转染B7-1基因的人胰腺癌细胞生物学活性的研究

目的探讨B7-1基因导入人胰腺癌SW1990细胞后肿瘤细胞生物学特性的变化.方法采用RT-PCR及FACS检测B7-1基因的表达.MTT法检测病毒转化细胞体外增殖能力.以肿瘤细胞淋巴细胞混合培养检测淋巴细胞的增殖反应.结果转染后的SW1990细胞表达B7-1阳性,野生型SW1990、SW1990/pLXSN细胞与SW1990/B7-1细胞的形态、体外生长特性及MHC Ⅰ类分子表达水平均无差异.SW1990/B7-1细胞增强PBL体外增殖能力及细胞因子IL-2和IFN-γ的分泌.结论表达B7-1分子的胰腺癌细胞免疫原性增加.     

B7-1基因转染小鼠EL-4淋巴瘤诱导带瘤宿主抗瘤效应的体内研究

本文研究了IL-2、IL-4、IL-6基因转染后B16黑色素瘤细胞表面MHCⅠ类抗原及ICAM-1的表达水平,并探讨了其在CTL诱导过程中的作用.结果表明,IL-2、IL-4、IL-6基因转染的B16黑色素瘤细胞表面MHCⅠ类抗原及ICAM-1表达均高于野生型B16黑色素瘤细胞及转染对照质粒的B16黑色素瘤细胞.体内接种后,小鼠脾脏CTL活性明显增强,CTL培养体系中IFN-γ、TNF-α的分泌水平也增高.在CTL诱导体系中加入抗ICAM-1单抗可以抑制CTL的活化,加入抗MHCⅠ类分子单抗后可使CTL的活化完全阻断.这提示细胞因子基因转染可能通过使肿瘤细胞表面MHCⅠ类抗原、ICAM-1的表达增加,从而增强瘤苗的免疫原性.     

B7基因转导非免疫原性肿瘤联合应用IFN-γ的抗肿瘤研究

T细胞的有效激活需要双重信号,非免疫原性肿瘤往往存在多种信号传导缺陷,不能诱导机体的排斥反应.本研究根据上述原理探索非免疫性肿瘤的免疫治疗问题.小鼠黑色素瘤B16是高度恶性的非免疫原性肿瘤,不表达或低水平表达MHCⅠ类分子,不表达B7共刺激分子.用含B7-1基因和neo筛选基因的逆转录病毒载体导入(?)-2包     

反义IGF-I基因对人7402肝癌细胞肿瘤免疫原性影响的研究

本研究利用基因治疗方法中的反义技术,通过脂质体包裹反义胰岛素样生长因子-I(IGF-I)基因导入人7402肝癌细胞株,研究肿瘤细胞表面MHC分子的表达和其对LAK细胞杀伤的敏感性。结果表明,反义IGF-I基因转染的人7402肝癌细胞,经潮霉素筛选后,Northern Blot分析显示反义IGF-I RNA表达阳性,MHC Ⅰ类和Ⅱ类抗原的表达水平高于亲本7402细胞。LAK细胞对反义IGF-I基因转染的人7402肝癌细胞的杀伤活性明显高于亲本7402细胞组(P<0.05)。说明反义IGF-I基因转移至该肝癌细胞,可提高肿瘤的MHC Ⅰ类和Ⅱ类分子的表达,显示肿瘤细胞的免疫原性增强,并可提高LAK细胞对其杀伤的敏感性。     

抗胃癌生物活性肽对荷胃癌裸鼠酯酶同工酶代谢的影响

本文观察了协同刺激分子B7-1某因导入小鼠EL-4淋巴瘤细胞后在小鼠体内诱导的抗瘤效应.结果表明,逆转录病毒(PLXSN)载体重组的小鼠B7-1基因表达质粒导入小鼠EL-4淋巴瘤细胞,经有限稀释法克隆后获得高表达的B7-1~ EL-4细胞.B7-1~ 瘤细胞的形态,体外增殖能力及MHC Ⅰ类分子表达水平与野生型肿瘤细胞无显著差别,但致瘤性显著降低,用野生型肿瘤致死剂量接种C57BL/6小鼠完全排斥.同时免疫原性明显增强,以X-线灭活的B7-1~ 肿瘤细胞免疫后小鼠获得了对随后致死剂量野生型细胞攻击的免疫保护作用.以X-线灭活的肿瘤细胞作为瘤苗进行实验性免疫治疗,对早期(接种7天)形成的肿瘤有一定的治疗效果,但时晚期(接种14天)肿瘤.B7-1和B7-1~ 瘤细胞都未显示出明显的治疗效果.上述结果提示肿瘤细胞表达B7-1分子可有效激发机体的抗肿瘤免疫应答.     

4-1BBL联合Hsp70-肿瘤抗原肽抑制小鼠黑色素瘤肺转移

背景与目的正调节性共刺激分子表达偏低是肿瘤逃避机体免疫系统攻击的重要原因之一,增加这些分子的表达是促进抗肿瘤免疫的研究热点。小鼠黑色素瘤B16-F1细胞株是弱免疫原性癌细胞株。本研究旨在观察4-1BBL联合Hsp70-抗原肽对小鼠黑色素瘤肺转移的抑制作用,并探讨其机制。方法建立小鼠黑色素瘤肺转移模型,Hsp70-B16抗原肽小鼠皮下免疫,同时从尾静脉注射4-1BBL表达质粒p4-1BBL。于接种后第17天,解剖小鼠取肺组织,解剖显微镜下计数黑色素瘤肺转移结节的数目,并检测小鼠部分免疫学指标及肝、肾功能。结果4-1BBL联合Hsp70-B16抗原肽治疗组小鼠黑色素瘤肺转移结节数降至50±8,明显少于二者单独治疗组的500±80和450±40;联合治疗组小鼠血清IL-2和IFN-γ的分泌水平分别增加了4倍和3倍,与对照组相比均存在显著性差异(P<0.01);单独应用4-1BBL基因或与Hsp70-B16抗原肽联合应用对小鼠肝、肾的功能均无明显影响。结论表达4-1BBL联合应用Hsp70-B16抗原肽主要通过增强外周T淋巴细胞功能活性而有效抑制小鼠黑色素瘤肺转移。     

逆转录病毒载体介导的γ-干扰素基因在人肝癌细胞中的表达研究

以逆转录病毒载体(pLXSN)将人源γ-干扰素(huIFN-γ)基因转导入4种不同的人肝癌细胞株,经G418抗性筛选均获得了阳性克隆.PCR和RT-PCR结果均表明IFN-γ基因已在基因组DNA中整合并表达.IFN-γ生物活性检测结果表明,在基因修饰的4种不同个体人肝癌细胞株及同一细胞株的5种不同克隆中,分泌的IFN-γ活性有较大差别.流式细胞仪检测细胞表面HLAⅠ类分子,结果表明基因修饰肿瘤细胞表面HLAⅠ类分子表达有显著提高.同时还首次对HLAⅠ类分子专一位点A2表达进行了分析,结果表明经IFN-γ基因修饰后,A2表达增加与HLAⅠ类分子总体增加相一致,本实验为进行基因工程修饰的肿瘤疫苗研究奠定了基础.     

逆转录病毒介导的IL6/IL2融合基因转导对小鼠B16细胞粘附及转移特性的影响

为探讨细胞因子之间对肿瘤细胞修饰的协同效果及融合基因用于肿瘤细胞转染的可行性,我们采用PCR及柔性接头连接的方法,构建了含人IL6/IL2融合基因的逆转录病毒载体,将其转染小鼠B16黑色素瘤细胞,对基因转导后细胞的粘附及实验性肺转移能力进行了测定.实验结果表明,融合基因转导的细胞所分泌产生的融合蛋白具有IL-2和IL-6两种细胞因子活性.对肿瘤细胞体外粘附及转移能力的测定结果表明,经融合基因修饰的B16细胞对细胞外基质的主要成分Laminin及重组基底膜Matrigel的粘附得到抑制,同时伴有实验性转移能力降低.这一结果提示,融合基因转导可明显降低肿瘤细胞的转移能力,其机制可能与基因修饰细胞相关生物学特性的改变及其对机体的免疫刺激活性有关.     

制备抗原肽所用宫颈癌细胞培养方法的建立及HLA表达的检测

目的 探讨制备抗原肽所用宫颈癌细胞的培养方法及检测其HLA的表达。方法 先利用CO2孵箱和普通培养瓶进行培养，测定其生长状况，然后流式细胞仪检测HLA-Ⅰ、Ⅱ类分子的表达，再用免疫荧光法检测不同浓度IFN-γ对Hela细胞HLA-Ⅰ、Ⅱ类分子的表达和IFN-γ对不同培养时间Hela细胞HLA分子的表达。结果 IFN-γ能够明显提高对数生长期的Hela细胞HLA-Ⅰ类分子的表达，而IFN-γ刺激前后Hela细胞HLA-Ⅱ类分子的表达均为阴性。结论 本方法可缩短细胞培养时间，利用IFN-γ诱导细胞提高HLA-Ⅰ类分子的表达，为提供制备抗原肽所用宫颈癌细胞奠定了基础。     

MHC Ⅱ类基因瘤体内直接注射治疗小鼠肿瘤的研究

目的:许多基因治疗方案可以诱导产生抗肿瘤免疫反应,但是ex vivo的操作方式限制了其应用.本研究采用瘤体内直接注射MHC Ⅱ类基因的方法来诱导抗肿瘤免疫反应.方法:针对具有弱免疫原性的小鼠肥大细胞瘤P815和非免疫原性的小鼠黑色素瘤B16,在瘤体的原位注射MHC Ⅱ类基因,观察肿瘤的生长情况.结果:直接注射MHC Ⅱ类基因,使P815肿瘤的致瘤性明显下降,并且对第二次接种P815细胞具有抵抗能力;虽然对B16而言,仅注射MHC Ⅱ类基因无治疗效果,但与B7基因共同注射,却能够显著地抑制B16肿瘤的生长.结论:瘤体内直接注射MHC Ⅱ类基因可以用来进行肿瘤治疗.     

多发性骨髓瘤的EBV、B7-1及主动免疫治疗研究

目的探讨EB病毒在多发性骨髓瘤的病因作用及新型疫苗治疗多发性骨髓瘤的作用。方法用多聚酶链反应（PCR）的方法检测21例多发性骨髓瘤（MM）患者瘤细胞的EB病毒DNA;应用间接免疫荧光法检测瘤细胞上MHCⅠ、Ⅱ类分子及共刺激分子B7-1的表达;应用细胞因子与瘤细胞制成的疫苗主动免疫治疗4例MM患者。结果发现66.7％的MM患者瘤细胞内有EB病毒DNA;瘤细胞膜多表达MHCⅠ、Ⅱ分子及B7－1。4例MM患者用疫苗治疗后3例取得明显疗效。结论EB病毒很可能是MM的病因,与B7－1阳性的细胞及细胞因子联合制成的疫苗主动免疫治疗MM具有较明显的疗效。     

乳腺癌细胞表面MHCⅡ类抗原和共刺激分子表达的研究

目的研究乳腺癌细胞表面MHCⅡ类抗原与共刺激分子CD40、CD80(B7-1)和CD86(B7-2)的表达.方法采用流式细胞技术检测5株乳腺癌细胞MCF-7、SK-BR-3、T47D、MDA-MB-435s和ZR-75 -30表面MHCⅡ类抗原与共刺激分子CD40、CD80(B7-1)和CD86(B7-2)的表达,并与正常乳腺细胞HBL-100作比较. 结果 5株乳腺癌细胞MHCⅡ类分子表达均与正常乳腺细胞HBL-100差异有显著性(P<0.05), MCF-7细胞表达水平最低,约为HBL-100的1/5.MDA-MB-435s与ZR-75-30细胞表达水平为HBL-100的2倍,MDA-MB-435s荧光强度也比HBL-100及其他乳腺癌细胞高,但MDA-MB -435s细胞表面CD40分子表达水平最低,约为MCF-7与HBL-100 CD40分子表达水平的10%. MDA-MB-435s细胞的CD80和CD86分子表达水平与HBL-100相当(P>0.05),另4株乳腺癌细胞的CD80和CD86分子表达均比HBL-100低(P<0.05). 结论乳腺癌细胞表面MHCⅡ与共刺激分子表达异常,不同细胞表面分子的表达有所差异.乳腺癌细胞可通过这些分子表达异常而发生免疫逃逸.     

IL—6基因转导对人乳腺癌细胞系MCF—7细胞体内外生长特性的影响

为探讨ＩＬ－６基因转导对人乳腺癌细胞体内外生长特性的影响，我们构建了含人ＩＬ－６ｃＤＮＡ的逆转录病毒载体ｐＬＩＬ６ＳＮ。采用脂质体介导的方法将ｐＬＩＬ６ＳＮ导入ＭＣＦ－７细胞中，对基因转导细胞的体外生长、粘附特性及裸鼠体内的实验性转移能力进行了测定。实验结果表明，经ＩＬ－６基因修饰的ＭＣＦ－７细胞虽显示了明显的体外生长抑制，裸鼠体内实验性转移能力却获得增强。文中对其可能的影响机制进行了探讨     

阿糖胞苷增强急性白血病细胞B7分子表达及激活T细胞的免疫反应

 目的　探讨阿糖胞苷（Ara-C）对急性白血病（AL）细胞B7分子表达和激活T细胞的免疫反应。方法　用流式细胞术检测原代AL细胞B7分子的表达。同时检测Ara-C诱导HL-60细胞 B7分子的表达,进而用RT-PCR方法检测HL-60细胞B7 mRNA表达。MTT法检测诱导后HL-60细胞对人外周血单个核细胞（PBMC）的促增生作用,并用RT-PCR法测定γ-干扰素（IFN-γ）含量。结果　40例AL患者中B7-1阳性1例,B7-2阳性3例、弱阳性4例。Ara-C能显著刺激HL-60细胞 B7表达,诱导后的HL-60细胞显著刺激PBMC增生并产生IFN-γ。结论　原代AL细胞低表达B7-1和B7-2分子。在体外,Ara-C通过诱导HL-60细胞表达B7分子,刺激T淋巴细胞增生,使PBMC分泌IFN-γ增多,显著提高了白血病细胞的免疫原性。     

H-2k^b和H-2D^b基因转染后对粘连素相关的肿瘤转移等非免疫学特征的不同影响

近年来的研究表明，MHC分子除具有参与免疫识别等免疫学作用外，还具有非免疫学的作用，这种作用主要与细胞粘附尤其是恶性肿瘤的转移有关，由于肿瘤细胞内在的非免疫学作用包括肿瘤细胞的生长、同型和异型细胞粘附、表面蛋白及糖基的表达等均与MHC Ⅰ类基因有关，使肿瘤的MHC Ⅰ类基因治疗成为如何降低肿瘤致瘤性和转移能力的热门解题。     

树突状细胞介导的肿瘤基因免疫治疗

树突状细胞(dendritic cell,DC)是抗原呈递功能最强、唯一能在体内激活初始型T细胞的抗原呈递细胞(antigen presentingcells,APC),同时可以通过主要组织相容性复合体Ⅱ类分子(major histocompatibility complex classⅡmolecules,MHCⅡ)和MHCⅠ类分子途径呈递抗原,并提供充分的共刺激信号,在T细胞抗肿瘤免疫应答的启动、调控过程中起着关键的作用。用基因工程技术将肿瘤抗原基因和一些特殊的细胞因子基因导入DC,可提高DC的抗原提呈功能,并提供多个可供识别的抗原表位,克服人类白细胞抗原(human leukocyte antigen,HLA)限制性,在对肿瘤的免疫治疗中日益受到重视。     

IL-2、IFN-α和IFN-γ上调肾透明细胞癌786-0细胞B7-H1的表达

目的： 研究IL-2、IFN-α和IFN-γ对人肾透明细胞癌786-0细胞上B7-H1表达的影响。 方法： IL-2、IFN-α和IFN-γ刺激786-0细胞,RT-PCR检测刺激后786-0细胞B7-H1 mRNA的表达,免疫细胞化学、免疫荧光染色和流式细胞术检测刺激后786-0细胞中B7-H1蛋白的表达。 结果： RT-PCR检测结果显示,IL-2、IFN-α和IFN-γ组786-0细胞的B7-H1 mRNA表达量明显高于未经刺激的786-0细胞（0.75±0.06、0.68±0.05、0.95±0.08 vs 0.30±0.03,P﹤0.05或P<0.01）;免疫细胞化学和免疫荧光检测结果显示,B7-H1蛋白主要表达在786-0细胞的细胞膜上,IL-2、IFN-α和IFN-γ刺激后B7-H1表达明显上调;流式细胞术检测结果显示,IL-2、IFN-α和IFN-γ组786-0细胞的B7-H1分子表达阳性率明显高于未经刺激的786-0细胞\[（6570±326）%、（56.52±1.75）%、（84.05±3.52）% vs（20.49±1.03）%,P<0.01\]。 结论： IL-2、IFN-α和IFN-γ均上调786-0细胞B7-H1 mRNA和蛋白的表达,其中IFN-γ上调程度最高,IFN-α上调程度最低。     

表达CD40L基因的卵巢癌细胞诱导树突状细胞成熟及分泌Th1型细胞因子的作用机制

目的 探讨转染CD40L cDNA的卵巢癌细胞株OVHM对树突状细胞(DC)成熟、分化的影响及诱导其分泌细胞因子的机制.方法 采用脂质体转染法将鼠全长CD40L基因转染人小鼠卵巢癌细胞株OVHM中,用G418筛选出表达CD40L基因的抗药性克隆细胞(CD40L-OVHM).应用免疫磁珠分选并纯化小鼠骨髓DC.将DC与转染和未转染CD40L cDNA的OVHM细胞混合培养,流式细胞术检测DC细胞表面人主要组织相容性复合物Ⅰ类分子(MHC-Ⅰ)、Ⅱ类分子(MHC-Ⅱ)、CD80、CD86和CCR7的表达,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测共培养细胞中白细胞介素(IL)-12、IL-23、IL-27、IL-18、γ干扰素(IFN-γ)、Mig基因的表达.结果 DC与CD40L-OVHM细胞混合培养后可形成集落,且上调了DC细胞MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ、CD80、CD86、CCR7的共刺激分子和黏附分子的表达.在DC+CD40L-OVHM组可检测到细胞因子IL-12、IL-23、IL-27、IL-18、IFN-γ、Mig基因的表达,而在DC组、DC+OVHM组、CD40L-OVHM组、OVHM组未检测到这些基因的表达.结论 表达CD40L的卵巢癌细胞促进了DC的成熟,诱导了Th1型细胞因子的分泌,这可能是转染CD40L基因的卵巢癌细胞产生抗肿瘤效应的机制之一.     

免疫蛋白酶体在IFN-γ诱导的氧化应激中维持蛋白质的稳定

IFN-γ等促炎因子诱导的免疫蛋白酶体在MHCⅠ型抗原提呈途径中的作用已被证实。相对于普通的蛋白酶体,免疫蛋白酶体可以更有效地通过MHCⅠ类途径将抗原提呈给细胞毒性T细胞。