siRNA表达载体与阳离子脂质体复合物转染HepG2.2.15细胞实验研究

目的:观察针对HBV X的siRNA表达载体pGenesil-HBV X与阳离子脂质体的复合物对HepG2.2.15细胞转染效果及其对HBVM表达的影响。方法:以pGenesil-siAFP表达载体和非转染细胞分别作非特异性序列对照组和空白对照组,用不同配比浓度pGenesil-HBV X与阳离子脂质体的复合物转染HepG2.2.15细胞,荧光显微镜下观察并计算转染阳性细胞百分率,筛选出最佳转染效率的剂量配比。于转染后24h、48h、72h采用时间分辨荧光免疫测定技术(TRFIA)检测上清液中HBsAg和HBeAg。结果:pGenesil-HBV X与阳离子脂质体复合物8μL∶2.5μg剂量配比组的平均转染率达到了(55.1±4.3)%,且不影响细胞活性;转染后48h和72h后该siRNA表达载体对HepG2.2.15细胞表达HBsAg和HBeAg抑制作用显著(P<0.05)。结论:8μL:2.5μg剂量配比组的pGenesil-HBV X与阳离子脂质体复合物是最佳的转染剂量配比,能有效抑制HepG2.2.15细胞表达HBsAg和HBeAg。     

影响人脐静脉内皮细胞脂质体转染pReceiver-M29-PRKCB1效率因素的探讨

目的:探讨影响人脐静脉内皮细胞转染效率的因素,为优化外源基因在其中的表达提供实验依据.方法:选用适于转染人脐静脉内皮细胞的脂质体lipofectin,采用不同的转染条件:脂质体和DNA的用量;铺板密度;细胞与DNA-脂质体复合物孵育时间转染内皮细胞.荧光显微镜、流式细胞仪测定不同转染参数下的转染效率.结果:(1)24孔板中,铺板密度大于2×104个/孔和孵育时间超过4h,反而使转染效率下降.(2)随质粒质量增加转染效率逐渐上升,达峰后质粒质量的增加并不能显著增高转染效率.(3)特染效率达峰前,随着脂质体用量的增加,转染效率增高;达峰后,脂质体用量的增加,转染效率反降低.当DNA(μg)和脂质体(μl]的用量比为1∶6～1∶8时,获得最高的转染效率:18.62%.结论:采用优化后的转染参数在人脐静脉内皮细胞转染中可获得较优的转染效率.     

Lipofectamine 2000和jetPRIME~（TM）对A549细胞转染效率及毒性的比较研究

目的评价及比较两种转染试剂Lipofectamine 2000和jetPRIMETM对A549细胞的转染效率及毒性。方法分别利用Lipofectamine 2000和jetPRIMETM将pEGFP-N1质粒转染A549细胞,转染24h后荧光显微镜观察增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein,EGFP）的表达,计算转染效率,四甲基偶氮唑盐比色法[3-（4.5-dimethylthiazol-2-yl）-2,5-diphenyl tetrazolium bromide,MTT]检测两种转染试剂对A549细胞的毒性。结果质粒与Lipofectamine 2000比例（μg/μl）在1∶2至1∶3.5之间变化时,Lipofectamine 2000转染效率变化不明显,细胞毒性随着Li-pofectamine 2000用量增多而增大,质粒与Lipofectamine 2000比例（μg/μl）为1∶2.5时转染率最高,达（50.6±4.9）%,细胞存活率为（89.2±9.1）%;质粒与jetPRIMETM比例（μg/μl）在1∶1至1∶4之间变化时,jetPRIMETM转染效率变化明显,而细胞毒性变化不明显,质粒与jetPRIMETM比例（μg/μl）为1∶2时转染率最高,为（30.6±2.8）%,细胞存活率为（100.6±4.8）%;两者最大转染率及相应的细胞存活率均有统计学差异（P〈0.01,P〈0.05）。结论 Lipofectamine 2000转染A549细胞的效率高于jetPRIMETM,细胞毒性亦强于jetPRIMETM。     

FuGNE6与pGPu6/GFP/neo-GPC3-iRNA质粒不同比率对HepG2细胞转染效率的影响

目的探讨转染试剂FuGNE6与pGPu6/GFP/neo-GPC3-iRNA质粒不同比率对HepG2细胞转染效率的影响,并寻找最佳的转染比例。方法采用转染试剂FuGNE6(以6μl为例)与GPC3-iRNA质粒(μg)比率分别为6∶0.5,6∶1,6∶1.5,6∶2,6∶4,6∶6及GPC3-iRNA量固定1μg(以此为例),转染试剂与GPC3-iRNA质粒(μg)比率分别为2∶1,4∶1,6∶1,8∶1,10∶1进行转染。分别用荧光显微镜、流式细胞仪及PI染色实验观察细胞转染效率及48h细胞存活率。结果FuGNE6固定为6μl时,质粒用量从0.5-2μg转化效率逐步增高,超过2μg后转染效率反而大大降低,各比例组在48h细胞存活率都在95%以上;质粒量固定为1μg时,随转染试剂增加转化效率不断增大,超过6∶1时,随转染试剂增加,48h细胞存活率也逐渐下降。结论FuGNE6与GPC3-iRNA比例为6∶1.5时转化效率最大,且细胞存活率高。     

聚乙烯亚胺-乳酸羟基乙酸共聚物阳离子纳米粒介导宫颈癌细胞基因转染效率的研究

目的 优化聚乙烯亚胺-乳酸羟基乙酸共聚物(PEI-PLGA)阳离子纳米粒介导的癌细胞基因转染效率.方法 用二步法制备报告基因质粒pCMVβ/PEI-PLA纳米粒复合物,透射电镜观察粒子形态,Zeta粒度仪测定粒径和表面电荷.以pCMVβ基因质粒与纳米粒的比(N/P)、转染时间和基因转染剂量为条件,转染效率为指标,正交设计法优化pCMVβ/PEI-PLGA纳米粒复合物的转染效率.结果 pCMVβ/PEI-PLGA纳米粒复合物呈单分散球形,N/P比为10:1,Zeta电位为+16.5 mV,平均粒径为217 nm,基因质粒剂量为每孔3 μg时,纳米粒复合物的转染效率最高为16.35%.结论 PEI-PLGA纳米粒可有效将报告基因质粒转移入宫颈癌细胞,优化实验条件可提高转染效率.     

Nucleostemin基因对人食管癌Eca-109细胞株转染条件优化的探索

目的:探讨PCDNA4/C-NS-silencer质粒载体用于人食管癌Eca-109细胞株转染的最优化条件.方法:用RT-PCR方法检测基因的转染效率,分别研究不同DNA量/脂质体体积比值、不同质粒DNA-转染试剂复合物与靶细胞作用时间等情况对转染效果的影响.结果:当DNA量/脂质体体积比值在1:8,质粒DNA-转染试剂复合物与靶细胞作用时间为8h时细胞转染效率最高.结论:成功建立了NS基因转染人食管癌Eca-109细胞株转染的最优化条件.     

壳糖体外介导血管平滑肌细胞内皮型一氧化氮合酶基因转移的初步研究

目的探讨壳糖作为非病毒载体介导质粒体外转染哺乳动物平滑肌细胞的可行性、转染效率及影响转染效率的因素。方法用壳糖包被携带绿色荧光蛋白(GFP)基因和内皮型一氧化氮合酶(eNOS)基因的质粒PAdTrack-CMV-eNOS,制备壳糖/质粒复合体(CPC-eNOS),在不同条件下将其和Wistar大鼠血管平滑肌细胞孵育,通过检测靶细胞是否表达GFP和eNOS,评价壳糖介导质粒转染的效率。并以裸质粒PAdTrack-CMV- eNOS和重组腺病毒表达载体Ad-eNOS分别作为对照。结果荧光显微镜下472nm观察,CPC-eNOS和重组腺病毒表达载体Ad-eNOS孵育的血管平滑肌细胞均观察到绿色荧光,Western印迹法检测均有eNOS蛋白表达,但裸质粒PAdTrack-CMV-eNOS组均为阴性。CPC-eNOS中氨基/磷酸基比值(N/P比值)为5、pH值为7.0时,对平滑肌细胞的转染效率最高。结论CPC-eNOS能够体外介导转染哺乳动物的血管平滑肌细胞。转染效率与CPC-eNOS的N/P比值和转染介质pH值有关。     

聚乙烯亚胺/DNA复合物处方工艺优化及体外转染效率

目的:考察聚乙烯亚胺(PEI)相对分子质量、氮磷比(N/P比)、溶剂、离子强度等对PEI/DNA复合物形成、表面性质以及细胞转染效率的影响。方法:制备不同相对分子质量PEI/DNA复合物,通过凝胶电泳和紫外吸收检测确定PEI与DNA的复合能力(N/P比),测定不同溶剂、离子强度下的粒径和Zeta电位,考察复合物在HepG2细胞中的转染情况。结果:PEI与DNA的复合能力与PEI的相对分子质量呈正相关,不同溶剂、离子强度会影响复合物的表面性质,以磷酸盐缓冲液(PBS)为溶剂、PEI(25kD)为载体、N/P比为12～15时,PEI/DNA复合物细胞转染效率明显优于质粒DNA,仅略低于阳性对照组。结论:经优化的PEI/DNA复合物可显著提高DNA在细胞中的转染效率。     

可生物降解多肽基因载体的构建与体外评价

目的 制备一种应用于基因递送系统的硫辛酸修饰的聚精氨酸多肽纳米复合物,并考察其对人胚肾细胞系HEK293细胞的转染效率及细胞毒性.方法 以不同量的半胱氨酸作为交联剂,合成4种不同交联度的还原性硫辛酸修饰的交联聚精氨酸组氨酸(LHRss),利用1H NMR和凝胶色谱鉴定合成的LHRss.取质粒DNA (pDNA)和LHRss以不同氮磷比(N/P)自组装形成纳米复合物,用粒度测定仪测定复合物的粒径和zeta电位,凝胶阻滞电泳测定载体LHRss对pDNA的包裹能力.用LHRss/pDNA纳米复合物与HEK293细胞共同培养,考察不同交联度复合物的细胞摄取情况及相关基因转染情况,并测定不同纳米复合物对HEK293细胞的细胞毒性.结果 通过结构鉴定确定LHRss多肽合成成功.组装形成的纳米复合物粒径分布均匀,N/P≥40时LHRss3/pDNA及LHRss4/pDNA复合物的zeta电位均大于30 mV.凝胶阻滞电泳结果显示N/P值为5时,LHRss3可完全包裹pDNA.当N/P值为40时,HEK293细胞对LHRss3/pDNA的摄取及转染效率高于其他3种复合物及单体硫辛酸修饰的聚精氨酸组氨酸(LHR);其中LHRss3/pGL3复合物的平均荧光强度约为LHR/pGL3复合物的3.98倍,差异具有统计学意义(P＜0.05).细胞毒性实验显示LHR/pGL3及不同交联度LHRss/pGL3转染HEK293细胞24 h后,细胞存活率均在80％以上,其毒性作用均低于bPEI-25K(20 μg/mL bPEI-25K转染细胞24 h后细胞存活率为25％左右,P＜0.05).结论 制备的硫辛酸修饰的聚精氨酸多肽纳米复合物有望成为一种高效的基因载体.     

对叔丁基杯[4]芳烃酸偶合低相对分子质量聚乙烯亚胺作为非病毒转基因载体的体外研究

目的合成对叔丁基杯[4]芳烃酸偶合低相对分子质量聚乙烯亚胺聚合物作为非病毒转基因载体,并评价其毒性、压缩DNA的能力,携带报告基因转染细胞的能力。方法采用新方法合成对叔丁基杯[4]芳烃酸偶合聚乙烯亚胺聚合物,通过核磁共振方法表征。将合成的新聚合物与DNA混合,得到新聚合物/DNA复合物,用琼脂糖电泳试验测定不同N/P比值形成复合物时对质粒DNA电泳的阻滞情况,评价其压缩DNA能力。透射电镜法检测复合物的大小,MTT法检测其对细胞的毒性作用,使用新聚合物携带报告基因转染细胞,并与PEI25000比较转染率。结果新聚合物压缩质粒DNA的能力随N/P比值增大而增强,在N/P比为6时可以完全阻滞质粒DNA的电泳,在N/P比为60时,复合物粒径约291 nm,复合物的表面电荷约14.6 m V。细胞毒性试验表明新聚合物与PEI25000相比毒性明显下降,携带报告基因转染MCF-7细胞转染效率与PEI25000相近。结论对叔丁基杯[4]芳烃酸聚乙烯亚胺新聚合物具有较强压缩质粒DNA能力,对细胞毒性低,转染效率高,是一种可应用于基因治疗的新型非病毒载体。     

新型纳米非病毒基因输送体系PCL-PEG-chitosan的构建与特性

目的 优化新型纳米非病毒载体聚己内酯（PCL）-聚乙二醇（PEG）-壳聚糖（chitosan）（PCL-PEG-chitosan）在体外与质粒的复合条件,并进行转染活性测定。方法 在体外利用凝胶电泳方法确定非病毒载体与携带绿色荧光蛋白基因的质粒（pEGFP）复合的最小氮磷比。利用动态光散射粒径测量仪确定复合物在不同氮磷比、不同缓冲溶液体系下粒径的变化情况。将pEGFP与PCL-PEG-chitosan进行复合后转染293T细胞,荧光显微镜观察转染效率。结果 凝胶电泳结果显示,非病毒载体PCL-PEG-chitosan与pEGFP复合的最小氮磷比为4∶1,PCL-chitosan与pEGFP复合的最小氮磷比也为4∶1,chitosan与pEGFP复合的最小氮磷比为1∶1。动态光散射实验结果显示：非病毒载体PCL-PEG-chitosan与pEGFP复合而成的复合物的粒径随着氮磷比的增大而减小;在醋酸盐缓冲体系与DMEM缓冲体系中,复合物的粒径基本一致,相对稳定。荧光显微镜观察发现,经过接枝改性的纳米载体PCL-PEG-chitosan的转染效率有所提高。结论 PCL修饰可减弱chitosan对pEGFP的复合能力,提高最低复合氮磷比。经PCL和PEG修饰的纳米载体PCL-PEG-chitosan的细胞转染活性有所提高,但尚需进一步改进。     

含RGD肽CP9修饰的聚乙烯亚胺复合物的理化特性及其转基因功能的研究

目的：构建含精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）肽CP9修饰的聚乙烯亚胺（PEI），观察其理化特性和转基因功能。方法：通过琥珀酰亚胺-3-（2-嘧啶二硫）丙酸酯（N-Succinimidyl-3-（2-pyridyldithio）]propionate，SPDP）将CP9偶联到PEI上，合成新型转基因载体CP9-PEI。用^1H-NMR和FT-IR验证CP9的偶联；用凝胶电泳阻滞实验、电镜和粒径检测，观察CP9-PEI浓缩质粒DNA的能力以及浓缩质粒DNA后形成的转染颗粒形态和粒径；通过CP9-PEI在人肝癌细胞株HepG2中的转染实验来验证CP9对PEI的转染效率的影响；通过游离CP9肽的竞争抑制实验验证CP9-PEI的整合素靶向功能。结果：CP9成功偶联到PEI上；CP9-PEI能有效浓缩质粒DNA，形成的转染颗粒形态为圆形或类圆形，在N／P比为10时，粒径约为200nm。CP9-PEI的转染效率是PEI的2倍，游离CP9肽能抑制CP9-PEI的转染效率。结论：修饰了CP9的PEI能有效增加转染效率，具有整合素的靶向能力，是一种具有应用前景的转基因载体。     

可降解非病毒基因载体PEG-b-(PG-g-PEI)的合成与表征

目的结合重组低分子量PEI 和PEG结构修饰两种手段合成出新型可生物降解的非病毒基因载体聚乙二醇-b-(聚谷氨
酸-g-聚乙烯亚胺)。方法用相对分子质量600 的聚乙烯亚胺氨解嵌段聚合物PEG-b-PBLG,合成非病毒基因载体聚乙二
醇-b-(聚谷氨酸-g-聚乙烯亚胺);利用核磁共振氢谱、凝胶渗透色谱、激光粒度分析仪、zeta电位仪和凝胶电泳对载体及其与DNA
复合物进行了表征,并通过体外细胞实验考察了载体的细胞毒性与转染效率。结果我们成功合成出窄分布的非病毒基因载体
聚乙二醇-b-(聚谷氨酸-g-聚乙烯亚胺);凝胶电泳测定结果表明当N/P比大于5时载体能很好地包裹DNA;载体与DNA形成的
复合物粒径为120 nm,zeta电位25 mV;通过MTT实验和体外质粒转染实验显示出载体在测量范围内具有极低的细胞毒性和
很高的转染效率。结论聚合物聚乙二醇-b-(聚谷氨酸-g-聚乙烯亚胺)有望作为非病毒基因传递载体。
     

聚乙烯亚胺介导miR-2861模拟物转染MC3T3-E1细胞的体外成骨分化

目的：通过非病毒载体聚乙烯亚胺（PEI）介导miRNA-2861（miR-2861）模拟物转染MC3T3-E1细胞系,探讨miR-2861/PEI复合物在前成骨细胞中的转染效率及其对细胞增殖和成骨向分化的影响。方法：将适量的PEI分别与miR-2861和阴性对照（NC）以元素N/P=10的比例混合形成基因/载体复合物。将miR-2861/PEI复合物作为实验组,NC/PEI复合物作为阴性对照组以排除人工合成的双链基因对成骨作用的干扰。采用MTT法筛选PEI复合miR-2861模拟物的最佳使用浓度;应用荧光成像和茎环法RT-PCR技术分别检测10、30、50和100 nmol·L^-1 miR/PEI复合物对MC3T3细胞的瞬时转染效率和miR-2861的表达情况;采用qRT-PCR技术和茜素红染色检测用选定浓度瞬时转染miR-2861/PEI复合物作用下MC3T3细胞的成骨能力。结果：与空白对照组比较,100 nmol·L^-1 miR-2861/PEI复合物作用72h时MC3T3细胞增殖率明显下降（P<0.05）。随转染浓度增加,miR-2861/PEI复合物在MC3T3细胞中的转染效率逐渐升高。茜素红染色及定量分析,实验组诱导21 d后出现较多的钙盐沉积结节,而空白对照组和阴性对照组均较少。结论：以PEI作为载体可使miR-2861模拟物有效转染MC3T3-E1细胞并在细胞中高表达,miR-2861模拟物具有一定的促MC3T3-E1细胞成骨向分化的作用。     

脂质体介导外源性基因在骨髓基质细胞表达

目的：用阳离子脂质体介导真核表达载体pEGFP-PDX-1转染大鼠骨髓基质细胞，并对其转染条件进行优化以获得较高效率。方法：构建的重组载体鉴定后，以脂质体介导其转染骨髓基质细胞,改变DNA,脂质体的量,在荧光显微镜下观察荧光并计算转染效率；转染后48 h进行细胞免疫组化染色检测目的基因的表达情况。结果：限制性酶切分析证实重组后的载体成功载入PDX-1基因；克隆的目的片断经序列测定与GenBank公布的序列一致；质粒∶脂质体为1∶1或1∶2的转染效率最佳；细胞免疫化学染色检测证实转染后骨髓基质细胞有PDX-1基因表达。结论：成功构建了含有PDX-1基因的真核表达载体；通过优化转染条件提高了pEGFP-PDX-1转染大鼠骨髓基质细胞的效率,为成为组织工程的种子细胞提供了实验依据。     

A RGD-Containing Oligopeptide (K)_(16)GRGBSPC: A Novel Vector for Integrin-Mediated Targeted Gene Belivery

A 23 amino acid, bifunctional integrin-targeted synthetic oligopeptide was evaluated for ex vivo gene delivery to rabbit bone marrow stromal cells (BMSCs). Synthesis of the peptide (K)16GRGDSPC was performed on a solid-phase batch peptide synthesizer. BMSCs were transfected with plasmid DNA coding for luciferase by (K)16GRGDSPC and the transfection efficiency was assayed. The influences of chloroquine and polyethyleneimine on the transfection efficiency were also examined. The target specificity of (K)16GRGDSPC to mediate exogenous gene into BMSCs was analyzed using cell attachment test and gene delivery inhibition test. The results showed that the transfection efficiency of the oligopeptide vector was lower than that of Lipofectamine. But in the presence of endosomal buffer chloroquine or endosomal disrupting agent polyethyleneimine, the transfection efficiency of the vector was greatly enhanced. In addition, RGD-containing peptides inhibited BMSCs' attachment to the 96-well plates pretreated with fibronectin or vitronectin and significantly decreased the transfection efficiency of the oligopeptide vector. These studies demonstrated that oligopeptide (K)16GRGDSPC was an ideal novel targeted non-viral gene delivery vector, which was easy to be synthesized, high efficient and low cytotoxicity. The vector could effectively deliver exogenous gene into rat BMSCs.     

人生长激素释放激素变异受体1型基因绿色荧光蛋白真核表达载体1的构建及体外表达

目的构建人生长激素释放激素变异受体1型（GHRHR-SVT1）基因绿色荧光蛋白真核表达载体1（pEG—FP—N1）并在鼠成纤维细胞株NIH-3T3细胞中的表达。方法GHRHR-SVT1基因是由人胃癌细胞株AGS中扩增出的DNA片段,克隆入真核表达载体pEGFP-N1中,用高效转染试剂将pEGFP-N1／GHRHR—SVT1转染NIH-3T3细胞,NIH-3T3细胞分3组：非转染组（对照组）,只加转染试剂不加质粒;转染空质粒组（pEGFP-N1组）,加转染试剂与空质粒;重组质粒转染组（pEGFP-N1／GHRHR-SVT1组）,加转染试剂与重组质粒。采用四甲基偶氮唑盐（MTT）法和流式细胞仪检测各组转染后各组NIH-3T3细胞的生长情况。结果（1）pGEFP—N1／GHRHR-SVT1经限制性内切酶XhoⅠ和BarnHⅠ双酶切产生约1080bp和4700bp2条带。（2）构建的GHRHR-SVT1cDNA序列与GHRHR—SVT1原始序列（AF-282259）进行对比,第54位碱基突变（A突变为T）,为无义突变。（3）重组质粒转染组NIH-3T3细胞增殖率明显高于对照组（P〈0．01）。（4）重组质粒转染组NIH-3T3细胞增殖指数明显高于对照组（P〈0．01）。结论在适当浓度GHRH（10μmol／L）的培养基中,GHRHR—SVT1能够促进NIH-3T3细胞增殖,并为肿瘤的治疗提供新的思路。     

以PRDM1基因启动子为靶点的药物筛选模型的建立研究

目的 以PRDM1基因启动子为靶点构建双荧光素酶报告基因载体,建立体外药物筛选细胞模型,并对中草药小分子化舍物进行筛选.方法 将人PRDM1基因启动子序列(267、1 257 bp)克隆入荧光素酶报告基因载体pGL3-Basic中,构建重组质粒pGL3-PRDM1并与内参质粒pRL-TK瞬时共转染工具细胞,通过检测荧光素酶报告基因表达水平的变化反映PRDM1基因启动子的启动转录活性,并对共转染质粒比例、工具细胞选择等条件进行探索和优化,相关药物处理进行验证.结果 成功构建了荧光素酶报告载体pGL3-PRDM1.用0.5、1、2、4μmol/L的5-Aza-CdR处理重组的U266细胞筛选模型,与0μmol/L 5-Aza-CdR相比,增加5-Aza-CdR的刺激,荧光强度及PRDM1基因启动子的活性呈剂量依赖性增强.与0μmol/L相比,青蒿琥酯从5 μmol/L浓度开始对PRDM1基因启动子活性呈明显降低(P＜0.05),在20 μmol/L浓度时降到最低;白芍总苷呈现小剂量促进PRDM1启动子活性,高剂量抑制PRDM1基因启动子活性.青蒿琥酯对细胞生长增殖影响较小,白芍总苷对细胞生长增殖的影响较复杂.结论 成功建立了以PRDM1基因启动子为靶点的药物筛选模型,并筛选出青蒿琥酯能抑制PRDM1基因启动子活性.