肿瘤HSV-tk/GCV自杀基因治疗系统的增效策略

HSV-tk/GCV系统是目前应用最广泛的自杀基因治疗系统之一,其重要性日益上升.然而,许多缺陷严重限制了其应用广度和治疗效率.为满足更多领域的研究需要并实现临床治疗,科研人员投入了大量精力改善HSV-tk/GCV系统,增强其治疗效率.增效策略主要包括加强亲和性、提高表达水平、双自杀基因系统联合、诱发免疫系统协同作用、激活细胞周期、与其他肿瘤治疗方法相结合等.本文在阐明HSV-tk/GCV系统的自杀机理的基础上,分析了多种增效策略及效果,列举了应用领域并对未来发展作探讨.     

KDR 启动子介导CD/TK双自杀基因重组体腺病毒的高效构建

 新近以肿瘤血管为靶点的基因治疗逐渐成为肿瘤治疗的热点,其缘由为破坏供养肿瘤的毛细血管可导致其灌注区大量肿瘤细胞缺血坏死.研究表明：血管内皮细胞生长因子受体（KDR）高表达于肿瘤血管内皮细胞,而在正常组织内不表达,故KDR可作为肿瘤治疗的理想靶点.本研究从肿瘤的血管治疗出发,探讨KDR启动子驱动的双自杀基因腺病毒载体的高效构建方法,为肿瘤基因治疗的进一步深入研究奠定基础.     

腺病毒介导的KDR启动子-胸苷激酶系统对血管内皮细胞的选择性杀伤作用

目的研究腺病毒介导的KDR启动子-胸苷激酶系统对血管内皮细胞的选择性杀伤作用.方法应用PCR克隆出人KDR基因启动子序列-225 bp～+127 bp,以AdEasy system为载体,构建携带受KDR启动子或CMV启动子调控tk基因表达的2种重组腺病毒质粒pAdKDR-tk和pAdCMV-tk,在293细胞中包装、扩增后,体外感染表达KDR的脐静脉血管内皮细胞系HUVEC和不表达KDR的肝癌细胞系HepG2,并给予不同浓度的丙氧鸟苷(GCV)处理,5 d后收集存活细胞并计数.结果产生的病毒滴度均为5×109pfu/ml.在MOI为100、GCV为50μg/ml条件下,AdKDR-tk转染HUVEC后细胞生存率下降(31.49%±6.42%),AdKDR-tk转染HepG2后细胞生存率为76.57%±3.49%,而转染AdCMV-tk的2细胞系生存率均显著下降,细胞生存率分别为22.24%±3.77%(HUVEC)和26.53%±6.84%(HepG2).结论KDR基因启动子可调控HSV-tk在血管内皮细胞中特异性表达,为进一步开展靶向肿瘤血管内皮的自杀基因治疗研究奠定了基础.     

肿瘤HSV—tk／GCV自杀基因治疗系统的增效策略

HSV—tk／GCV系统是目前应用最广泛的自杀基因治疗系统之一,其重要性日益上升。然而,许多缺陷严重限制了其应用广度和治疗效率。为满足更多领域的研究需要并实现临床治疗,科研人员投入了大量精力改善HSV—tk／GCV系统,增强其治疗效率。增效策略主要包括加强亲和性、提高表达水平、双自杀基因系统联合、诱发免疫系统协同作用、激活细胞周期、与其他肿瘤治疗方法相结合等。本文在阐明HSV—tk／GCV系统的自杀机理的基础上,分析了多种增效策略及效果,列举了应用领域并对未来发展作探讨。     

腺病毒介导的HSV-TK/GCV自杀基因治疗前列腺癌的体外实验

目的 以恶性肿瘤无限增殖特性为靶点,应用人端粒酶逆转录酶启动子（hTERT）和小鼠巨细胞病毒启动子（CMV）调控携带HSV-TK基因的减毒非增殖型腺病毒,通过体外实验观察HSV-TK/GCV自杀基因疗法对前列腺癌细胞LNCaP,PC-3和人正常成纤维细胞MRC 5的治疗效果,对其抗肿瘤机制进行初步探讨。方法 将腺病毒转染细胞后,在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达情况,通过细胞病理效应（CPE）、细胞活力实验（MTT）和电泳法检测Ad-hTERT-HSV/TK选择性杀伤肿瘤细胞。结果 Ad-hTERT-EGFP仅能转染肿瘤细胞,而Ad-CMV-EGFP对正常和肿瘤细胞都能转染。细胞病理效应（CPE）发现Ad-hTERT-HSV/TK对肿瘤细胞具有很强的杀伤能力,而对正常细胞无明显杀伤作用。细胞活力实验（MTT）量化地反映出Ad-hTERT-HSV/TK选择性杀伤肿瘤细胞。电泳法检测到,在表达HSV/TK的肿瘤细胞出现细胞凋亡。结论 本实验利用由hTERT启动子调控EGFP报告基因的腺病毒,证明了腺病毒的转染效果及重组病毒Ad-hTERT-HSV/TK具有选择性肿瘤细胞杀伤能力。     

腺病毒介导的大肠杆菌CD自杀基因体内外对肿瘤杀伤作用的研究

编委会 Editorial Board名誉主编 Honorary Editor-in-chief吴孟超 Wu Meng chao(Second Military Medical University,Shanghai 200433学术顾问 Academic Advisers巴德年 Ba Denian(Chinese Academy of Medical Sciences,Beijing 100730)刘新垣 Liu Xinyuan(Shanghai Institute of Biochemistry,Chinese Academy of Sciences,Shanghai 200031)吴旻 WuMin(Cancer Institute,Chinese Academy of Medical Sciences,Beijing 100021)汤钊猷 Tang Zhaoyou(Shanghai Medical University,Shanghai 200032)主编 Editor-in-chief张友会 Zhang Youhui(Cancer Institute,Chinese Academy of Medical Sciences,Beijing,100021)副主编 Associate Editor-in-chief崔正言 Cul Zhenyan(Department of Immunology,Shandong Academy of Medical Sciences,Jinan 250001)钱振超 Qian Zhenchao(Department of Patho-physiology,Dalian Medical University,Dalian 116027)何球藻 He Qiuzao(Department of Immunology,Shanghai Medical University,Shanghai 200032)董志伟 Dong Zhiwei(Cancer Institute,Chinese Academy of Medical Sciences,Beijing 100021)常务副主编 Managing Editor-in-chief     

腺病毒及腺相关病毒介导的自杀基因疗法对肿瘤的杀伤作用

用病毒治疗肿瘤是一种日益引起人们重视的肿瘤治疗手段 [1 ] 。早在 2 0世纪5 0年代 ,人们就开始利用腺病毒 (aden-ovirus,Ad)的细胞毒性进行治疗宫颈癌的试验。自杀基因疗法的原理是将“自杀”基因转移入宿主细胞的基因组中 ,这种基因编码的酶能使非活性的前药转化为细胞毒性的代谢物 ,诱导靶细胞产生“自杀”效应 ,从而达到清除肿瘤细胞的目的。Ad及 AAV介导的基因转移系统因其独特的生物学特性得到广泛的应用。1　腺病毒及腺相关病毒腺病毒基因组为线性双链 DNA ,长36 kb,10 0 m u(m apunit)。Ad基因组由非结构性早期基因 (E1 ～ E4…     

腺病毒介导的胞嘧啶脱氨酶自杀基因联合IL—2基因疗法的肿瘤治 …

以腺病毒作为载体,将大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶基因与小鼠ＩＬ－２基因联合转移,研究其体内抗肿瘤作用及免疫机理。方法小鼠皮下接种黑色素瘤Ｂ１６Ｆ１０细胞后３天,肿瘤局部 注射表达ＩＬ－２的重要腺病毒ＡｄＩＬ－２和表达的ＣＤ的重组腺病毒ＡｄＣＤ,然后连续０天给予５－氟胞嘧啶３００ｍｇ／ｋｇ进行治疗。     

慢病毒介导YCD/5-FC自杀基因系统对白血病Jurkat细胞杀伤和旁观者效应

目的:探讨慢病毒介导的酵母菌胞嘧啶脱氨酶(yeast cytosine deaminase,YCD)自杀基因对人白血病Jurkat细胞的杀伤作用和旁观者效应。方法:制备YCD-GFP慢病毒上清,转染Jurkat细胞(即Jurkat/YCD-GFP细胞),流式细胞术检测YCD-GFP基因的表达。体外观察前体药物5-氟胞嘧啶(5-fluorocytosine,5-FC)对Jurkat/YCD-GFP细胞的杀伤情况和旁观者效应;建立Jurkat/YCD-GFP荷瘤小鼠模型,体内观察5-FC对移植瘤细胞的杀伤作用和旁观者效应。以上实验均以Jukut/GFP细胞为对照。结果:成功制备YCD-GFP慢病毒和感染YCD-GFP慢病毒的Jurkat/YCD-GFP细胞,YCD-GFP慢病毒对Jurkat细胞的感染率达96.93%。232μmol/L的5-FC作用72h可使(95.61±2.07)%的Jurkat/YCD-GFP细胞死亡,且上清中5-FC含量下降80%左右。体外实验显示,Jurkat/YCD-GFP和Jurkat细胞效靶比1∶10混合培养[(68.69±4.97)%vs(97.87±1.11)%,P<0.05)]和Transwell1∶25分层培养[(1.46±0.27)×105vs(3.00±0.16)×105,P<0.01]均存在旁观者效应。体内实验显示,YCD/5-FC自杀基因系统对Jurkat/YCD-GFP荷瘤小鼠亦具有较强的杀伤作用和旁观者效应(P<0.05)。结论:慢病毒介导的YCD/5-FC自杀基因系统对人Jurkat白血病细胞具有显著的杀伤作用和旁观者效应。     

含胞嘧啶脱氨酶基因的靶向腺病毒载体的构建及应用

目的　建立癌胚抗原 (CEA )启动子驱动的含胞嘧啶脱氨酶基因 (CD )自杀基因的腺病毒载体AdCEACD ,使CD基因只能在CEA阳性的细胞中表达。方法　采用同源重组法在人胚肾细胞株 2 93细胞中重组腺病毒 ,用点杂交、PCR法进行鉴定 ,并进行纯化和滴度测定 ,分别感染CEA阳性和CEA阴性的细胞 ,采用MTT法检测感染细胞对 5 Fc的敏感性。结果　重组腺病毒中含有CEA基因及CD基因 ,纯化后滴度可以达到 5 .0× 10 11pfu/ml ,CEA阴性的Hela细胞感染AdCMVCD后对 5 Fc很敏感 ,而感染AdCEACD后不能被 5 Fc杀伤 ,与之相反 ,CEA阳性的Lovo细胞感染AdCMVCD和AdCEACD后有相似的表达活性 ,均对5 Fc敏感。AdCEACD/ 5 Fc系统有明显的“旁观者”效应。结论　本实验建立的CEA启动子驱动的含CD自杀基因的腺病毒载体AdCEACD ,能使CD基因专一性地在CEA阳性细胞中表达 ,有助于对CEA阳性的肿瘤细胞靶向性自杀基因治疗。     

EB病毒LMP1通过NF-κB介导的HSV-tk/GCV治疗EBV相关肿瘤的研究

目的：研究EB病毒潜伏膜蛋白I(EBV-LMPl)通过活化NF-κB反式激活HIV-LTR进而启动自杀基因HSV-tk在EBV相关肿瘤治疗中的作用，为进一步开展肿瘤治疗提供科学的实验依据。方法：以鼻咽癌细胞为实验模型，将HSV-tk基因置于HIV-LTR调控序列之下，构建LMPl调控且依赖于NF-κB的HSV-tk/GCV系统，采用同位素方法检测tk活性来研究LMPl通过NF-κB调控HSV-tk转录的靶向性和表达特征，MTT方法检测在GCV处理下肿瘤细胞的生长状况。结果：成功构建受LMPl调控且依赖于NF-κB的HSV-tk表达质粒，发现其在GCV处理下，表达LMPl的肿瘤细胞的生长有显著的抑制。结论：携带有LMPl-HSV-tk细胞对GCV治疗高度敏感，显示这一肿瘤治疗系统在EBV相关肿瘤中具有一定的应用前景。     

腺病毒介导的肝癌自杀基因疗法的实验研究

本文观察了胞嘧啶脱氨酶(CD)基因/5-氟胞嘧啶(5FC)自杀基因疗法对肝癌模型的治疗作用。以CMV启动子调控CD基因的重组腺病毒载体AdexCMV.CD在体外能有效转染人肝癌细胞株SMMC-7721和HepG2,转染后的细胞体外生长能力无明显变化,对5FC的敏感性明显增高。当以AFP上游调控序列驱动CD基因的重组腺病毒载体AdexAFP.CD分别转染SMMC-7721和HepG2时,CD基因能在HepG2中表达,使HepG2对5FC的敏感性增高,但不能使SMMC-7721的生长受到5FC的抑制。[~3H]TdR掺入法观察体外旁观者效应时发现,当细胞总数中转染细胞数超过20％时,其生长明显被5FC抑制。将AdexCMV.CD直接注射入裸鼠接种SMMC-7721细胞形成的皮下肿瘤中,并全身应用5FC后,与对照组相比,肿瘤大小在开始治疗后第8天约缩小3倍,第18天约缩小4倍,以上结果表明,腺病毒介导的CD/5FC自杀基因系统能在体内、外有效地抑制肝癌的生长。以AFP上游调控序列驱动CD基因的腺病毒载体介导的基因转染能在AFP阳性的肝癌细胞中特异表达。     

自杀基因在肺癌中的研究进展

全文从自杀基因治疗体系的构成、作用机制、旁观者效应、与其他治疗联合应用、提高自杀基因转导效率及其在肺癌中的研究进展进行综述.     

卵巢上皮癌自杀基因疗法研究进展

近年来卵巢上皮癌的自杀基因疗法取得很大进展,主要体现在:由组织特异性启动子参与调控,增强基因转染的靶向性,降低对非肿瘤组织的副作用;自杀基因(如HSV-TK基因)与免疫增强基因的联合应用;自杀基因与放射治疗的联合应用;增强自杀基因表达效率的辅助方法.     

两种基于PNP/ Mep-dR 系统的新型融合自杀基因载体的构建及鉴定

 目的 构建两个新型融合自杀基因表达载体并检测其表达。方法 利用DNA重组技术制备两个融合基因PNP-TK和PNP-CD，将二者分别插入真核表达载体pcDNA3．0中，构建两个融合基因表达载体pcDNA3．0／PNP-TK和pcDNA3．0／PNP-CD；经酶切、PCR及测序鉴定各个重组体。结果 成功构建了两个新型融合基因表达载体并在肝癌细胞株HepG2中检测到二者的表达。结论 两个基于PNP／Mep-dR系统的融合自杀基因表达载体是肿瘤基因治疗中杀瘤谱广、杀伤效应强大的理想载体。     

Suicide Gene Therapy for Chemically Induced Rat Bladder Tumor Entailing Instillation of Adenoviral Vectors

The efficacy of an in vivo gene therapy protocol making use of an adenoviral vector in the treatment of bladder cancer was examined. Bladder tumors were induced in rats by oral administration of BBN (N-butyl-N-(4-hydroxybutyl)nitrosamine). Histologically, such tumors resemble those seen in human bladder cancer, and the cells can be selectively transduced using adenoviral vectors. The therapeutic protocol thus entailed instillation of an adenoviral vector containing the HSV-tk suicide gene into rat bladder followed by a regimen of intraperitoneal ganciclovir (GCV) injections. Histological examination after a short-term GCV regimen (3 days) revealed marked vacuolization of the tumor cells. Moreover, TUNEL assays showed that the cytotoxic reaction was mediated by apopto-sis. Following a long-term GCV regimen (14 days), tumor growth was significantly inhibited and glandular metaplasia was observed. This is the first report demonstrating the efficacy of in vivo suicide gene therapy in a chemically induced transitional cell carcinoma like that seen in most human bladder cancer. Intravesical instillation is already a well established clinical technique. Our findings indicate that now there is a strong potential for its incorporation into new and useful gene therapies aimed at the treatment of human bladder cancer.     

PNP 表达质粒的构建及鉴定

 目的 构建并鉴定一种新型的PNP自杀基因表达载体。方法 将PNP基因插入到pcDNA3．0中，构建PNP基因表达载体pcDNA3．0／PNP；通过酶切、PCR及测序鉴定重组体。采用脂质体介导法将pcDNA3．0／PNP转染三种肿瘤细胞株，RT—PCR检测PNP基因在各细胞株中的表达。结果 目的片段均成功插入相应的载体中，CMV启动子调控下的PNP基因在不同的肿瘤细胞株中实现了表达。结论 CMV启动子调控的PNP基因表达载体是肿瘤基因治疗中一种新型、高效的治疗栽体。