含有丙型肝炎病毒核心基因表达质粒的构建及其基因免疫

目的：研究丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）核心（Ｃ）基因免疫诱生特异性免疫应答的可行性。方法：将ＨＣＶ Ｃ基因片段插入真核表达载体ｐｃＤＮＡ３质粒ＣＭＶ启动子的下游,构建真核表达载体ｐｃＤＮＡＨＣＶ－Ｃ,分别转染小鼠骨髓瘤细胞ＳＰ２／０和人肝癌细胞７７２１进行瞬时表达,用免疫荧光法和Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ检测表达产物,将重组质粒注射,ＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ－２＾ｄ）小鼠股四头肌,ＥＬＩＳＡ法检测血清中抗体产生水     

HBsAg S与GM—CSF融合基因在L929细胞中的表达

将乙肝病毒表面抗原（ＨＢｓＡｇ）主蛋白的编码基因Ｓ与人ＧＭ－ＣＳＦ基因融蛤 后,插入真核表达质粒ｐｃＤＮＡ１中,经质粒酶切鉴定及ＤＮＡ序列分析证明,目的基因插入ｐｃＤＮＡ１的ＣＭＶ启动子下降。以获得的重组质粒ｐＳＧＭ转染Ｌ９２９细胞,经ＲＴ－ＰＣＲ及细胞原位杂交证实目的基因的转录。     

丙型肝炎病毒核心蛋白基因重组质粒的构建及其在真核 …

目的：构建包含丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）核心蛋白（Ｃ）基因片段的重组真核表达载体，并在肝细胞癌细胞株７７２１细胞中表达。方法：将从ｐＢＲＴＭＨＣＶ１－３０１１质粒切下的ＨＣＶ Ｃ基因片段插入ｐｃＤＮＡ３质粒的ＣＭＶ启动子下游，构建真核表达质粒ｐｃＤＮＡＨＣＶ－Ｃ，然后，采用脂质体转染技术，转染７７２１细胞进行瞬时表达，转染细胞裂解煮沸后，通过ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ检测表达的核心抗原     

单纯疱疹病毒糖蛋白C模拟表位mgC真核表达载体的构 …

目的 为鉴定单纯疱疹病毒（ＨＳＶ）糖蛋白Ｃ（ｇＣ）一个短肽模拟表位ｍｇＣ基因作为ＨＳＶ ＤＮＡ表位疫苗的可能性,需构建含此表位的真核载体。方法 民编码该表位的单链ＤＮＡ,经不对称ＰＣＲ扩增后,克隆入真核表达载体ｐｃＤＮＡ３．１中,并在ＣＨＯ细胞中表达,用ＲＴ－ＰＣＲ法鉴定ｍＲＮＡ的表达。结果 含ｍｇＣ基因的真核表达载体在哺乳动物细胞中可以在ｍＲＮＡ水平表达外源蛋白。结论 成功地构建了ＨＳＶ ｇＶ     

应用S基因转染的Sp2/0细胞作为靶细胞研究HBV基因疫苗的细胞免疫应答

构建编码ＨＢｓＡｇ 蛋白的重组真核表达质粒ｐＣＲ３－１Ｓ作为ＨＢＶ 基因疫苗, 免疫接种Ｂａ１ｂ／ｃ 小鼠。以重组质粒ｐＣＲ３－１Ｓ转染的Ｓｐ２／０ 细胞作为靶细胞, 采用５１Ｃｒ ４ｈ 释放法, 体外检测免疫小鼠的淋巴细胞杀伤功能。结果显示, 与空载体对照组相比较, ＨＢＶ基因疫苗可诱导Ｂａｌｂ／ｃ 小鼠产生ＨＢＶ 特异性细胞毒性Ｔ 细胞应答（ Ｐ＞ ０－０５） , 提示以Ｓｐ２／０ 基因转染的细胞作为靶细胞, 检测免疫Ｂａｌｂ／ｃ 小鼠淋巴细胞的杀伤功能是可靠的。     

应用S基因转染的Sp2／0细胞作为靶细胞研究HBV基因疫？…

构建编码ＨＢｓＡｇ蛋白的重组真核表达质粒ｐＣＲ３．１－Ｓ作为ＨＢＶ基因疫苗,免疫接种Ｂａｌｂ／ｃ小鼠,以重组质粒ｐＣＲ３．１－Ｓ转染的Ｓｐ２／０细胞作为靶细胞,采用＾５１Ｃｒ ４ｈ释放法,体外检测免疫小鼠的淋巴细胞杀伤功能。结果显示,与空载体对照组相比较,ＨＢＶ基因疫苗可诱导Ｂａｌｂ／ｃ小鼠产生ＨＢＶ特生细胞毒性Ｔ细胞应答,提示以Ｓｐ２／０基因转染的细胞作为靶细胞,检测免疫Ｂａｌｂ／ｃ小鼠淋巴细胞     

丙型肝炎病毒核心蛋白基因重组质粒的构建及其在真核细胞中的表达

目的：构建包含丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）核心蛋白（Ｃ）基因片段的重组真核表达载体，并在肝细胞癌细胞株７７２１细胞中表达。方法：将从ｐＢＲＴＭＨＣＶ１－３０１１质粒切下的ＨＣＶＣ基因片段插入ｐｃＤＮＡ３质粒的ＣＭＶ启动子下游，构建真核表达质粒ｐｃＤＮＡＨＣＶ－Ｃ，然后，采用脂质体转染技术，转染７７２１细胞进行瞬时表达，转染细胞裂解煮沸后，通过ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测表达的核心抗原。结果：用限制性内切酶酶切后，片段大小与计算值相符。Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ证实，表达抗原的Ｍｒ约为２２０００。结论：ＨＣＶＣ基因能够插入ｐｃＤＮＡ３真核表达载体，并使其在真核细胞中表达，为进一步ＨＣＶ基因疫苗的研制和探讨抗ＨＣＶ感染打下了基础。     

不同载体对癌胚抗原DNA疫苗诱导小鼠产生抗-CEA水平的影响

目的　将癌胚抗原（ＣＥＡ） 基因克隆入载体ｐｃＤＮＡ３ 及ＶＲ１０１２ 中,比较两套重组质粒在体内表达并诱导小鼠产生抗ＣＥＡ 的差别。方法　通过基因工程技术构建两套ＣＥＡ 真核表达载体ｐｃＤＮＡ３ＣＥＡ 及ＶＲ１０１２ＣＥＡ,将重组质粒肌注ＢＡＬＢ／ｃ 小鼠,运用ＥＬＩＳＡ 法检测不同时间肌肉组织表达ＣＥＡ 水平及血清中抗ＣＥＡ 的产生。结果　ｐｃＤＮＡ３ＣＥＡ 在肌肉内呈低表达ＣＥＡ,最高时为０－１８ｎｇ／ ｍｇ 肌肉（ 胫前肌） ,而ＶＲ１０１２ＣＥＡ 表达量为０－９３ｎｇ／ ｍｇ 肌肉,但两重组质粒诱导小鼠产生的抗ＣＥＡ 的水平相差不大,均大于１ ２００ 。结论　ＤＮＡ 疫苗诱导的免疫反应不仅取决于其在体内的表达抗原量,质粒结构中的免疫激活序列（ＩＳＳ） 对免疫反应也起重要的调节作用。     

丙型肝炎病毒与恶性疟原虫复合多表位抗原基因在小？…

目的：探讨丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）及恶性疟原虫（Ｐｆ）复合ＤＮＡ疫苗的可行性。方法：把ＨＣＶ复合多表位抗原基因ＰＣＸ与Ｐｆ复合基因ＡＢ克隆到带ＣＭＶ启动子的真核表达载体ｐｃＤＮＡ３中,构建真核表达载体ｐｃｄＤＮＡ３／ＣＡＢ,肌肉注射免疫小鼠及家兔,检测其诱发特异性免疫应答水平及安全性。结果：小鼠及家兔分别于免疫后第６周及第８中检测到抗ＧＺ－ＰＣＸ抗体,于第１０周达最高,滴度分别为１：４００及１：３２     

AngiostatinK（1—3）基因真核表达载体的构建,鉴定和表达

构建携带人ａｎｇｉｏｓｔａｔｉｎＫ（１－３）ｃＤＮＡ的真核表达载体,并将其在体外培养的脑胶质瘤细胞中表达。方法将带有分泌信号的ａｎｇｉｏｓｔａｔｉｎＫ（１－３）ｃＤＮＡ克隆入真核表达载体ｐｃＤＮＡ３,构建ＣＭＶ启动子控制的载体ｐｃＤ－ＮＡ－ＳＡＫ（１０３）,采用酶切鉴定结果。     

真核表达单纯疱疹病毒糖蛋白模拟表位mgC及其基因免疫效果的观察

目的 鉴定单纯疱疹病毒（HSV）糖蛋白C(gC)一个短肽模拟表位mgC基因作为HSV DNA表位疫苗的可能性。方法 将mgC基因克隆入真核载体pcCNA3.1中,并在CHO细胞中表达,免疫荧光法鉴定表达效果。DNA免疫不同种属小鼠,ELISA法观察HSV gC特异结合抗体的诱生。结果 含mgC的真核载体在哺乳动物细胞中可以成功表达外源蛋白。重组载体DNA在BALB／c小鼠体内可诱导抗天然HSV gC蛋白的抗体,而在C57BL鼠体内未见明显的抗体反应。结论 成功构建了可表达模拟表位mgC的真核表达载体。证明了应用gC模拟短肽基因作为DNA免疫的基因源是可行的,但其对不同种属动物的反应性不同,提示DNA免疫还应针对不同免疫对象调整免疫策略。这一研究为HSV多表位组合多肽疫苗的研制提供了一个新的备选组份。     

单纯疱疹病毒糖蛋白C模拟表位mgC真核表达载体的构建和表达

目的为鉴定单纯疱疹病毒(HSV)糖蛋白C(gC)一个短肽模拟表位mgC基因作为HSVDNA表位疫苗的可能性 ,需构建含此表位的真核载体。方法合成编码该表位的单链DNA ,经不对称PCR扩增后 ,克隆入真核表达载体pcD NA3.1中 ,并在CHO细胞中表达。用RT PCR法鉴定mRNA的表达。结果含mgC基因的真核表达载体在哺乳动物细胞中可以在mRNA水平表达外源蛋白。结论成功地构建了HSVgC中短肽模拟表位mgC基因的真核表达载体 ,为进一步探讨该HSV模拟表位的功能奠定了基础。     

DNA immunization with a herpes simplex virus 2 bacterial artificial chromosome

Construction of a herpes simplex virus 2 (HSV-2) bacterial artificial chromosome (BAC) is described. BAC vector sequences were inserted into the thymidine kinase gene of HSV-2 by homologous recombination. DNA from cells infected with the resulting recombinant virus was transformed into E. coli, and colonies containing the HSV-2 BAC (HSV2-BAC) were isolated and analyzed for the expected genotype. HSV2-BAC DNA was infectious when transfected back into mammalian cells and the resulting virus was thymidine kinase negative. When used to immunize mice, the HSV2-BAC DNA elicited a strong HSV-2 specific antibody response that was equal to or greater than live virus immunization. Further, HSV2-BAC immunization was protective when animals were challenged with a lethal dose of virus. The utility of the HSV2-BAC for construction of recombinant virus genomes was demonstrated by elimination of the HSV-2 glycoprotein D (gD) gene. A recombinant HSV-2 BAC with the gD gene deleted was isolated and shown to be incapable of producing infectious virus following transfection unless an HSV gD gene was expressed in a complementing cell line. Immunization of mice with the HSV2 gD-BAC also elicited an HSV-2 specific antibody response and was protective. The results demonstrate the feasibility of DNA immunization with HSV-2 bacterial artificial chromosomes for replicating and nonreplicating candidate HSV-2 vaccines, as well as the utility of BAC technology for construction and maintenance of novel HSV-2 vaccines. The results further suggest that such technology will be a powerful tool for dissecting the immune response to HSV-2.     

CD80-IgG1 Fc段融合蛋白真核表达载体的构建及表达

目的：构建人CD80-IgG1 Fc段融合蛋白的真核表达载体CD80-IgG1 Fc／pcDNA3．1（＋），并住CHO细胞中进行表达。方法：应用T—A克降技术和亚克降技术，构建人CD80膜外段-IgG1 Fc段融合蛋白的真核表达载体CD80-IgG1 Fc／pcDNA3．1（＋），并将其转染人CHO细胞株并筛选，进行稳定表达：通过Western blot及ELISA法，检测融合蛋白的表达。结果：成功地构建了真核表达载体CD80-IgG1 Fc／pcDNA3．1（＋），并建立CHO细胞稳定表达株。Western blot及ELISA法检测到细胞培养上清中有融合蛋白的表达。结论：成功地构建了人CD80膜外段-IgGI Fc段融合蛋白的真核表达载体CD80-IgGI Fc／pcDNA3．1（＋），并在CHO细胞中稳定表达，为下一步抗肿瘤的研究奠定了基础。     

核小体Th表位和CTLA4Ig双基因共表达真核表达载体的构建

目的将核小体Th表位与CTLA4Ig融合基因融合，研究CTLA4Ig作为真核表达载体的可行性。方法用touchdown PCR法扩增CTLA4Ig基因，同时引入核小体Th表位（H2B14-28）。将PCR产物连接真核表达载体pcDNA3．1（＋），构建pcDNA3．1（＋）-CTLA4Ig—H2B。将表达质粒转染COS-7细胞，Western blot检测转染细胞裂解上清中融合蛋白的表达。将构建表达CTLA4Ig—H2B的减毒鼠伤寒沙门氏菌SL7207喂饲BALB／c小鼠，取脾脏进行免疫组化鉴定重组蛋白在动物体内的表达。结果酶切鉴定和基因序列测定显示重组质粒构建成功。在pcDNA3．1（＋）-CTLA4Ig—H2B质粒转染后48h细胞裂解上清中，检测到CTLA4Ig融合蛋白的表达，该蛋白能与抗人CTLA-4单抗特异结合。重组蛋白在BALB／c小鼠脾脏免疫细胞胞浆中有阳性表达。结论成功构建了能稳定表达核小体Th表位和CTLA4Ig融合基因的真核表达载体。     

小鼠MIP-1α真核表达质粒的构建及在HSV-Ⅱ核酸疫苗中的应用

目的：构建小鼠巨噬细胞炎性蛋白-1α（MIP-1α）的真核表达质粒,观察其作为分子佐剂对单纯疱疹病毒Ⅱ型（HSV-Ⅱ）DNA疫苗免疫效果的影响.方法：以LPS刺激RAW264.7细胞提取总RNA.采用RT-PCR扩增出MIP-1α基因的全部编码序列,利用克隆载体pUCm-T,将其亚克隆入pcDNA3中,构建出小鼠MIP-1α的真核表达质粒Pm;将其转染COS-7细胞,并用Boyden趋化小室法检测MIP-1α的生物学活性.然后用其与HSV-ⅡgD的DNA疫苗一起免疫BALB/c小鼠,检测免疫小鼠的特异性抗体、脾T细胞增殖反应及病毒攻击小鼠后对小鼠的保护率,观察MIP-1α对HSV-Ⅱ DNA疫苗免疫效果的影响.结果：成功构建了小鼠MIP-1α的重组真核表达质粒;免疫BALB/c小鼠发现,其作为分子佐剂可加强HSV-ⅡgDNA疫苗的免疫效果.结论：小鼠MIP-1α可作为HSV-Ⅱ gD DNA疫苗的分子佐剂,为研制新型有效的HSV-Ⅱ DNA疫苗提供一定的依据.     

mOX40-Ig的表达及其生物学活性的初步研究

目的:构建pcDNA3.1-mOX40-Ig真核表达载体,转染CHO细胞进行稳定表达,获得有生物学活性的mOX40-Ig融合蛋白.方法:RT-PCR法扩增获得hIgG1Fc段基因,构建pcDNA3.1-hIgG1Fc重组质粒并经测序证实.从本室保存的pIRES2-EGFP-mOX40重组质粒中PCR扩增mOX40胞外段,将其插入pcDNA3.1-hIgG1Fc重组质粒中构建pcDNA3.1-mOX40-Ig真核表达载体.脂质体法转染CHO细胞获得稳定表达,用RT-PCR与ELISA法检测其表达,蛋白A亲和纯化后,SDS-PAGE进行鉴定.3H-TdR掺入法研究OX40信号对B细胞的体外促增殖作用.结果:测序证实hIgG1Fc段、mOX40胞外段及mOX40-Ig基因序列正确,RT-PCR与ELISA证实mOX40-Ig的表达,SDS-PAGE证实其为mOX40-Ig融合蛋白,3H-TdR掺入法显示mOX40-Ig在体外能有效地促进B细胞增殖.结论:成功地构建pcDNA3.1-mOX40-Ig真核表达载体,并获得有生物学活性的mOX40-Ig融合蛋白的稳定表达,为进一步开展OX40相关领域的横向应用研究奠定了基础.     

单纯疱疹病毒糖蛋白D与IL-2基因共表达质粒的构建及其免疫学鉴定

目的构建含单纯疱疹病毒I型糖蛋白D（gD）全长基因和人白细胞介素2（IL-2）共表达的重组真核表达质粒IRES-gD-IL-2，并诱导其在抗原提呈细胞——树突状细胞（DCs）的表达。方法应用PCR方法分别扩增出HSV—l gD和IL-2基因，经PCR、双酶切及测序证实正确后分别插入真核表达载体IRES的上、下游。通过脂质体介导转染DCs，并进行免疫学鉴定。结果重组表达质粒IRES—gD—IL-2经PCR和酶切均出现相应长度的片段。经WesternBlot证实，HSV．1gD抗体可特异识别DCs内表达的gD蛋白。结论构建了gD与IL-2共表达的重组真核表达质粒IRES-gD-IL-2，免疫印迹鉴定证实该表达产物具有免疫学活性。     

表达单纯疱疹病毒Ⅱ型糖蛋白D的重组痘苗病毒活疫苗…

我们以前曾报道，表达单纯疱疹病毒Ⅱ型糖蛋白的重组痘苗病毒能保护被免疫小鼠抵抗致死量ＨＳＶ－２病毒的攻击。在此工作基础上，严格按人用疫苗研究要求的实验条件，成功地建立了表达ＨＳＶ－２ｇＤ的重组痘苗病毒活疫苗株，首先将经聚合酶链反应修饰的ＨＳＶ－２ｇＤ基因插入痘苗表达质粒ｐＪＳＢ１１７５，置于痘苗病毒Ｐ７．５Ｋ早／晚期启动子控制下，将同位重组质粒用Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ方法转染已受野型ＴＫ＾＋痘苗病毒天     

表达单纯疱疹病毒Ⅱ型糖蛋白D的重组痘苗病毒活疫苗株的建立

我们以前曾报道，表达单纯疱疹病毒Ⅱ型糖蛋白Ｄ（ＨＳＶ－２ｇＤ）的重组痘苗病毒（实验疫苗株）能保护被免疫小鼠抵抗致死量ＨＳＶ－２病毒的攻击。在此工作基础上，严格按人用疫苗研究要求的实验条件，成功地建立了表达ＨＳＶ－２ｇＤ的重组痘苗病毒活疫苗株。首先将经聚合酶链反应（ＰＣＲ）修饰的ＨＳＶ－２ｇＤ基因插入痘苗表达质粒ｐＪＳＢ１１７５，置于痘苗病毒Ｐ７５Ｋ早／晚期启动子控制下。将此重组质粒用Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ方法转染已受野型ＴＫ＋痘苗病毒天坛７６１株感染的人胚肺二倍体细胞。经同位素探针（３２Ｐ－ＨＳＶ－２ｇＤ）原位杂交法和３轮蚀斑纯化，筛选出基因组内整合有ＨＳＶ－２ｇＤ基因的重组痘苗病毒。斑点和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交证实，ＨＳＶ－２ｇＤ基因已插入痘苗病毒基因组内预期的ＴＫ区段，间接免疫荧光检测显示，重组病毒感染细胞后能有效地表达ＨＳＶ－２ｇＤ蛋白。