HIV-1型整合酶蛋白的表达、纯化及复性研究

目的对HIV-1整合酶蛋白进行原核表达、纯化以及复性研究。方法从HIV-1HXB2中PCR扩增出全长的整合酶基因，连入原核表达载体pET-30a中，得到pET-30a整合酶表达质粒。再将质粒转入大肠杆菌BL21中诱导表达，经镍柱纯化后得到整合酶蛋白。纯化后蛋白在FoldIt复性液中进行稀释复性确定最佳复性液，然后蛋白在此条件下复性并用反相柱回收，最后通过对复性蛋白抽干及再溶分析复性蛋白的物理稳定性。结果HIV-1整合酶蛋白主要以包涵体形式表达，表达量占菌体总量的10％。经镍柱纯化后蛋白的总浓度为0．9mg／ml。蛋白的最佳复性液是：Tris—Cl55mrnol／L，NaCl264mmol／L，KCl11mmol／L，Gu—HCl550mmol／L，EDTA1．1mmol／L，以及附加成分中的GSH、GSSG。复性后蛋白抽干后再溶，溶液清亮透明，SDS-PAGE可见有寡聚体状态的蛋白。结论成功构建了pET-30a整合酶表达质粒。纯化后蛋白的浓度较高。确定了最佳的蛋白复性液。并且初步检测了复性蛋白的物理稳定性。这为蛋白体外活性研究和AIDS药物研究打下了基础。     

国产HIV-1p24抗原检测试剂盒的评价

目的探讨国产的HIV-1 p24抗原检测试剂盒进行药物筛选研究的可行性。方法对国产试剂盒的使用性能与Biomerieux公司商品化的Vironostika试剂盒进行比较,评估国产试剂盒的敏感性、重复性及检验效能。结果国产试剂盒具有较高的敏感性和重复性,在体外药效学筛选实验中国产试剂盒的阳性检出率及药物评价结果与Vironostika试剂盒差异无统计学意义(P>0.05)。结论国产试剂盒具有较好的使用特性,在药物筛选中可以用国产试剂盒替代Vironostika试剂盒。     

一组靶向HIV膜蛋白的单克隆抗体的分离和功能鉴定

目的:从中国人类免疫缺陷病毒I型(human immunodeficiency virus type I, HIV-1)慢性感染者体内筛选针对膜蛋白的单克隆抗体并对其进行功能鉴定。方法:采用单细胞特异性分选的方法从HIV-1感染者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells, ...     

HIV-1 Gag抗原HLA-A*0201限制性低亲和性CTL表位预测及改造分析

初步筛选HIV-1 Gag抗原的HLA-A*0201限制性低亲和性CTL表位,预测并初步鉴定修饰后的表位与HLA-A*0201之间亲和性的变化。采用超基序、蛋白酶解预测等相结合的办法筛选HLA-A*0201限制性低亲和性CTL表位,通过氨基酸置换适当修饰,并以T2细胞株测定肽与HLA-A*0201分子的亲和力和稳定性试验来评价修饰后表位与HLA-A*0201之间亲和性。结果:筛选出3个低亲和性CTL候选表位,经修饰后的表位与HLA-A*0201之间的亲和性均有不同程度的提高。YIYKRWIIL(259-267Y1),YQANFLGKI(429-437Y1)和YTNNPPIPV(249-257Y1)与HLA-A*0201呈高亲和力结合,荧光系数(flurorescene index,FI)分别为2.68、2.54和2.35,同时肽-HLA-A*0201复合物半数解离时间(dissociation complex50,DC50)均大于8h。预测的低亲和力表位经过修饰可能会成为潜在的HLA-A*0201限制性表位。     

HIV-1整合酶酶联免疫吸附试验的建立和应用

目的：建立一种检测人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)整合酶的酶联免疫吸附试验(ELISA)方法,用于筛选HIV-1整合酶抑制剂。方法：将质粒F185K／C2280SIN1—288转化到大肠杆菌中,经IPTG诱导表达,柱亲和层析纯化,获得HIV-1整合酶融合蛋白。建立酶联免疫吸附试验(ELISA)方法。与^3H同位素标记方法比较,     

基线极高HIV-1 RNA水平对初治HIV-1感染者外周血total HIV-1 DNA的影响

目的:观察基线HIV-1 RNA > 50万copies/mL的HIV-1感染者,在高效抗反转录病毒治疗（highly active antiretroviral therapy,HAART）前后外周血totalHIV-1 DNA的变化。方法:从国家十二五科技重大专项课题中选取基线HIV-1 RNA > 50万copi...     

HIV-1 CRF01AE毒株整合酶抑制剂主要耐药突变的表型耐药性研究

目的分析整合酶(IN)区主要耐药突变对HIV-1 CRF01_AE毒株耐药的影响, 并比较与B亚型毒株的差异。方法根据美国斯坦福大学HIV耐药数据库选择7个IN区突变或联合突变(T66K、F121Y、Q148K、N155H、G118R、R263K、Q148K/N155H), 通过无缝克隆同源重组及点突变的方法引入到HIV-1 B亚型感染性克隆pNL4-3和CRF01_AE感染性克隆pGX002的IN区, 转染293T细胞包装病毒, 在MT2细胞上扩大培养并测定感染性滴度。检测4种整合酶链转移抑制剂(INSTIs), 拉替拉韦(RAL)、埃替拉韦(EVG)、多替拉韦(DTG)、比昔格韦(BIC)对14株突变病毒的半抑制浓度(IC50)及其与野生型病毒相比提高的倍数。结果成功构建携带7个IN区突变或联合突变的B亚型和CRF01_AE质粒, 包装获得14株重组病毒, 感染性滴度为104～106半数组织细胞感染剂量(TCID50)/ml, 在MT2细胞高效复制, 上清液中HIV-1 P24抗原浓度可达830～2 700 ng/ml。5...     

基于颜色判定的逆转录环介导恒温扩增技术检测HIV-1病毒

目的 建立一种基于颜色判定的用于人类免疫缺陷病毒Ⅰ型(HIV-1)检测的逆转录环介导恒温扩增(RT-LAMP)技术.方法 根据HIV-1 gag基因保守区的序列设计RT-LAMP引物,利用 已建立好的基于羟基萘酚蓝(HNB)颜色判定的RT-LAMP体系验证其灵敏度与特异性,并对实时荧光逆转录PCR(qRT-PCR)确认的临床样本进行一致性对比.结果 RT-LAMP引物特异性高,检出限为1000个拷贝RNA,对43份临床样本检测的灵敏度和特异性分别为94.6％ ～ 100％.结论 基于颜色判定的环介导恒温扩增方法摆脱了对昂贵仪器的依赖,有望应用于HIV-1感染的现场筛选,为快速检测HIV-1病毒提供了新方法和新思路.     

抗HIV-1核心抗原p24单克隆抗体的制备及特性的初步鉴定

目的 :建立分泌抗HIV 1p2 4单克隆抗体 (mAb)的杂交瘤细胞株 ,并对其特性进行初步鉴定。方法 :以纯化的基因工程制备的p2 4抗原免疫BALB/c小鼠 ,取免疫小鼠的脾细胞与Sp2 /0骨髓瘤细胞融合 ,经HAT、HT选择培养及有限稀释法进行克隆化后 ,用间接ELISA法及Dotblot对其进行筛选和特性鉴定。结果 :筛选到 2株可分泌抗HIV 1p2 4mAb的杂交瘤细胞 ,其腹水效价为 1×10 -5,亲和力为 1.7× 10 4～ 1.8×10 4mol/L ,mAb的Ig亚类均为IgG1。两株mAb与HBcAg、HCVRNA阳性血清及HIVgp4 1等均无交叉反应 ,只与HIV 1p2 4抗原阳性血清产生特异反应。结论 :成功地建立了 2株可分泌抗HIV 1p2 4mAb的杂交瘤细胞 ,为进一步研制HIV 1p2 4抗原的ELISA检测试剂盒奠定了基础     

HIV-1囊膜糖蛋白gp41三聚体结构域基因的表达及其单克隆抗体的制备

目的：表达HIV-1囊膜糖蛋白gp41三聚体结构域基因N51(L6)C46融合蛋白，并制备针对该融合蛋白的单克隆抗体(mAb)，为筛选抗HIV多肽及分析gp41表位的免疫原提供抗体工具。方法：在B121(DE3)中诱导表达NSl(L6)C46融合蛋白，经mAb NC-1鉴定后，采用小鼠腹股沟皮下NC膜免疫的方法免疫小鼠，并进行细胞融合、克隆化制备抗N51(L6)C46 mAb，用ELISA法初步鉴定其特异性位点。结果：获得了高表达的N51(L6)CA6融合蛋白，并能与识别特异性空间构象的mAb NC-1反应。用该融合蛋白免疫小鼠后，获得了6株抗N51(D5)C46的mAb，这6株mAb均特异识别兔抗N36(L6)C34抗体捕获的融合蛋白，但不与N36或C34多肽片段反应。结论：得到高效表达融合蛋白N51(L6)CA6，并呈现gp41核心结构空间构象。用此蛋白免疫小鼠得到6株特异结合gp41核心结构空间构象的单抗。     

淋巴细胞HIV-1辅受体表型剔除阻断病毒感染的研究

目的　观察HIV 1辅受体CCR5和CXCR4表型剔除对HIV 1DP1株感染的阻断作用。方法　用含有pLNCX R K S K的重组逆转录病毒液感染原代人PBLs(外周血淋巴细胞 ) ,抗体 免疫磁珠法分离筛选转化成功PBLs,流式细胞仪检测筛选效率 ;HIV 1DP1株攻击转化PBLs ,进行合胞体形成和p2 4抗原分泌检测。结果　抗 NGFR 免疫磁珠法获得了转化成功的PBLs ,流式细胞仪检测发现pLNCX R K S K转染组 77.4%的PBLsNGFR(神经生长因子受体 )标记物为阳性 ;HIV 1DP1株攻击后 ,未转染组和pLNCX转染组可以见到明显的合胞体形成 ,而在pLNCX R K S K转化PBLs没有见到合胞体形成 ;pLNCX R K S K转染组在感染后第 4、7和 10天皆可发现显著的p2 4抗原分泌抑制 ,抑制率分别为 15%、43 %、19%。结论　细胞内趋化因子通过与CCR5和CXCR4细胞内结合 ,使HIV 1两类主要辅受体难以在PBLs表面表达 ,从而可以达到阻断HIV 1病毒感染的目的     

HIV-1 P24人源化单克隆抗体的制备及鉴定

目的 通过建立新型人源化抗HIV-1 P24单克隆抗体制备技术平台,研制1～2种抗HIV-1 P24抗体.方法 使用连接P24的磁珠分选特异性分泌P24抗体的B细胞,有限稀释后,提取总mRNA,采用逆转录和巢式PCR扩增免疫球蛋白重链和轻链基因,经测序鉴定后克隆到真核表达载体Cloning vector AbVec-hIgG1、Cloning vector AbVec-hIgKappa、Cloning vector AbVec-hIgLambda中;通过瞬时转染293T细胞得到重组抗体;使用proteinA亲和层析纯化抗体.结果 成功筛选到5对抗HIV-1 P24的人源单克隆抗体基因.结论 本研究初步成功地建立了人源化HIV-1 P24单克隆抗体的制备及纯化方法,为HIV早期诊断以及筛选其他人源化单克隆抗体奠定了基础.     

HIV-1 Nef基因在THP-1细胞的表达和活性检测

目的将HIV-1 Nef基因转染THP-1细胞,获得稳定表达Nef蛋白的细胞克隆,为研究Nef对巨噬细胞生物学活性的影响奠定实验基础。方法将质粒pcDNA3.1(+)-Nef和pcDNA3.1(+()阴性对照)转染THP-1细胞,通过逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、Western blot、细胞免疫荧光等方法检测目的蛋白在真核细胞内的表达及定位,采用共转染法将荧光报告基因转染THP-1Nef和THP-13.1细胞,通过测定荧光(RLU)值来评价Nef蛋白的生物学活性。结果转染细胞经G418筛选后获得稳定表达Nef的THP-1细胞株,RT-PCR及Western blot结果表明Nef在真核细胞中成功表达,细胞免疫荧光结果显示,THP-1-Nef细胞表达的Nef蛋白主要定位于细胞质中。荧光酶标仪检测转染了HIV-1LTR-Luc和NFκB-Luc荧光报告基因的THP-1-Nef和THP-1-3.1细胞的RLU值。结论成功建立了THP-1-Nef细胞稳定表达细胞株,检测了其生物学活性,为进一步研究其作用机制实验奠定基础。     

HIV-1 gp41 C-螺旋模拟位的筛选和鉴定

目的：筛选可作为小分子先导化合物的HIV-1 gp41 C螺旋模拟位，为开发抗HIV-1早期感染的小分子药物奠定基础。方法：以源于HIV-1 gp41端的肽N36为靶，对噬菌体环七肽库进行亲和筛选。利用ELISA鉴定噬菌体阳性克隆并对其进行DNA序列分析。结果：3轮筛选后随机挑取26个噬菌体克隆，ELISA鉴定表明有16个克隆可与N36结合，将其中10个克隆DNA测序并推导氨基酸序列，每一克隆至少含有2个疏水氨基酸，其中9个克隆均有WW，7个克隆有WWH保守序列。挑选阳性噬菌体克隆No.8进一步鉴定，游离N36肽阻断No.8克隆与固相化N36结合，C34肽竞争抑制N36肽与No.8克隆结合(IC50为12.5μg/ml)。结论：表达WW保守序列的肽模拟HIV-1 gp41C螺旋与N螺旋结合，该结果为设计针对HIV介导融膜的抑制剂提供技术支持。     

抗HIV-1 gp120单克隆抗体的制备及其初步应用

目的：制备抗HIV-1 gp120单克隆抗体（mAb），并建立一种可用于检测gp120的ELISA法。方法：采用基因工程抗原HIV-1gp120免疫BALB／c小鼠，通过B细胞杂交瘤技术制备抗HIV-1gp120的mAb。用ELISA法答定mAb的Ig亚类、效价及特异性。用饱和硫酸铵（SAS）纯化mAb，并用HRP标记后建立双mAb夹心ELISA法。结果：筛选出10株稳定分泌抗HIV-1gp120 mAb的杂交瘤细胞株，9株为IgG，其中4株的腹水效价为32X10～256X10所得mAb与HIV-1gp41、HIV-1p24及HIV一2gp36Ag均无交义反应，仅与HIV-1gp120产生特异性反应。用mAb 6H9和9H12，建立了双夹心ELISA法，检测gp120抗原的灵敏度是10μg／L。结论：获得10株特异性强、效价高的机HIV-1gp120的mAb，并建立了灵敏度良好的双mAb夹心ELISA法.     

人免疫缺陷病毒1型CRF07_BC毒株准种间的重组

目的 通过研究人类免疫缺陷病毒1型（human immunodeficiency virus1，HIV-1）感染者个体内准种间的差异，探讨HIV的系统进化的发生模式。方法 从HIV-1感染者血浆中提取总RNA，通过逆转录多聚酶链反应（RT-PCR）获得HIV．1gp120全长基因，纯化后装入T载体，转化至TOP10大肠埃希菌内增殖，通过蓝白斑筛选获得阳性克隆，对所获得的目的克隆测序并分析。结果 获得同一患者的16个克隆的gp120全长基因序列，通过系统进化树分析，克隆序列均为CRF07_BC亚型，但在系统进化树上16个克隆可明显分为A、B两群，其中13个克隆属于A群，2个克隆属于B群，1个克隆（编号XPD7）位于A、B群之间，通过simplot软件的重组分析，发现XPD7克隆为A群和B群的重组株。结论 发现了我国广泛流行的HIV-1CRF07-BC毒株准种间的重组现象，准种间的重组作为HIV进化的一种有效手段将导致HIV毒株的快速进化的发生，可能更易逃脱宿主的免疫监控。     

艾滋病痴呆综合征患者HIV-1 nef基因多样性分析

目的 研究艾滋病痴呆综合征(ADC)患者体内HIV-1 nef基因变异规律,为ADC发病机制的研究提供依据.方法 提取1例ADC病例尸检标本的外周(脾)和中枢神经系统(基底核、额叶灰质、脑膜、颞叶)共5个部位组织中的基因组DNA,PCR扩增HIV-1 nef基因,与pMD19-T克隆载体连接后,蓝白斑筛选挑取阳性菌落测序,序列经BLAST分析后,每个部位取5个序列,利用Bioedit、MEGA4等生物学软件进行基因距离、系统进化树以及同义/非同义替换值(ds/dn)等分析.结果 该ADC患者感染的是HIV-1 B亚型,与标准序列HXB2比较,该病例的HIV-1 nef基因存在变异,且外周组织与中枢神经系统各组织间以及中枢神经组织不同部位的基因变异不同,相同组织来源的nef序列基因距离较小,外周和中枢的nef基因距离差异较大,该病例H IV-1 nef基因在外周和中枢神经系统变异时均受到负向选择压力.结论 ADC患者体内HIV-1 nef基因存在多样性,且不同组织部位的基因变异不同,其导致的Nef蛋白某些氨基酸位点的改变对其生物学活性的影响有待进一步研究.     

HIV-1感染者病毒学指标与血浆中白细胞介素表达水平的相关性研究

目的：探究未治疗的人类免疫缺陷病毒（HIV-1）感染者不同HIV-1 RNA或HIV-1 DNA水平组患者血浆IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、IL-16和IL-18表达差异及其与HIV-1 RNA或HIV-1 DNA的相关性。方法：选取未治疗HIV-1感染者75例,检测其HIV-1 RNA、HIV-1 DNA水平、CD4+T细胞、CD8+T细胞计数及血浆IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、IL-16和IL-18表达。结果：不同组患者血浆IL-1β、IL-6、IL-10、IL-16和IL-18表达存在明显差异,且与HIV-1 RNA、HIV-1 DNA水平相关（P<0.05）。结论：高病毒载量的未治疗HIV-1感染者血浆IL-10、IL-18表达较高,IL-1β、IL-6和IL-16表达较低,且均与病毒载量相关;高HIV-1 DNA水平的未治疗HIV-1感染者血浆IL-10、IL-18表达较高,IL-6、IL-16表达较低,且均与HIV-1 DNA水平呈正相关,说明也可能与病毒储存库相关。     

广西HIV-1重组毒株env区快速基因分型方法的建立

目的建立一种快速简便的基因分型方法，对广西HIV-1重组毒株env基因区进行亚型鉴定。方法从HIV阳性样品中提取核酸，使用HIV-1M组通用引物对env区进行第一轮扩增，第二轮则使用分别检测B′/C或C亚型和CRF01-AE亚型的二套特异性引物放入同一反应管中进行扩增，根据不同亚型扩增的目的带位置不同来判断亚型。将通用引物扩增出的所有样本均进行基因测序和系统树分析以验证结果。结果50份样本中，经基因测序和系统树分析证实CRF08-BC样本3份（6％），CRF01-AE样本43份（86％），4份（8％）样本无法确定亚型。经亚型特异性引物PCR法检测得出B′/C或C亚型样本3份（100％），CRF01-AE样本39份（90．7％），灵敏度为91．3％，特异度为100％。两种方法检测结果经差异性检验显示X^2=2．25，P〉0.05，差异无统计学意义，结果一致者占92％。与基因分析结果吻合。重复实验显示CRF08-BC平均重复性为100％（10／10），CRF01．AE为93．8％（61／65）。结论该方法是一种简便、快速、低成本，具有高度灵敏性和特异性的HIV-1毒株env基因区分型法，能够直接对广西HIV-1 CRF01-AE重组毒株进行鉴定。     

微生物学

SARS冠状病毒N蛋白单克隆抗体的制备及鉴定；含HIV-1 gp120基因的重组腺相关病毒和重组腺病毒联合免疫的研究；我国HIV-1感染者耐药突变的流行性研究；祛毒增宁胶囊治疗艾滋病的疗效观察；病毒感染相关基因微阵列的制备及其在HBV感染应答基因筛选中的应用；HIV-1B亚型gp120基因密码子优化前后免疫原性的比较；人乳头状瘤病毒协同“钴照射促进食管上皮细胞恶性转化；麻疹病毒全长cDNA构建及其感染性的研究；中国流行性乙型脑炎病毒分子生物学特性研究；在MDCK细胞上高产的乙型流行性感冒病毒株的筛选及其全基因组克隆；适用于疫苗株筛选的痘苗病毒载体的构建；肠道病毒ECHO13中国分离株的基因特征；泛紊与EB病毒核抗原1融合基因的DNA免疫研究；反转录病毒MSCV介导汉坦病毒核蛋白基因在NIH3T3细胞中整合和表达；抗HEV嵌合抗体的构建及在CHO细胞中的表达；黏液型肺炎链球菌的表型和遗传学特征；一种新型融合毒素IL15-PE△293的构建与体外活性测定。