p16基因重组质粒的构建及其对人肺癌细胞的抑制作用

表达大肠杆菌胞嘧啶脱胺酶(CD)基因的重组腺病毒AdCD体外转染小鼠黑色素瘤细胞B16F10,结果显示转染了CD基因的B16F10细胞对5-氟胞嘧啶(5FC)的敏感性显著提高.将经AdCD/5FC系统处理的B16F10细胞上清倍比稀释后.加至野生型B16F10细胞中,发现当上清仅占6.25%时即可对野生型B16F10细胞发挥明显的杀伤作用,提示AdCD/5FC介导的旁观者效应可能是通过5FC经CD酶代谢产生的毒性产物扩散而实现的.本实验还观察了CD基因体内转染后的杀伤效果,荷瘤小鼠经注射AdCD并连续10天给予5FC治疗后,与PBS、对照病毒AdLacZ/5FC治疗小鼠比较,小鼠肿瘤生长明显受到抑制,小鼠存活期明显延长.     

CD自杀基因联合淋巴细胞趋化因子基因疗法的肿瘤治疗作用及免疫机理研究

本研究以腺病毒作为载体,将大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶(CD)基因与小鼠淋巴细胞趋化因子(Ltn)基因体内联合转染,观察了其抗肿瘤效应并分析了免疫机理.小鼠皮下接种结肠腺癌CT26细胞后3天,肿瘤局部注射表达Ltn的重组腺病毒AdLtn和表达CD的重组腺病毒AdCD,然后连续10天给予5一氟胞嘧啶(5-FC)300mg/kg进行治疗,结果表明,联合治疗组荷瘤小鼠皮下肿瘤结节的生长受到明显抑制,小鼠存活期明显长于单用AdLtn治疗组或单用AdCD/5-FC治疗组.经联合治疗后小鼠脾细胞的NK活性和对(37结肠腺癌细胞的CTL杀伤活性明显增强.瘤体细胞FACS分析结果表明,经联合基因治疗后,肿瘤组织CD4~ 、CD8~ 细胞浸润增加,结肠腺癌细胞表达H-2Kd和B7-1分子明显增加.提示经CD自杀基因和Ltn基因联合治疗后,肿瘤细胞免疫原性增加.本研究结果表明联合应用自杀基因和Ltn基因治疗可以提高机体对肿瘤细胞免疫的应答,增加机体的抗肿瘤作用,是肿瘤基因治疗中一条新的途径.     

联合自杀基因与IL-2基因转移疗法的抗肿瘤效果及其抗肿瘤免疫应答的诱导作用

单用自杀基因疗法或单用细胞因子基因疗法抗肿瘤效果不理想,本研究中我们观察了大肠杆菌胞嘧啶脱胺酶(CD)基因与白细胞介素2(IL-2)基因联合转移对荷瘤小鼠的治疗效果及其对抗肿瘤免疫的诱导作用。复制荷瘤小鼠模型后在荷瘤部位注射表达CD基因的重组腺病毒(AdCD)及表达小鼠IL-2基因的重组腺病毒(AdIL2),并连续10天、每天1次腹腔注射5氟胞嘧啶(5FC)对荷瘤小鼠进行治疗。结果表明,AdCD/5FC/AdIL2联合基因治疗能显著抑制荷瘤小鼠皮下肿瘤的生长,并明显延长其生存期(P<0.01)。联合基因治疗组小鼠肿瘤细胞发生明显的坏死,瘤内及瘤周有大量的炎性细胞浸润,瘤内CD4~ 和CD8~ T细胞明显增加,脾细胞NK和CIL杀伤活性明显高于单用AdCD/5FC、对照病毒AdLacZ/5FC或PBS组。实验结果表明,联合应用自杀基因与细胞因子基因治疗可更有效诱导机体的抗肿瘤免疫反应,从而更显著地抑制荷瘤小鼠肿瘤的生长。     

胞嘧啶脱氨酶基因联合放射对食管癌细胞株的杀伤作用

目的：观察大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶／5-氟胞嘧啶（CD／5-FC）自杀基因系统对食管癌细胞株（EC109细胞）的杀伤效应以及与放射联合应用时对食管癌肿瘤细胞协同杀伤效应。方法：采用PCR方法,从大肠杆菌基因组DNA中扩增出CD基因;构建重组真核载体pcDNA3．1-CD;用脂质体转染法转染食管癌ECl09细胞,观察CD／5-FC体系对EC109细胞的杀伤效应和杀伤时的旁观者效应以及对放射的增敏效应。结果：RTP—CR分析结果表明CD基因已转入ECl09细胞并开始转录。体外实验证实,5-FC对转CD基因后的食管癌细胞株有明显的细胞毒作用,CD／5-FC体系对肿瘤细胞对放射增敏效果明显,加5-FC及放射治疗组细胞存活曲线低于单纯加前药5-FC对照组或单纯放射对照组。结论：CD／5-FC体系对肿瘤细胞的自杀效应具有旁观者效应和放射增敏效果。     

mdr1启动子调控CD∷UPP基因对紫杉醇耐药卵巢癌细胞的杀伤作用

目的:探讨腺病毒介导的mdr1启动子调控胞嘧啶脱氨酶∷尿嘧啶磷酸核糖转移酶(CD∷UPP)融合基因联合5-氟胞嘧啶(5-FC)对紫杉醇耐药卵巢癌细胞的特异性杀伤作用。方法:扩增、纯化含有mdr1-CD∷UPP基因的重组腺病毒,转染人卵巢癌紫杉醇耐药细胞株A2780/Taxol和亲本细胞株A2780,RT-PCR检测mdr1和CD∷UPP基因的表达水平;之后加入5-FC,MTT法检测细胞抑制情况及旁观者效应,并观察腺病毒转染后裸鼠移植瘤的生长情况。结果:mdr1和CD∷UPP基因在A2780/Taxol细胞中可稳定表达,转染后A2780/Taxol组的细胞生长明显低于A2780组;转基因的A2780/Taxol细胞联合5-FC后可通过旁观者效应杀伤周围未转基因的耐药细胞;耐药组移植瘤生长明显受到抑制,肿瘤体积为(569.10±187.93)mm3,对照组肿瘤体积为(2111.98±230.82)mm3,差异有统计学意义(P<0.01)。结论:mdr1启动子可调控CD∷UPP基因特异性表达并特异性杀伤紫杉醇耐药卵巢癌细胞。     

自杀基因联合放射对食管癌细胞株的实验研究

目的自杀基因具有能将无细胞毒性的前体药物转化为有细胞毒性作用的药物而使细胞死亡,通过观察大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶/氟胞嘧啶(CD/5-FC)自杀基因系统对食管癌EC109细胞杀伤效应及与放射联合应用对食管癌肿瘤细胞协同杀伤效应。方法采用PCR方法从大肠杆菌基因组DNA中扩增出CD基因;构建重组真核载体pcDNA3.1-CD;用脂质体转染法转染EC109细胞;观察CD/5-FC体系对EC109细胞的杀伤效应和旁观者效应及对放射的增敏效应。结果RT-PCR分析结果表明CD基因已转入EC109细胞并表达。离体实验证实5-FC对转CD基因后的食管癌细胞株有明显的细胞毒作用,含5%的转基因食管癌细胞加入5-FC后的细胞存活比率为41.8%±14.2%,低于对照组的94.6%±4.3%结果(t=3.14,P<0.05);加入10%的转基因细胞的存活比率为37.8%±4.4%,低于对照组的95.6%±5.4%结果(t=9.75,P<0.01)。CD/5-FC体系对肿瘤细胞放射增敏效果明显,加前药5-FC及放射组细胞存活曲线低于单纯加前药5-FC对照组或单纯放射对照组,重复测量数据方差分析结果显示F=11.50,P<0.01;治疗组分别与5-FC对照组及单纯放射对照组相比F值分别为4.11、10.53,P值分别<0.05、0.01。结论CD/5-FC体系的旁观者效应和放射增敏效果明显。     

慢病毒载体介导的自杀基因系统YCD/5-FC对人急性淋巴细胞白血病Jurkat细胞杀伤效应的研究

背景与目的:酵母菌胞嘧啶脱氨酶(yeast cytosine deaminase,YCD)可将无毒性的抗真菌药5-氟胞嘧啶(5-fluorocytosine,5-FC)转化为细胞毒性产物氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-FU),进而阻抑DNA、RNA和蛋白质合成,引起细胞死亡.本研究中构建含YCD基因的慢病毒载体质粒,体内外观察YCD/5-FC自杀基因系统的杀伤效应.方法:应用亚克隆技术将YCD和绿色荧光蛋白基因(green fluorescence protein,GFP)连接至慢病毒空载体pFUW,构建获得pGC-FU-YCD-GFP.将3质粒系统(含包装质粒、包膜蛋白质粒和转移质粒)脂质体法共转染包装细胞293T,获得的慢病毒转染人Jurkat细胞,流式细胞仪(FACS)和Western blot检测Jurkat/YCD-GFP表达水平;加入前体药物5-FC,观察对靶细胞的杀伤情况和旁观者效应.转基因细胞接种至裸鼠前肢皮下,观察体内肿瘤杀伤情况.结果:慢病毒载体3质粒系统感染293T细胞后,获得的慢病毒滴度为1.2×108TU/mL.该病毒可高效转染人Jurkat细胞,感染率达96.93%,Western blot显示转基因细胞可分泌YCD蛋白.100 μmol/L 5-FC作用96 h可杀伤(89.37±6.57)%的Jurkat/YCD-GFP细胞.混合培养提示存在明显的旁观者效应.转基因细胞可在小鼠体内致瘤,5-FC可明显抑制肿瘤生长.结论:成功构建慢病毒载体pGC-FU-YCD-GFP,YCD/5-FC自杀基凶系统在体内外均有显著的特异性杀伤效应.     

mdr1启动子调控CD::UPP基因对紫杉醇耐药卵巢癌细胞的杀伤作用

目的探讨腺病毒介导的mdr1启动子调控胞嘧啶脱氨酶尿嘧啶磷酸核糖转移酶(CDUPP)融合基因联合5-氟胞嘧啶(5-FC)对紫杉醇耐药卵巢癌细胞的特异性杀伤作用.方法扩增、纯化含有mdr1-CDUPP基因的重组腺病毒,转染人卵巢癌紫杉醇耐药细胞株A2780/Taxol和亲本细胞株A2780,RT-PCR检测mdr1和CDUPP基因的表达水平;之后加入5-FC,MTT法检测细胞抑制情况及旁观者效应,并观察腺病毒转染后裸鼠移植瘤的生长情况.结果mdr1和CDUPP基因在A2780/Taxol细胞中可稳定表达,转染后A2780/Taxol组的细胞生长明显低于A2780组;转基因的A2780/Taxol细胞联合5-FC后可通过旁观者效应杀伤周围未转基因的耐药细胞;耐药组移植瘤生长明显受到抑制,肿瘤体积为(569.10±187.93)mm3,对照组肿瘤体积为(2 111.98±230.82)mm3,差异有统计学意义(P＜0.01).结论mdr1启动子可调控CDUPP基因特异性表达并特异性杀伤紫杉醇耐药卵巢癌细胞.     

IL-2基因与自杀基因联合转移对小鼠红白血病的治疗作用

用腺病毒作为载体,将大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶(CD)基因体外转染小鼠红白血病FBL-3细胞,结果CD基因转移后该细胞对5-氟胞嘧啶(5-FC)的敏感性提高了近1000倍,FBL-3细胞有明显的凋亡发生,且观察到明显的旁观者效应.小鼠体内接种FBL-3红白血病细胞后3天,肿瘤局部注射小鼠白细胞介素2(IL-2)基因的表达载体(Ad-IL-2)和Ad-CD腺病毒载体,然后连续10天给予5-FC 300mg/kg行治疗.结果FBL-3皮下肿瘤的生长明显受到抑制,部分小鼠肿瘤消失.联合治疗小鼠的存活期明显大于单用Ad-IL-2治疗组和单用自杀基因CD与5-FC治疗组.体内免疫功能检测表明,经小鼠自杀基因与IL-2联合基因治疗后小鼠脾细胞的CTL杀伤     

人生长抑素受体-2和大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶共表达细胞系的建立及其对5-氟胞嘧啶杀伤的敏感性

目的建立共表达人生长抑素受体2(SSTR2)和大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶(CD)的细胞系,为"自杀基因"/前体药物系统联合SSTR2介导的放射性免疫杀伤和显像治疗肿瘤提供细胞模型.方法应用反转录PCR方法从人胚肾293细胞中克隆人sstr2基因,通过基因重叠延伸拼接(SOE)结合PCR方法将CD、内部核糖体进入位点(IRES2)和sstr2连接,并构建表达载体.体外转染人乳腺癌SKBr3细胞并筛选,通过间接免疫荧光检测SSTR2的表达,并研究前体药物5-氟胞嘧啶(5-FC)对上述细胞的杀伤作用.结果成功克隆了人sstr2基因,并构建了CD和sstr2基因的双顺反子表达载体,进一步建立了稳定转染上述表达载体的SKBr3细胞系,间接免疫荧光证实了SSTR2的表达,同时建系细胞能够被前体药物5-FC高效杀伤.结论本研究建立的人乳腺癌细胞系可以共表达sstr2和CD基因,为在体内研究放射性核素标记的SSTR2配体显像和免疫杀伤,并协同CD/5-FC治疗肿瘤奠定基础.     

腺病毒介导的大肠杆菌CD自杀基因体内外对肿瘤杀伤作用的研究

编委会 Editorial Board名誉主编 Honorary Editor-in-chief吴孟超 Wu Meng chao(Second Military Medical University,Shanghai 200433学术顾问 Academic Advisers巴德年 Ba Denian(Chinese Academy of Medical Sciences,Beijing 100730)刘新垣 Liu Xinyuan(Shanghai Institute of Biochemistry,Chinese Academy of Sciences,Shanghai 200031)吴旻 WuMin(Cancer Institute,Chinese Academy of Medical Sciences,Beijing 100021)汤钊猷 Tang Zhaoyou(Shanghai Medical University,Shanghai 200032)主编 Editor-in-chief张友会 Zhang Youhui(Cancer Institute,Chinese Academy of Medical Sciences,Beijing,100021)副主编 Associate Editor-in-chief崔正言 Cul Zhenyan(Department of Immunology,Shandong Academy of Medical Sciences,Jinan 250001)钱振超 Qian Zhenchao(Department of Patho-physiology,Dalian Medical University,Dalian 116027)何球藻 He Qiuzao(Department of Immunology,Shanghai Medical University,Shanghai 200032)董志伟 Dong Zhiwei(Cancer Institute,Chinese Academy of Medical Sciences,Beijing 100021)常务副主编 Managing Editor-in-chief     

Dose of adenoviral vectors expressing interleukin-2 plays an important role in combined gene therapy with cytosine deaminase/5-fluorocytosine: preclinical consideration.

Using a syngeneic murine model, we investigated the therapeutic efficacy of combined gene therapy using adenoviral vectors expressing murine interleukin-2 (AdmIL-2) and Escherichia coli cytosine deaminase (AdCD). In a subcutaneous tumor model, tumor-bearing mice were treated with an intratumoral injection of adenoviral vectors and received an intraperitoneal administration of 5-fluorocytosine (5-FC). Only the mice treated with AdCD (2 x 10(8) pfu) and an intermediate dose of AdmIL-2 (1 x 10(6) pfu) survived significantly longer than mice treated with AdCD alone (P < 0.01). Moreover, 40% of these treated mice obtained complete remission from tumor-bearing status. The cytotoxicity of splenocytes obtained from the treated mice was related to the survival period. Tumor-specific cytotoxic T lymphocyte assay showed that the cell-mediated cytotoxic response was specific for parental tumor cells. In a hepatic metastasis model, mice treated with an intravenous administration of both AdCD (2 x 10(8) pfu) and an intermediate dose of AdmIL-2 (1 x 10(6) pfu) demonstrated the most significant reduction of metastatic foci and the longest survival following a 5-FC administration. These results suggest that gene therapy combined with AdmIL-2 and AdCD may be a promising strategy for clinical application and, in addition, that translation of combined gene therapy from murine models into the clinical setting will require careful attention to the variables of cytokine expression levels in the design of clinical trials and in the evaluation of treatment efficacy.     

腺病毒介导的胞嘧啶脱氨酶自杀基因联合IL—2基因疗法的肿瘤治 …

以腺病毒作为载体,将大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶基因与小鼠ＩＬ－２基因联合转移,研究其体内抗肿瘤作用及免疫机理。方法小鼠皮下接种黑色素瘤Ｂ１６Ｆ１０细胞后３天,肿瘤局部 注射表达ＩＬ－２的重要腺病毒ＡｄＩＬ－２和表达的ＣＤ的重组腺病毒ＡｄＣＤ,然后连续０天给予５－氟胞嘧啶３００ｍｇ／ｋｇ进行治疗。     

腺病毒介导的胞嘧啶脱氨酶自杀基因联合IL-2基因疗法的肿瘤治疗作用及免疫机理分析

目的以腺病毒作为载体，将大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶（ＣＤ）基因与小鼠ＩＬ－２基因联合转移，研究其体内抗肿瘤作用及免疫机理。方法小鼠皮下接种黑色素瘤Ｂ１６Ｆ１０细胞后３天，肿瘤局部注射表达ＩＬ－２的重组腺病毒ＡｄＩＬ－２和表达ＣＤ的重组腺病毒ＡｄＣＤ，然后连续１０天给予５－氟胞嘧啶（５－Ｆｃ）３００ｍｇ／ｋｇ进行治疗。结果联合治疗组荷瘤小鼠皮下肿瘤结节的生长明显受到抑制，小鼠存活期明显长于ＡｄＩＬ－２、ＡｄＣＤ／５－Ｆｃ、ＡｄｌａｃＺ／５－Ｆｃ或ＰＢＳ组。经联合治疗后，小鼠脾细胞的ＮＫ活性和ＣＴＬ杀伤活性明显增强；肿瘤瘤体内ＣＤ４、ＣＤ８细胞浸润增加；肿瘤细胞表达Ｈ－２Ｋｂ和Ｂ７－１分子明显增加。结论联合应用自杀基因和ＩＬ－２基因治疗，一方面可以明显抑制荷瘤小鼠肿瘤生长，另一方面可以提高机体对肿瘤细胞免疫应答，增加机体的抗肿瘤作用，是肿瘤基因治疗中一条行之有效的途径。     

Enhancement of Anti-tumor Activity of Newcastle Disease Virus by the Synergistic Effect of Cytosine Deaminase

This study was conducted to investigate enhancement of anti-tumor effects of the lentogenic Newcastledisease virus Clone30 strain (NDV rClone30) expressing cytosine deaminase (CD) gene against tumor cells andin murine groin tumor-bearing models. Cytotoxic effects of the rClone30-CD/5-FC on the HepG2 cell line wereexamined by an MTT method. Anti-tumor activity of rClone30-CD/5-FC was examined in H22 tumor-bearingmice. Compared to the rClone30-CD virus treatment alone, NDV rClone30-CD/5-FC at 0.1 and 1 MOIs exertedsignificant cytotoxic effects (P<0.05) on HepG2 cells. For treatment of H22 tumor-bearing mice, recombinantNDV was injected together with 5-FC given by either intra-tumor injection or tail vein injection. When 5-FCwas administered by intra-tumor injection, survival for the rClone30-CD/5-FC-treated mice was 4/6 for 80 daysperiod vs 1/6 , 0/6 and 0/6 for the mice treated with rClone30-CD, 5-FC and saline alone, respectively. When5-FC was given by tail vein injection, survival for the rClone30-CD/5-FC-treated mice was 3/6 vs 2/6 , 0/6 and0/6 for the mice treated with rClone30-CD, 5-FC or saline alone, respectively. In this study, NDV was used forthe first time to deliver the suicide gene for cancer therapy. Incorporation of the CD gene in the lentogenic NDVgenome together with 5-FC significantly enhances cell death of HepG2 tumor cells in vitro, decreases tumorvolume and increases survival of H22 tumor-bearing mice in vivo.     

INDUCTION OF IMMUNE RESPONSE BY IL-6 GENEMODIFIED LEUKEMIA CELLS

ＩＮＤＵＣＴＩＯＮＯＦＩＭＭＵＮＥＲＥＳＰＯＮＳＥＢＹＩＬ６ＧＥＮＥＭＯＤＩＦＩＥＤＬＥＵＫＥＭＩＡＣＥＬＬＳＣａｏＸｕｅｔａｏ曹雪涛ＧｅＬｉｎｇｆｕ葛林阜ＪｕＤｉａｎＷｅｎ鞠佃文ＹｕＹｉｚｈｉ于益芝ＴａｏＱｕｎ陶群ＺｈａｎｇＷｅｉｐｉｎｇ章卫...