyclin D1抑制.结论:反义cyclin D1的重组腺病毒感染肿瘤细胞可使cyclin D1基因表达下调,继而诱导肿瘤细胞G1期阻滞和凋亡,使肿瘤细胞致瘤能力和肿瘤生长被抑制,但不影响正常细胞.     

肝细胞生长刺激质（HSS）介导阿霉素对人肝癌细胞裸鼠移植瘤的？…

目的为了解ＨＳＳ介导化疗药物阿霉素（ＡＤＭ）对人肝癌裸鼠移植瘤作用及其对c-met癌 基因的影响。方法裸鼠移植瘤腹腔内注射化疗药物及ＨＳＳ２周,病理学检查、免疫组化法检查c-met癌基因。结果中剂量ＡＤＭ（０．２５ug/gbw）联合ＨＳＳ抑瘤率达７２％（Ｐ<０．０１）,单用大剂量ＡＤＭ（０．５０ug/gbw）无明显作用（Ｐ>０．０５）,但不良反应明显,单用ＨＳＳ无抑瘤及刺激增生作用。裸鼠移植瘤组织表达c-met癌基因,ＨＳＳ     

免疫毒素（TCS—Hepama—1）及其与阿霉素（ADM）合用对荷人肝癌裸鼠的治？…

荷瘤裸鼠分治疗组４组，Ｔ１为ＴＣＳ－Ｈｅｐａｍａ－１＋ＡＤＭ组，Ｔ２为ＴＣＳ－Ｈｅｐａｍａ－１高剂量组，Ｔ３为ＴＣＳ－Ｈｅｏｐａｍａ－１低剂量组，Ｔ４为ＡＤＭ组，对照组也分４组，Ｃ１为生理盐水组，Ｃ２为ＴＣＳ组，Ｃ３为ＴＣＳ＋Ｈｅｐａｍａ－１组及Ｃ４为ＴＣＳ－ＮＭＩｇＧ组。     

抗clusterin 反义核酸治疗提高肺癌H460细胞放射敏感性的实验研究

目的：研究抑制clusterin的表达对肺癌H460细胞放射敏感性的影响。方法：用脂质体转染的方法将抗clusterin反义核酸转染肺癌H460细胞，以^137Cs作为放射源对肺癌细胞进行放射干预。用流式细胞仪检测抗clusterin反义核酸治疗和放射干预对肺癌细胞凋亡的影响，用MTT法和克隆形成分析方法检测抗clusterin反义核酸治疗和放射干预对肺癌细胞增殖的影响。结果：抗clusterin反义核酸特异性抑制了分泌型clusterin的表达，而对核型clusterin的表达无明显作用。单纯放射干预或单纯反义核酸转染将凋亡细胞数提高了10％，反义核酸治疗联合放射干预使肺癌H460细胞的凋亡细胞数增加了25％，和单纯放疗或单纯反义核酸转染组比较有显著性差异（P〈0．01）。MTT和体外克隆计数分析显示抗clusterin反义核酸治疗联合放疗干预显著抑制了肺癌H460细胞的增殖（P〈0．01）。结论：体外实验提示抗clusterin反义核酸治疗可以提高肺癌细胞对放射的敏感性。