肝细胞癌细胞诱导和体外培养的大鼠肝星状细胞基因差异表达

目的 从基因水平了解肝细胞癌(HCC)内的星状细胞(HSC)与正常肝HSC的异同.方法 密度梯度离心分离HSC,用大鼠HCC细胞株CSF的条件培养基诱导HSC活化.cDNA微阵列比较静止、体外培养活化和诱导活化HSC之间22 012个基因的表达,并通过实时逆转录聚合酶链反应(real-time RT-PCR)和Western blot检测进行验证.结果 与静止HSC相比,体外培养HSC共有1672个基因差异表达,包括促炎症因子、细胞表面受体、黏附分子、信号转导分子、免疫因子等,其中1012个基因上调,660个基因下调.肿瘤诱导活化HSC有711个基因差异表达,其中420个基因上调,291个基因下调,有一部分基因表达与体外培养相同,部分基因如Raf1、Rac2、Adam17、Wnt6、MMP-9和TNF等,呈特异性表达.real-time RT-PCR和Western blot检测结果与cDNA微阵列检测结果相符.结论 HCC细胞可特异性驱动HSC的活化,诱导活化的HSC在HCC细胞的浸润和转移中可能起重要作用.瘤内活化的HSC应作为研究HSC生物学功能的标准.     

非类固醇类抗炎药NS398对肺癌H460细胞MT1-MMP表达的影响

目的:探讨非类固醇类抗炎药NS398对肺癌H460细胞增殖及其膜型基质金属蛋白酶-1(mem-brane type 1-matrix metalloproteinase,MT1-MMP)表达的影响。方法:应用MTT法检测细胞生长抑制率,免疫荧光法检测MT1-MMP蛋白质表达,酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbentassay,ELISA)检测细胞培养液中活性基质金属蛋白酶-2(matrixmetalloproteinase-2,MMP-2)的浓度。结果:NS398可抑制H460细胞的增殖及MT1-MMP蛋白质的表达,减少H460细胞培养液中活性型MMP-2的含量,并呈剂量依赖关系。结论:NS398可能通过抑制肺癌细胞MT1-MMP表达及MMP-2的激活而抑制肺癌细胞的侵袭转移。     

脂多糖对NK细胞结合与杀伤肿瘤细胞的增强作用

众所周知,NK 细胞能自发的溶解肿瘤细胞,在肿瘤免疫监视中起一定作用.但内源性抑制的机理和外源性(细菌、病毒、和肿瘤等)的刺激作用,对NK 细胞活性调节的重要性尚不了解.体外试验证明,干扰素(IFN)能增加鼠和人淋巴细胞抗肿瘤和其它靶细胞的自发性细胞毒作用。脂多糖(LPS)也能增加人类淋巴细胞对肿瘤细胞的活性.作者采用Grimm和Bonavida 改良法做了体外试验,观察大肠杆菌脂多糖对NK 细胞活性的影响。取20～40岁健康者外周血的非粘附(NA)T 淋巴细胞作效应细胞,并将NA 细胞进一步分为Fcr~ 与     

细胞因子信号抑制因子1在树突状细胞肿瘤疫苗中的作用

在肿瘤疫苗中树突状细胞(DC)是启动抗肿瘤免疫的主要辅助细胞.细胞因子信号抑制因子l (SOCS1)对细胞因子信号转导具有抑制作用.最近的研究表明,抑制DC中SOCS1的功能对提高肿瘤疫苗的抗肿瘤活性具有重要作用,并且在如何抑制其功能的方法上也取得了重大进展.     

靶向沉默核干因子对前列腺癌PC-3细胞全基因组表达谱变化的影响

目的 探讨核干因子(NS)基因在前列腺癌恶性增殖中的作用机制.方法 采用表达谱基因芯片技术,分析前列腺癌PC-3细胞NS基因表达下调后全基因组表达谱的变化,筛选与NS相互作用的差异表达基因及信号通路.采用实时荧光定量聚合酶链反应对重要的差异表达基因进行验证.结果 共筛选出219个差异表达的基因,这些基因涉及到细胞周期、细胞增殖、信号转导、细胞凋亡和细胞分化等多个方面.NS基因表达下调后主要引起周期素依赖激酶4抑制因子(INK4)家族基因(p15、p16和p18)的上调,以及cyclin D1和HDACI基因的下调,其主要作用点位于CDK4/6-cyclinD和pRb-E2F1复合体上.结论 在前列腺癌PC-3细胞中,NS基因可能主要通过抑制p15、p16和p18等INK4家族的肿瘤抑制基因的表达,从而促进肿瘤的发生和发展;NS基因是细胞周期G1/S期检查点的重要调控因子.     

Nucleostemin基因荧光真核表达载体构建及表达特性

目的:构建Nucleostemin(NS)基因真核表达载体,并在COS-7细胞中表达.方法: 设计引物在肺癌细胞株(LTEP-a-2)中扩增NS全长cDNA片段,插入pMD-18T 质粒中得pMD-18T-NS载体,并测序;再将pMD-18T-NS质粒经酶切后导入真核表达载体pcDNA3.1(+)-GFP质粒中,构建pcDNA3.1(+)-GFP-NS载体,并检测其真核表达情况.结果: 经RT-PCR扩增得到1 650 bp的全长NS cDNA片段,酶切及测序后鉴定证明pMD-18T-NS构建成功.pcDNA3.1(+)-G-FP-NS载体转染COS-7细胞经蛋白印迹及激光共聚焦显微镜检测显示,该GFP-N-S融合基因在COS-7细胞中获得较好表达.转染后见该基因定位于核仁,细胞逐渐失去黏附贴壁的特性,细胞的增殖受阻;稳定表达(4～20周)后,细胞形态发生改变,体积增大,核增多,细胞成瘤细胞样改变.结论: 成功构建pcDNA3.1(+)-GF-P-NS真核表达载体,并在COS-7细胞中有效表达;NS基因在COS-7发生瘤样改变过程中发挥着重要作用,可能与肿瘤发生密切相关.     

沉默STAT3基因对人卵巢癌化疗敏感性的影响

背景与目的:信号转导因子与转录激活因子3(STAT3)是近期研究较多的-种基因,在多种实体瘤如乳腺癌、胃癌和卵巢癌等中均有异常表达和活性增强.本研究旨在探讨STAT3短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)真核表达载体对卵巢癌细胞SKOV3化疗敏感性的作用.方法:构建STAT3基因shRNA真核表达质粒,并转染卵巢癌SKOV3细胞.试验分为SKOV3、SKOV3NX和SKOV3siRNA3组,以RT-PCR及免疫蛋白印迹法分别检测各组STAT3基因的mRNA及蛋白表达水平.细胞经20 μmol/L顺铂(DDP)作用后,MTT法检测细胞生长抑制率,流式细胞术(FCS)检测细胞凋亡率.结果:MTT法检测肿瘤细胞的生长抑制率,SKOV3组、SKOV3NS组和SKOV3siRNA组细胞抑制率分别为0.46±0.13、0.44±0.11和0.71±0.12.与SKOV3组、SKOV3NS组相比,SKOV3siRNA组细胞抑制率明显增加,差异均有统计学意义(P<0.05);而SKOV3NS组与SKOV3组比较,细胞抑制率差异无统计学意义(P>0.05).SKOV3组、SKOV3NS组和SKOV3siRNA组细胞凋亡率分别为185:4、17±3和35±4.与SKOV3组、SKOV3NS组比较,SKOV3siRNA组细胞凋亡率明显增加,差异均有统计学意义(P<0.05);而SKOV3NS组与SKOV3组比较,细胞凋亡率差异无统计学意义(P>0.05).SKOV3组、SKOV3NS组和SKOV3siRNA组细胞STAT3mRNA检测结果分别为0.50±0.08、0.48±0.07和0.31±0.09.与SKOV3组、SKOV3NS组比较,SKOV3siRNA组细胞STAT3 mRNA表达水平明显降低,差异均有统计学意义(P<0.05);而SKOV3NS组与SKOV3组细胞比较,STAT3mRNA表达水平差异无统计学意义(P>0.05).SKOV3组、SKOV3NS组和SKOV3siRNA组细胞STAT3蛋白检测结果分别为0.54±0.09、0.56±0.08和0.32±0.09.与SKOV3组、SKOV3NS组比较,SKOV3siRNA组细胞STAT3蛋白表达明显降低,差异均有统计学意义(P<0.05);而SKOV3NS组与SKOV3组比较,细胞STAT3蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05).结论:针对STAT3基因的shRNA真核表达载体能有效地抑制卵巢癌SKOV3细胞STAT3基因表达,增强其对化疗药物DDP的敏感性.     

XIAP与肿瘤化疗耐药关系的研究进展

研究发现,造成肿瘤对化疗药物耐药的重要原因是化疗药物介导的细胞凋亡指数的下降.凋亡抑制蛋白在抑制细胞凋亡中起非常重要的作用,而X连锁的凋亡抑制蛋白(XIAP)是凋亡抑制蛋白家族中作用最强的一种,并且在多种肿瘤组织和细胞中高表达.已有研究证明,其在肿瘤对化疗产生耐药的机制中起重要作用.     

骨髓间充质干细胞在异基因骨髓移植中的研究进展

骨髓间充质干细胞(MSCs)是骨髓基质细胞的前体细胞,分泌多种造血相关因子,表达多种黏附因子,同时具有免疫调节功能,在造血微环境发挥重要作用.因此,利用MSCs做滋养层,体外扩增造血干细胞(HSC),临床联合移植MSCs和HSC,提高造血重建的能力,减少或减轻移植物抗宿主病(GVHD)的发生,具有很广阔的研究前景.     

肝星状细胞和肝细胞癌的相互作用

肝星状细胞(HSC)是肝纤维化及正常肝脏中细胞外基质的主要来源.慢性肝损伤时,HSC发生表犁变化转变成肌纤维母细胞,引起肝纤维化.肝细胞癌是多因素疾病,基质中有明显星状细胞浸润.探讨肝细胞癌与HSC相互作用关系可为肝细胞癌的治疗提供新思路.     

缺氧对骨肉瘤细胞MG63核干细胞因子表达调节及其机制的探讨

目的:探讨缺氧对骨肉瘤细胞MG63核干细胞因子(NS)表达的调节及其机制。方法:反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和蛋白质印迹法检测缺氧对NS转录和蛋白表达的影响;蛋白质印迹法检测在雷帕霉素抑制缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)表达或激酶抑制剂预处理后NS在缺氧下的变化,检测NS调节的下游因子p53和活性Caspase-3蛋白表达的变化。结果:缺氧6、12和24 h后NS蛋白表达分别升高了1.26(P>0.05)、1.58(P<0.05)和1.92倍(P<0.01),NS的转录分别升高了1.33(P>0.05)、1.49(P<0.05)和1.54倍(P<0.05)。蛋白激酶B(Akt)抑制剂wortmannin逆转了缺氧对NS的上调,而细胞外信号调节激酶(ERK)抑制剂U0126、蛋白激酶A(PKA)抑制剂H89和雷帕霉素则没有逆转缺氧对NS的上调。Akt活性在缺氧6、12和24 h后分别升高了1.51(P>0.05)、1.56(P<0.05)和1.23倍(P>0.05)。尽管缺氧上调了NS的表达,但NS的下游因子p53与活性Caspase-3蛋白表达在缺氧后无明显变化。结论:缺氧通过增强Akt的活性上调了NS的表达。     

NS-398和顺铂联合作用对人肺腺癌增殖的影响及其机制初步探讨

背景与目的　近年的研究结果显示COX 2抑制剂具有抑制肿瘤生长、增强化疗药物疗效的作 用。NS 398是一种选择性COX 2抑制剂,可抑制肺癌细胞的增殖并增强化疗药物的疗效。但NS 398与顺 铂联合作用对肺腺癌细胞增殖的影响及其作用机制目前尚不清楚。本研究旨在明确NS 398对顺铂肺腺癌 细胞增殖抑制作用的影响,探讨NS 398与顺铂的联合作用对细胞凋亡以及细胞周期的影响。方法　采用 MTT比色法检测NS 398和顺铂联合作用对肺腺癌细胞增殖的影响,吖啶橙和溴化乙啶荧光染色法观察肺 腺癌细胞凋亡情况,流式细胞仪PI染色法分析两药联合处理的肺腺癌细胞凋亡率和细胞周期的改变。结果 　联合NS 398后SPC A 1细胞顺铂IC50降低百分率为43.34%～69.61%,A549细胞为48.25%～62.44%, 两药联合为轻度协同～协同作用。NS 398与顺铂联合组作用24和48小时诱导肺腺癌细胞的凋亡率显著增 高,联合组48小时和72小时的S期细胞比例亦明显增高。NS 398和顺铂联合作用诱导的肺腺癌细胞凋亡 率与S期细胞比例呈正相关(r=0.882,P=0.01)。结论　NS 398可以增强顺铂对肺腺癌细胞增殖的抑制作 用,两种药物具有协同作用。NS 398与顺铂的协同作用可能与凋亡机制有关。     

多柔比星诱导肺腺癌细胞凋亡机制的探讨

目的:探讨多柔比星(ADM)诱导肺腺癌细胞系A549细胞凋亡机制.方法:应用噻唑蓝(MTT)比色法检测ADM对A549细胞增殖抑制作用,透射电镜观察细胞形态学改变;细胞电泳仪测定A549细胞表面电荷的变化;流式细胞仪(FCM)测定A549细胞Fas、Bcl-2蛋白水平变化;比色法检测Caspase-3活性的变化.结果:ADM可抑制细胞增殖,作用24、48及72 h的IC<,50>值分别为5.2、4.8和4.2 mg/L,电镜下见到明显的凋亡细胞;细胞表面电位在4 h开始下降,4～24 h期间下降最明显,>24 h下降趋势降低;Fas蛋白表达明显上调,Bcl-2蛋白表达下降,Caspase-3活性明显增强.结论:ADM能抑制并诱导A549细胞凋亡,细胞表面电荷下降可能是ADM诱导细胞凋亡的早期事件,其作用可能与上调Fas蛋白、下调Bcl-2蛋白表达有关.     

胞内抗体技术用于以Ⅳ型胶原酶为靶点的肿瘤基因治疗

恶性肿瘤细胞的侵袭转移与肿瘤细胞及其基质诱导产生的基质金属蛋白酶(MMPs)的水平呈正相关.Ⅳ型胶原酶(包括MMR-2和MMP-9)与肿瘤转移的关系是金属蛋白酶研究的热点.研究证明,通过抑制肿瘤细胞的金属蛋白酶活性能抑制肿瘤细胞的侵袭与转移.胞内抗体(intracellular anti-body,intrabody)技术是指应用基因重组技术在非淋巴细胞内表达具有生物活性的抗体,从而特异性干扰或阻断某些生物大分子的活性或加工、分泌过程,引起细胞的一系列生物过程发生改变.它是新兴的基因治疗途径.研究证明,胞内抗体技术可以在分泌途径上、在细胞质或细胞核内阻断癌相关蛋白的活性.     

颗粒外排与Fas/Fas配体途径在人yδT细胞的肿瘤细胞毒活性中的作用

目的探讨结核杆菌抗原(Mtb-Ag)特异性活化的γδT细胞杀伤肿瘤细胞的细胞毒活性机制.方法用Mtb-Ag刺激正常人PBMC以诱导γδT细胞扩增并用磁珠阳性分选法获得高纯度γδT细胞;用RT-PCR法检测γδT细胞穿孔素、颗粒酶B和FasL mRNA的表达;用流式细胞仪检测γδT细胞表面Fas配体(FasL)分子以及几种肿瘤细胞表面Fas分子的表达;用MTT法测定γδT细胞对肿瘤细胞的细胞毒活性,观察穿孔素/颗粒酶途径的阻断剂concanamycin A(CMA)和Fas/FasL途径的抑制剂brefeldin A(BFA)对γδT细胞细胞毒活性的影响.结果经Mtb-Ag激活和扩增的γδT细胞高表达穿孔素、颗粒酶B和FasL mRNA;Mtb-Ag活化的γδT细胞中22.4%表达FasL分子;CMA能明显抑制YδT细胞对肿瘤细胞(尤其对Fas低表达的K562和PG)的杀伤,BFA能强烈抑制γδT细胞杀伤Fas高表达的Raji和A375.结论Mtb-Ag活化的γδT细胞杀伤Fas低表达的靶细胞时主要通过颗粒外排途径,杀伤Fas高表达的靶细胞时,颗粒外排和FasL均起作用.     

5,4'-二-正辛烷氧基-7-二氟亚甲基异黄酮体外抗人类乳腺癌细胞作用

目的 探讨金雀异黄素(Gen)衍生物5,4'-二-正辛烷氧基-7-二氟亚甲基异黄酮(DOdFMG)体外抗人类乳腺癌细胞的作用.方法 平皿克隆形成法检测DOdFMG对人类乳腺癌MCF-7细胞抑制生长和增生作用,琼脂糖凝胶电泳法观测DOdFMG诱导MCF-7细胞凋亡作用,Western blotting 法测定DOdFMG对MCF-7细胞PTEN、pAkt、caspase-3蛋白的表达及活性.结果 DOdFMG抑制MCF-7细胞生长,呈剂量依赖性,比Gen具有更强的抗肿瘤活性,DOdFMG能诱导MCF-7细胞凋亡,DOdFMG处理的MCF-7细胞PTEN蛋白及caspase-3蛋白表达上调,pAkt蛋白表达下调,呈时间剂量依赖性.结论 DOdFMG具有抗人类乳腺癌MCF-7细胞的作用,其机制可能与抑制PKB/Akt通路的信号传导、激活PTEN及caspase-3有关,是一种新型治疗乳腺癌的候选药物.     

人参皂甙Rg1协同诱生LAK细胞的抗瘤活性

淋巴因子激活性杀伤细胞(LAK细胞)过继输入疗法已经被证明是一种有效的抗肿瘤免疫治疗措施,但此疗法的临床应用却受到LSK细胞抗瘤活性尚低问题的困扰.我们曾经证明人参总皂甙能够增强LAK细胞杀伤新鲜急性白血病细胞的活性,本文进一步检测了人参总皂甙的单体之一人参皂甙Rg_1(Ginsenoside Rg_1)对LAK细胞抗瘤活性的影响,报告如下.     

急性髓性白血病抑制NK细胞功能的实验研究

NK细胞是肿瘤免疫监视的第一道防线,搞清肿瘤病人NK细胞活性下降的机理是提高肿瘤病人NK细胞功能的前提,也是肿瘤免疫治疗获得成功的关键。我们抽取9例急性髓性白血病(AML)病人的外周血,发现其血清和幼稚细胞(即白血病细胞)培养上清具有抑制NK细胞功能的作用,抑制作用的强弱与孵化正常NK细胞的时间相关。对照组用正常同种异体血清和正常人骨髓单个核细胞培养上清孵化,不呈现抑制作用。本实验提示血清中的抑制物质来源于白血病细胞,其抑制环节是在效靶作用之前预先作用于NK细胞。     

毛蚶抗癌蛋白对人乳腺癌细胞MCF-7的生长抑制作用

目的:从毛蚶软体部位中分离出具有一定抗癌活性的毛蚶蛋白组分,研究其对人乳腺癌细胞MCF-7的生长抑制作用。方法:以新鲜毛蚶软体部分为原材料,分离获得毛蚶抗癌蛋白组分(命名为NS);倒置相差显微镜观察不同浓度(50、100、200、400μg/mL)NS组分对MCF-7癌细胞生长的影响,将200μg/mL NS组分作用MCF-7细胞不同时间(12、24、48 h)后,Giemsa染色观察癌细胞及核形态的变化,流式细胞术检测NS组分对MCF-7细胞周期及细胞凋亡的影响,Western blot检测细胞周期及细胞凋亡相关蛋白的表达。结果:与阴性对照组比较,各浓度NS组分对人乳腺癌MCF-7细胞生长均具有明显的抑制作用(P<0.05或P<0.01);倒置相差显微镜下可见200μg/mL NS组分作用MCF-7细胞12 h后,部分细胞收缩变圆、脱落,24、48 h后细胞脱落现象更加明显;Giemsa染色发现,NS组分处理12 h后细胞出现有丝分裂相增加,继而出现多核或核碎裂等现象;流式细胞术检测发现NS组分主要引起细胞G2-M期阻滞;NS处理组凋亡率均较对照组明显升高(P均<0.01),且随着药物作用时间的延长,细胞凋亡比例逐渐增加。Western blot检测发现NS组分作用MCF-7细胞后p53及procaspase-3蛋白表达量均上调。结论:毛蚶抗癌蛋白NS组分体外对人乳腺癌MCF-7细胞的细胞毒作用主要通过引起细胞发生G2-M期阻滞、诱导细胞凋亡实现的,期间伴随p53及procaspase-3蛋白表达上调。