人SMRT基因真核和原核表达载体的构建及鉴定

目的：构建人SMRT基因真核和原核表达载体。方法：体外人工合成SMRT-C645bp对应的基因片段,克隆至pUC57载体,酶切,测序正确后,PCR扩增目的基因片段,酶切后亚克隆至pCMV-myc载体和pGEX-6p-1载体,并酶切和测序鉴定。结果：成功构建了人pCMV-myc-SMRT真核表达载体和pGEX-6p-1-SMRT原核表达载体。结论：成功构建了人SMRT真核和原核表达载体,为下一步蛋白间相互作用的证实提供了基础。     

人IL-26的基因克隆及其真核表达载体的构建

基因，构建其真核表达载体并探讨在真核细胞中的表达。方法：提取人外周血单个核细胞总RNA，逆转录 聚合酶链反应（RT PCR）扩增hIL 26基因；目的片段与pMD18 T载体连接，转化大肠杆菌E.coli DH5α,菌落PCR、酶切分析和DNA序列分析鉴定重组克隆。用SalⅠ和EcoRⅠ将目的片段切下，插入pIRES2 EGFP的相应位点，构建表达载体pIRES2 EGFP/hIL 26并进行酶切鉴定。将重组质粒用非脂质体试剂Fugene 6转染至COS7细胞中。结果：重组克隆载体pMD18 T/hIL 26内插入片段序列与GenBank上报道的hIL 26基因序列完全一致；pIRES2 EGFP/hIL 26经酶切鉴定与预期结果一致；荧光显微镜观察可见转染后的细胞有荧光出现，Western blotting 鉴定证明hIL 26基因得到了有效表达。结论：成功构建了hIL 26基因的真核表达载体并在真核细胞中获得了有效表达。     

RNAi人端粒酶反转录酶(hTRET)真核表达载体的构建及鉴定

目的 构建和鉴定人端粒酶反转录酶( hTERT)干扰真核表达载体.方法 人工合成hTERT干扰序列并定向克隆到siRNA(small inlerfereace RNA)真核表达载体pSilencer 3. 1 H1 neo;采用PCR ,酶切,浓度及纯度和测序鉴定.结果 成功构建了hTERT干扰真核表达载体.结论 hTERT干扰真核表达载体的构建为进一步研究端粒、端粒酶在肿瘤细胞中的生物学作用奠定了基础.     

健康人APOBEC3G基因的克隆及真核表达载体的构建与鉴定

目的克隆人载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽样3G（apolipoprotein B mRNA editing enzyme,catalyticpolypeptide 3G,APOBEC3G）基因cDNA,构建APOBEC3G基因的真核表达载体,并在体外进行表达和鉴定。方法采用RT-PCR技术从健康人外周血单个核细胞中克隆APOBEC3G基因,将该基因插入pcDNA3.1真核表达载体,构建pcDNA3.1-A3G真核表达质粒,并利用脂质体将重组质粒pcDNA3.1-A3G转染HepG2和HL7702细胞,经免疫细胞化学、Western blot等方法检测APOBEC3G真核表达情况。结果双酶切鉴定和测序结果表明,APOBEC3G真核表达载体构建成功。免疫细胞化学和Western blot结果均显示,转染pcDNA3.1-A3G的HepG2和HL7702细胞APOBEC3G蛋白均高表达,转染空质粒pcDNA3.1和未转染的HepG2和HL7702细胞APOBEC3G蛋白低表达或不表达。结论成功构建了人载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽样3G真核表达载体pcDNA3.1-A3G,为进一步研究APOBEC3G抗HBV作用奠定实验基础。     

反义人血管生成素的真核表达载体的构建及其体外功能的初步研究

目的构建含反义人血管生成素的真核表达载体,并转染人肺癌细胞株A549,使之特异性地封闭A549细胞中血管生成素的表达,以达到抑制肿瘤生长的目的.方法用RT-PCR的方法合成血管生成素的cDNA,将其反向克隆入逆转录病毒质粒载体中,通过PA317细胞包装为假病毒颗粒,体外转染肺癌细胞株A549.结果构建出含反义血管生成素的逆转录病毒载体,感染A549细胞后,能有效抑制A549细胞血管生成素蛋白的表达.结论利用反义血管生成素的逆转录病毒载体能够有效抑制培养细胞血管生成素的表达,为今后的体内应用奠定了基础.     

人hTRT正反义真核表达载体的构建及初步鉴定

目的 构建人端粒酶蛋白催化亚单位（ｈＴＲＴ）正、反义真核表达载体。方法 采用分子克隆技术将ｈＴＲＴ ｃＤＮＡ正向及反向克隆到真核表达载体ｐｃｌ－ｎｅｏ中。结果 Ｎｏｔ Ⅰ酶切后,正义重组基因为８．８ｋｂ一条带,反义重组基因为３．４ｋｂ和５．４ｋｂ二条带,与理论计算相符。结论 成功构建了ｈＴＲＴ正反义真核表达载体。     

人C型利钠肽基因的克隆及其真核表达载体的构建

目的：为开展C型利钠肽基因治疗，克隆人C型利钠肽基因并构建其真核表达载体。方法：通过RT-PCR从人胎盘组织中克隆人C型利钠肽基因全长编码区，将该DNA片段亚克隆至克隆载体pBS-T中，用SmaⅠ单酶切筛选出负向插入片段，用HindⅢ和BamHⅠ双酶切将目的DNA片段定向克隆至真核表达质粒pcDNA3．1（＋）中，然后用双酶切、PCR鉴定和DNA序列测定三重鉴定方法对重组质粒进行鉴定。结果：酶切、PCR及测序鉴定证实，人C型利钠肽基因全长编码区被准确插入至pcDNA3．1（＋）酶切位点HindⅢ和BamHⅠ之间，并且未发现有碱基突变或移位。结论：含人C型利钠肽基因真核表达质粒的成功构建并鉴定，为开展C型利钠肽基因治疗奠定了物质基础。     

人AFP全长基因编码序列的克隆及表达

目的 构建人AFP全长基因编码序列的真核表达质粒,并在CHO及小鼠肌肉组织中表达。方法 从人胎肝组织中提取AFP基因,以全长基因序列为目的基因片段,真核表达质粒pcDNA3．1( )为载体,构建AFP重组质粒phAFP,经酶切分析和DNA测序对phAFP进行鉴定。重组质粒phAFP经脂质体转染真核细胞CHO以及直接注射小鼠胫前肌,并采用免疫荧光染色及免疫组化对其表达产物进行检测。结果 获取的AFP基因片段与GenBank报道的序列一致,确认为人AFP基因的全长编码序列,构建的重组质粒phAFP能在体外真核细胞CHO、体内肌细胞中有效表达。结论 成功构建了能在真核细胞中表达的重组质粒phAFP,为AFP DNA疫苗治疗肝癌的研究打下基础。     

人双突变型低氧诱导因子1α真核表达载体的构建及鉴定

目的构建能在哺乳动物细胞得到常氧下高表达的携带HIF-1α突变型HIF-1α-Ala402-Ala 564基因真核表达载体pShuttle2-HIF1α—Ala402-Ala564。方法 采用分子克隆技术,在业已完成的pShuttle2-HIF-1α—Ala564的基础上,用连续聚合酶链式反应（PCR）定点突变的方法将其第402位脯氨酸密码子CCA突变为丙氨酸密码子GCA,构建成双突变HIF-1α真核表达载体pShuttle2-HIF-1α—Ala402-Ala564。结果 经酶切鉴定及基因测序证实人双突变型低氧诱导因子1α真核表达载体pShuttle2-HIF1α—Ala402-Ala564构建成功。结论 成功构建重组人双突变型低氧诱导因子1α真核表达载体pShuttle2-HIF1α—Ala402-Ala564,为缺血性心脏病的HIF-1α基因治疗研究奠定基础。     

人端粒酶逆转录酶基因启动子区的克隆及其真核表达载体的构建

目的：构建人端粒酶逆转录酶基因启动子区的真核表达载体。方法：用核酸内切酶NotⅠ和KpnⅠ酶切报告基因GFP,插入pcDNA3．1( )载体,得到pcDNA3．1( )-GFP(PG)载体;用PCR方法扩增hTERT基因ATG上游的启动子序列,测序后用核酸内切酶BglⅡ和KpnⅠ酶切插入PG载体,得到pcDNA3．1( )-GFP—hTERT(PGT)载体。将PGT载体转染人食管癌EC9706细胞系,经G418筛选,荧光显微镜下观察。结果：克隆得到的启动子序列与文献相符,重组载体经酶切鉴定方向正确,含有人端粒酶逆转录酶基因启动子序列。经转染人食管癌EC9706细胞系,在荧光显微镜下观察到绿色的阳性克隆。结论：克隆的人端粒酶逆转录酶基因启动子序列在真核细胞中具有启动子活性。     

Expression of Bioactive Human β Defensin 4 in COS-7 Cell

Objective To establish a cell line for stable expression of bioactive human beta-defensin 4 （HBD4）. Methods The full-length HBD4-cDNA was isolated from previously constructed cloning vector pMD18-T/HBD4 by restriction endonuclease digestion and cloned into eukaryotic expression vector pcDNA3.1＋ to construct pcDNA3.1＋/HBD4. The recombinant vector identified carrying HBD4 with right sequence was introduced into COS-7 cells by Lipofectamine. Cell clones survived in G418-rich medium and with stable expression of HBD4 in both mRNA and protein level were identified by RT-PCR and western blot respectively. The antimicrobial activity of the secreted HBD4 was also evaluated. Results The full-length HBD4-cDNA was successfully cloned into eukaryotic expression vector pcDNA3.1＋. COS-7 cells transfected with pcDNA3.1＋/HBD4 expressed HBD4 stably in mRNA and protein level. The HBD4 protein secreted into the culture medium showed strong antimicrobial activity against P. aeruginosa ATCC 27853 and E. coli ATCC 25922. Conclusion We successfully established a stable bioactive HBD4-expressing cell line.     

重组人白细胞介素12基因在COS－7细胞的高效表达

将分别含有重组人ＩＬ－１２（ｒｈＩＬ－１２）两个亚单位ｃＤＮＡ的高效真核细胞表达载体，通过ＤＥＡＥ－Ｄｅｘｔｒａｎ改良方法，共转染至ＣＯＳ－７细胞中。结果高效表达了ｒｈＩＬ－１２蛋白，表达量为６００Ｕ／ｍｌ；并研究其对人ＰＢＭＣ的促增殖作用和增加ＮＫ细胞毒活性的作用，为进一步研究ＩＬ－１２的生物学功能奠定了基础。     

Connexin26在膀胱移行细胞癌中的表达及意义

目的研究间隙连接蛋白26（connexin26，Cx26）在膀胱移行细胞癌中的表达情况并分析其临床意义。方法对40例不同分化程度的膀胱移行细胞癌及10例非肿瘤膀胱上皮组织的石蜡切片，用免疫组织化学SP法分别检测Cx26蛋白的表达。结果Cx26蛋白主要表达于细胞膜，10例非肿瘤膀胱组织中Cx26蛋白均呈阳性表达（阳性率100％），而在40例不同分化程度的膀胱移行细胞癌组织中Cx26的阳性表达率为27．50％，而且细胞质中也有少量表达，其中G1期、G2期、G3期的阳性表达率分别为11．11％、30．00％、36．36％；T1期、T2期、T3、T4期的阳性表达率分别为28．57％、18．75％、37．50％和50．00％。进一步进行统计学分析发现：与非肿瘤膀胱上皮组织相比间隙连接蛋白26在膀胱移行细胞癌中的表达显著下调p〈0．001，但未发现Cx26的表达与膀胱癌的临床分期及细胞分级呈负相关p〉0．05。结论Cx26蛋白在膀胱移行细胞癌中的表达显著下调，Cx26蛋白的下调与膀胱癌的发生发展密切相关，Cx26蛋白可作为一种有用的肿瘤标记物，并可应用于肿瘤的诊断。     

复聪汤对神经性耳聋患者血清NO、Connexin26、Connexin30水平表达的影响

目的:探讨复聪汤对神经性耳聋患者血清一氧化氮(nitric oxide,NO)、连接蛋白26(Connexin26)、连接蛋白30(Connexin30)水平表达的影响。方法:将90例患者按随机数字表法分为对照组和治疗组,每组45例。对照组采用常规治疗,观察组采用复聪汤治疗,记录两组患者血清NO、Connexin26及Connexin30水平及生存质量、血液流变学指标,同时比较临床疗效和不良反应发生情况。结果:观察组有效率为88.89%,对照组有效率为71.11%,差异有统计学意义(P0.05);与对照组比较,观察组治疗后血清NO、Connexin26及Connexin30水平升高,治疗后简易精神状态量表(minimum mental state examination,MMSE)、日常生活活动能力Barthel指数(modijied Barthele index,MBI)评分升高,焦虑自评量表(self-rating anxiety scale,SAS)、抑郁自评量表(self-rating depression scale,SDS)评分降低,治疗后血液黏度指标及红细胞压积显著降低,差异有统计学意义(P0.05);观察组不良反应率(8.89%)与对照组(6.67%)比较,差异无统计学意义(P0.05)。结论:复聪汤能降低神经性耳聋患者血清NO、Connexin26、Connexin30表达水平,提高生活质量,临床疗效显著。     

H—2K^b cDNA的克隆及其在多种真核细胞中的表达

目的 克隆Ｈ－２Ｋ＾ｂｃＤＮＡ及研究其在多种真核细胞中的表达。 方法 ＲＴ－ＰＣＲ法扩增Ｈ－２Ｋ＾ｂｃＤＮＡ,克隆入双顺反子逆转录病毒载体ｐＧＣＥＮ,ＰＡ３１７包装出重组病毒后,分别感染ＮＩＨ３Ｔ３、ＣＯＳ７及ＭＭ４５Ｔ．Ｌｉ,ＰＣＲ和ＲＴ－ＰＣＲ分析目的基因表达,ＦＡＣＳ分析Ｈ－２Ｋ＾ｂ在细胞膜上的表达。结果 以双顺反子逆转录病毒载体ｐＧＣＥＮ介导,分别建立了Ｈ－２Ｋ＾ｂ基因转导细胞：ＮＩＨ３Ｔ     

人源性抗-D基因工程抗体在真核细胞CHO中的表达

目的于真核细胞系CHO细胞中表达人源性抗-D基因工程抗体,为人源性抗-D基因工程抗体在临床上的应用打下坚实的基础。方法脂质体法将真核表达载体pAH4604/VH和pAG4622/VL共转染体外培养的CHO细胞,经霉酚酸及组氨醇筛选阳性克隆细胞。通过ELISA法检测培养上清中人IgG的表达量。应用化学发光WesternBlotting法对真核表达载体pAH4604/VH和pAG4622/VL在CHO细胞中的表达进行鉴定。结果pAH4604/VH和pAG4622/VL共转染体外培养的CHO细胞,经霉酚酸及组氨醇筛选12～14d后有阳性克隆长出,未转染细胞则全部死亡。筛选出的各阳性细胞克隆经扩大培养及ELISA定量检测其上清人IgG含量最高为4.05ng/ml。WesternBlotting显示上清和细胞内均有人IgG重链和轻链的表达。结论所构建的真核表达载体pAH4604/VH和pAG4622/VL在CHO真核细胞系表达成功,可产生人源化的IgG重链和轻链。     

Gene Cloning of Murine α-Fetoprotein Gene and Construction of Its Eukaryotic Expression Vector and Expression in CHO Cells

Hepatocellularcarcinoma (HCC)isamajorcauseofcancerdeathwithmorethan 1.2millionglobalan nualincidences[1] .Surgeryandlivertransplantationaretheonlyeffectivetreatments ,butmostHCCpa tientsarenoteligiblebecauseofdiagnosisatalaterstageorunderliverinsufficiencyinthesettingofcir rhosis[2 5] .Thedevelopmentofnoveltreatmentstrategiesisneeded .TheAFPisanHCC associatedoncofetalantigen .ThemajorityofhumanHCCsoverexpresstheoncofetalantigenAFP .ThisMr 700 0 0 glycoprotein ,producedathighlevelsbyth…     

先天性巨细胞病毒感染致connexin26基因突变新生儿听力随访及干预

目的调查先天性巨细胞病毒感染新生儿connexin26基因突变,分析其与听力损害的关系,并对新生儿进行听力随访及听力干预。方法筛选温州医科大学附属第二医院及金华永康市第一人民医院60例CMV-DNA阳性新生儿,留取脐血行RT-PCR法检测其connexin26基因mRNA表达情况,对PCR结果送检进行碱基测序,追踪新生儿听力情况,对connexin26基因变异情况及听力检测结果进行相关性分析,并对发生感音性神经性聋(sensorineural hearing loss,SNHL)者进行听力干预,1周岁时评估干预效果。结果在入试新生儿中,总计有39例发生235delC突变,突变者中11例发展为SNHL。相关分析结果显示基因突变和SNHL之间均存在相关性。对发生SNHL婴儿进行听力干预后,仍有少数婴儿听力损害加重,但Gesell评估发现,其语言、社交、适应等能力与正常儿童差异无统计学意义。结论巨细胞病毒感染会新生儿导致connexin26基因突变,并可能进一步导致听力损害,在发生SNHL以后,积极进行听力干预可以保证其正常语言、社交等能力的发展。     

人CTLA-4Ig融合基因减毒鼠伤寒沙门菌真核表达载体的构建及表达

目的构建能稳定表达人CTLA4 Ig融合基因的减毒鼠伤寒沙门菌真核表达载体,探讨其在哺乳动物细胞中的表达并对表达产物进行鉴定。方法用touchdown PCR法扩增CTLA-4 Ig融合基因,将PCR产物连接真核表达载体pcDNA3.1( ),构建pcDNA3.1( )-CTLA-4 Ig,用电穿孔仪转入减毒鼠伤寒沙门菌SL7207。将表达质粒转染COS-7细胞,SDS-PAGE、W estern b lot检测转染细胞裂解上清中目的蛋白的表达。结果酶切鉴定和基因序列测定显示重组质粒构建成功。在pcDNA3.1( )-CTLA-4 Ig质粒转染后48 h细胞裂解上清中,检测到CTLA-4 Ig融合蛋白的表达,该蛋白能与抗人CTLA-4单抗特异结合。结论成功构建了能稳定表达人CTLA4 Ig融合基因的减毒鼠伤寒沙门菌真核表达载体,并在哺乳动物细胞中成功表达有生物学活性的重组人CTLA-4 Ig蛋白。     

人VEGF在NIH3T3细胞中的基因转移和表达

目的研究人血管内皮细胞生长因子(human VEGF)在体外培养的小鼠成纤维细胞(NIH3T3细胞)中的基因转移及表达,为血管化组织工程、缺血性疾病的治疗奠定实验基础。方法应用脂质体介导的基因转移技术,将含有人VEGF165编码序列的真核表达载体pcDNA/V转染至体外培养的NIH3T3细胞系中。G418筛选出稳定表达重组质粒的细胞克隆,转接于细胞瓶中,培养72 h,同时以G418筛选的pcDNA3.1(+)阳性细胞克隆和未转染的NIH3T3细胞为阴性对照,取细胞培养上清及细胞裂解液样品进行Western blotting检测。用细胞免疫组织化学染色检测人VEGF165基因在NIH3T3细胞中的表达情况,不着色者为阴性,细胞胞质着色呈棕黄(褐)色者为阳性。结果Western blotting结果显示在转染pcDNA/V质粒的NIH3T3细胞培养上清中,可以检测到相对分子质量为22 000的反应条带,与预计的人VEGF165单体蛋白的相对分子质量相符。细胞免疫组织化学染色检测结果显示,转染pcDNA/V质粒的NIH3T3细胞呈阳性。结论人VEGF165能够在NIH3T3细胞中有效表达,并获得了稳定表达人VEGF165基因的NIH3T3细胞株。