ALR基因RNA干扰慢病毒表达载体的构建及其在肝癌细胞中对ALR表达的抑制

目的：构建肝再生增强因子（augmenter of liver regeneration,ALR）基因RNA干扰（RNA interference,RNAi）慢病毒载体,并检测其对人肝癌细胞株HepG2和QGY中ALR基因表达的干扰效率。方法：针对ALR基因RNAi的有效靶序列,合成靶序列的OligoDNA,退火形成双链DNA,与经HpaⅠ和XhoⅠ双酶切线性化的GV118慢病毒载体连接产生LV-ALR-shRNA重组慢病毒载体,经转化感受态细胞后筛选出阳性克隆,并进行测序鉴定。用293T细胞包装产生慢病毒,逐孔稀释法测定病毒滴度。再将包装浓缩后的慢病毒转染人肝癌细胞株HepG2和QGY,应用Real-time PCR和Western blot方法检测HepG2和QGY细胞中ALR基因mRNA和蛋白的表达情况。结果：酶切鉴定证实成功构建了针对人ALR基因的RNAi慢病毒载体,包装并浓缩慢病毒,病毒滴度为 8E+8TU/ml。将病毒感染人肝癌细胞株HepG2和QGY后,2种细胞的干扰组ALR的mRNA表达水平较阴性对照组及空白对照组均明显下降（HepG2细胞,P干扰组vs. 阴性病毒对照组=0.004,P干扰组vs. 空白对照组=0.001;QGY细胞,P干扰组vs. 阴性病毒对照组=0.005,P干扰组vs. 空白对照组=0.001）,同样,干扰组ALR在蛋白水平的表达也明显减降低。结论：成功构建ALR基因RNAi慢病毒载体,该载体能有效干扰人肝癌细胞株HepG2和QGY中ALR基因的表达。     

肿瘤坏死因子在梗阻性黄疸并发肝功能失常中的作用

为探讨肿瘤坏死因子在梗阻性黄疸并发的肝功能失常中的作用，用ＲＩＡ法测定４５例梗阻性黄疸患者血浆肿瘤坏死因子值并观察其与血清总胆红素、谷丙转氨酶之间的关系，结果发现梗阻性黄疸患者术后肝功能失常的发生率高达３１．１％；肿瘤坏死因子水平显著升高并与血清总胆红素、谷丙转氨酶之间均有正相关关系。肿瘤坏死因子在梗阻性黄疸术后并发的肝功能失常中有重要作用。     

以miRNA为基础的RNA干扰线粒体相关基因TFAM和POLG的研究

目的通过慢病毒介导的RNA干扰技术干扰线粒体相关基因TFAM和POLG,为研究线粒体和干细胞提供资料。方法选取线粒体相关因子TFAM和POLG,分别设计三条干扰序列,构建以miRNA为基础的RNA干扰病毒载体。在293FT细胞中包装病毒液,并转染原代成纤维细胞,通过定量PCR和westernblot检测干扰效率。结果两个基因的1号序列都能有效干扰相应基因表达,POLG下调了75％,而TFAM下调了85％。结论慢病毒介导的miRNA为基础的干扰病毒载体成功干扰了TFAM和POLG基因的表达。     

外源性甲状腺素对梗阻性黄疸大鼠肝脏纤维化的保护作用研究

目的探讨外源性甲状腺素对梗阻性黄疸大鼠肝脏功能及纤维化损伤的保护作用。方法 32只SD大鼠随机分为对照组、梗黄组、高剂量干预组及低剂量干预组,梗黄组、高剂量组及低剂量组采用胆总管结扎法建立梗阻性黄疸大鼠模型,高剂量组[20μg/（kg.d）]及低剂量组[10μg/（kg.d）]采用外源性甲状腺素进行干预,4周后检测各组大鼠血清甲状腺激素水平、肝组织氧化还原酶系活力及肝纤维化指标。结果造模4周后,高剂量组、低剂量组、梗黄组血清促甲状腺激素（thyroid stimulating hormone,TSH）水平低于对照组（均P〈0.05）,高剂量组、低剂量组及对照组血清游离甲状腺素（FT3、FT4）水平高于梗黄组（均P〈0.05）。高剂量组、低剂量组肝组织匀浆超氧化物歧化酶（superoxygen dehydrogenises,SOD）水平高于梗黄组（均P〈0.05）,丙二醛（methane dicarboxylic aldehyde,MDA）、层粘连蛋白（laminin,LA）、透明质酸酶（hyaluronidase,HA）、Ⅲ型前胶原（typeⅢprocollagen,PC-Ⅲ）及Ⅳ型胶原（typeⅣcolla-gen,Ⅳ-C）水平低于梗黄组（均P〈0.05）。结论外源性甲状腺素能够改善梗阻性黄疸大鼠甲状腺激素代谢异常,减轻肝脏的氧化损伤,改善梗阻性黄疸大鼠肝脏纤维化。     

肺癌中线粒体转录因子A的表达及意义

目的探讨肺癌组织中线粒体转录因子A(mtTFA)的表达及意义。方法采用RT-PCR等方法 ,对肺癌及相应正常肺组织中mtTFA mRNA的表达进行检测和分析。结果肺癌组织mtTFA mRNA的平均表达量(mtTFA/β-actin)为3.029±1.177,而相应的正常肺组织平均表达量为2.917±0.963,前者虽略高于后者,但差异无统计学意义(P=0.221)。结论肺癌中mtTFA等线粒体DNA(mtDNA)转录、复制的调节因子的表达水平可能与mtDNA拷贝数的改变无关。     

线粒体转录复合物各因子质粒标准品的构建

目的:构建大鼠线粒体转录因子TFAM(A)、线粒体转录因子TFB1M(B1)、线粒体转录TFB2M(B2)及线粒体RNA聚合酶(POLRMT)的质粒标准品,为检测内耳细胞线粒体TFAM、TFB1M、TFB2M、POLRMT的mRNA表达水平做基础。方法:设计特异性引物和探针,提取大鼠内耳组织总mRNA逆转录成c DNA,PCR扩增、纯化目的片段,将纯化产物与p Zero Back/blunt载体重组,提取重组质粒,经测序鉴定后,用实时荧光绝对定量PCR建立标准曲线。结果:测序结果与各目的序列一致,获得良好的标准曲线(R2>0.99)。结论:成功构建了各目的基因的质粒标准品。     

自制肝保护液对梗阻性黄疸大鼠门静脉阻断所致肝细胞损伤的保护作用

目的 探讨自制肝保护液对梗阻性黄疸大鼠门静脉阻断所致肝细胞损伤的作用及对肝细胞MAPKs信号途径的影响.方法 72只Wistar系大鼠完全随机分为4组:A组:胆道再通、门静脉周围游离、切除肝尾状叶,90 min后关腹腔;B组:胆道再通、肝尾状叶分流门静脉、余肝门静脉血流阻断90 min、恢复正常门静脉血流、切除肝尾状叶,关腹;C组:B组+门静脉肝侧灌注4℃乳酸林格氏液;D组:B组+门静脉肝侧灌注4℃自制肝保护液(home-made liver solution,HMLS).术后0、6、24h获取各组大鼠组织标本.采用RT-PCR和Western blot分别测定肝组织A20 mRNA和蛋白表达,测定肝组织中p-JNK、p-ERK、p-p38、Bcl-2、Bax和Caspase-3的蛋白表达情况,TUNEL法检测肝细胞凋亡指数.结果 D组大鼠A20 mRNA和蛋白表达均明显增加(P＜0.05),p-JNK、Bax、Caspase-3蛋白表达明显下降(P＜0.05),而p-ERK、Bcl-2蛋白表达明显增加(P＜0.05).C、D组大鼠与B组相比肝细胞凋亡率明显下降(P＜0.05),其中D组下降更明显.结论 自制肝保护液经门静脉在体持续低温灌注肝脏,可以促进A20 mRNA及其蛋白的高表达,由此激活ERK信号转导通路,抑制JNK信号转导通路,反向调节线粒体途径Bcl-2/Bax蛋白平衡的逆转,降低了其下游的凋亡执行蛋白Caspase-3,从而起到抗凋亡、保护肝细胞的作用.     

阻塞性黄疸大鼠肝功能和病理形态学研究

目的:探讨胆管阻塞对大鼠肝脏功能和病理形态学的影响.方法:60只健康雄性SD大鼠随机分为6组:胆总管结扎组(BDL,n=50)和假手术组(n=10,仅游离胆总管不予结扎).BDL组据结扎持续时间又分为BDL3、BDL7、BDL14、BDL28和BDL42组(每组10只),分别于术后第3、7、14、28、42日测定血清总胆红素(TBIL)、直接胆红素(DBIL)、总胆汁酸(TBA)、谷丙转氨酶 (ALT)等肝功能指标,并观察肝脏组织病理形态.假手术组于术后7 d行上述检测.结果:与假手术组相比,BDL组大鼠肝脏功能指标明显改变,血清TBIL、DBIL、TBA值在阻塞早期(BDL3 或BDL7 组)为最高,后呈下降趋势,至实验末期(BDL42组)时仍高于对照组;ALT等酶学指标也有类似变化.BDL组大鼠的主要病理形态学改变为肝内小胆管增生和肝纤维化.结论:大鼠肝脏功能阻塞早期即发生明显的损害,机体可产生一定的代偿以改善肝功能,但持续存在的胆管阻塞最终导致肝纤维化.大鼠阻塞性黄疸期内病理形态学的改变显示其肝功能测定值并不能反映其肝脏组织的实际损害程度.     

姜黄素对阻塞性黄疸模型大鼠肝损伤的保护作用及其机制

[目的]探讨姜黄素对阻塞性黄疸大鼠肝损伤的保护作用及其机制.[方法]利用胆总管结扎法制作大鼠阻塞性黄疸模型,随机分组.姜黄素给药组每日灌胃给予姜黄素400mg/kg,于第14d采集各组血液及肝组织,用ELISA法检测血清天冬氨酸转氨酶(AST)、丙氨酸转氨酶(ALT)及总胆红素(TBIL)的水平,并利用HE染色和Western blot法观察肝组织形态学变化及α-SMA表达水平.[结果]阻塞性黄疸模型组大鼠血清中ALT,AST及TBIL水平均明显增高(P<0.05);HE染色结果显示,阻塞性黄疸模型组大鼠肝脏组织结构受损,发生肝纤维化,肝组织中α-SMA表达水平增高.姜黄素给药组ALT,AST及TBIL水平均明显低于阻塞性黄疸模型组(P<0.05),姜黄素给药组肝纤维化程度有所减轻,肝组织中α-SMA表达水平明显低于阻塞性黄疸模型组(P<0.05).[结论]姜黄素可改善阻塞性黄疸大鼠受损肝脏纤维化程度,减轻肝损伤,对肝脏有一定的保护作用.     

梗阻性黄疸大鼠肝细胞线粒体DNA损伤的定量研究

目的:对梗阻性黄疸大鼠肝细胞线粒体DNA损伤进行定量研究,探讨其与线粒体功能损伤的关系.方法:48只健康Wistar大鼠随机分为假手术组和梗阻性黄疸组,梗阻性黄疸组用胆总管双重结扎并切断制成胆道梗阻模型.Estabrook氧电极法测定线粒体呼吸控制率(RCR)和磷氧比值、Kimmich法测定肝组织内ATP含量以评价肝细胞线粒体功能,并利用荧光定量PCR方法,对各组大鼠肝细胞总mtDNA、缺失型mtDNA进行相对定量检测.结果:相对于假手术组,梗阻性黄疸组RCR、磷氧比值及肝组织ATP含量明显减少(P＜0.01),细胞内总mtDNA拷贝数减少(P＜0.01);假手术组内未检测出缺失型mtDNA,梗阻性黄疸组存在着缺失型mtDNA;随着梗阻时间的延长,梗阻性黄疸组RCR、磷氧比值及肝组织ATP含量逐步降低,总mtDAN拷贝数逐步减少(P＜0.01),缺失型mtDNA在总mtDNA中的百分比逐步增加(P＜0.01),其变化与线粒体功能损害相一致.结论:大鼠梗阻性黄疸肝细胞mtDNA损伤是导致线粒体功能损伤的重要因素.     

肠内营养对梗阻性黄疸幼鼠肝脏结构和功能的影响

目的探讨肠内营养对梗阻性黄疸幼鼠肝功能和形态结构的影响.方法将40只Wistar大鼠随机分为正常对照组、假手术组、梗阻性黄疸(OJ)组、OJ 能全素组.OJ 能全素组给予肠内营养10 d,总热量为610 kJ/(kg*d),氮量1.0 g/(kg*d).检测实验鼠肝功能指标中的丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、直接胆红素(DBil)和总胆汁酸(TBA)浓度,并对肝脏组织进行病理形态学观察.结果 OJ组、OJ 能全素组肝功能指标中AST、ALT、DBil、TBA水平显著高于正常对照组和假手术组,OJ 能全素组上述指标较OJ组显著降低.OJ 能全素组肝脏形态学改变较OJ组有所减轻.结论肠内营养有助于改善梗阻性黄疸幼鼠的肝功能指标和形态学结构.     

复方丹参注射液对梗阻性黄疸患者术后肝功能的影响

目的 探讨复方丹参注射液对梗阻性黄疸患者术后肝功能的影响。方法 将梗阻性黄疸患者随机分为对照组（n=126）及术后12h使用复方丹参注射液的治疗组（n=126）,分别测定其手术前后外周血ALT、AST、Tbil及肿瘤坏死因子（TNF）水平变化。结果 术后第24h,治疗组AST、ALT、TNF水平均显著低于对照组,差异有统计学意义（P〈0.05）,术后第72hALT,ASTTB和TNF水平显著低于对照组,差异有统计学意义（P〈0.05）。结论 术后早期使用复方丹参注射液有利于梗阻性黄疸患者术后肝功能恢复。     

阻塞性黄疸内毒素血症对肝组织血流和肝能量代谢的影响

目的：研究大白鼠阻塞性黄疸和胆汁引流减压后内毒素血症对肝组织血流和肝能量代谢的影响。方法：闭塞胆管和胆道减压后注入内毒素,测定肝血流量和肝能量代谢。结果：阻塞性黄疸时肝血流减少,能量代谢降低,注入内毒素后肝血流和能量代谢进一步降低。阻塞4周后,肝能量代谢不能恢复,结论：阻塞性黄疸时肝组织血流明显减少,影响肝能量代谢,伴有内毒素血症时,肝能量代谢显著降低。     

阻黄联合肝切除术残肝储备功能变化及TNF-α和IL-6对其影响

目的:观察阻塞性黄疸(间称阻黄)大鼠施行肝切除术后细胞因子TNF-α和IL-6的变化及其对残肝功能影响。方法:采用胆总管结扎的方法制成大鼠胆道梗阻模型,10 d后采用肝蒂结扎法切除大鼠左肝叶和中肝叶(约65%~70%)或左肝叶(约30%),同时行胆肠内引流术。术后不同时段检测剩余肝功能及TNF-α和IL-6的变化。结果:阻黄组IL-6值变化明显,IL-6和残肝功能呈V形改变,TNF-α变化不明显。结论:在阻黄患者中行肝切除术,细胞因子级联反应对残肝功能影响较大。     

茵陈多糖对梗阻性黄疸幼鼠肝脏纤维化的保护作用研究

目的探讨茵陈多糖对梗阻性黄疸幼鼠肝脏纤维化的保护作用。方法将Wistar幼龄大鼠40只随机分为四组：对照组、模型组、茵陈多糖高剂量组[0.8 mg/（kg.d）]、茵陈多糖低剂量组[0.4 mg/（kg.d）]。后三组采用胆总管结扎法制作梗阻性黄疸模型,高剂量组及低剂量组采用茵陈多糖干预,高剂量组胃灌茵陈多糖0.8 mg/（kg.d）,低剂量组胃灌茵陈多糖0.4 mg/（kg.d）,对照组、模型组胃灌生理盐水,并于术后2周分别测定各组幼鼠血清谷丙转氨酶（ala-nine aminotransferase,ALT）、谷草转氨酶（aspartate aminotransferase,AST）、总胆红素（total bilirubin,TBIL）、间接胆红素（indirect bilirubin,IBIL）、直接胆红素（ndirect bilirubin,DBIL）及肝脏组织层粘连蛋白（laminin,LA）、透明质酸酶（hyaluronidase,HA）、Ⅲ型前胶原（TypeⅢprocollagen,PC-Ⅲ）及Ⅳ型胶原（typeⅣcollagen,Ⅳ-C）表达水平,采用HE染色观察各组大鼠肝脏病例变化。结果高、低剂量组术后2周血清ALT、AST活性及TBIL、IBIL、DBIL水平低于模型组,高于对照组（P〈0.05）;低剂量组及高剂量组血清LA、HA、PC-Ⅲ及Ⅳ-C表达水平低于模型组,高于对照组（P〈0.05）,模型组肝脏组织肝小叶结构破坏,纤维组织增生明显,低剂量组及高剂量干预组肝小叶结构破坏及维组织增生较轻。结论茵陈多糖能够减轻梗阻性黄疸幼鼠肝脏病理损伤,减轻肝脏纤维化。