蛋白质芯片在鼠疫患者血清抗体谱检测中的应用

目的检测鼠疫患者血清抗体谱,为鼠疫的疫苗研究奠定基础。方法利用鼠疫耶尔森氏菌毒流力相关蛋白的蛋白质芯片检测鼠疫患者血清抗体谱。结果利用一个包含145个鼠疫菌毒力相关蛋白的蛋白质芯片,在鼠疫患者血清中检测到37种鼠疫菌蛋白相应的抗体。结论通过对鼠疫患者血清抗体谱的分析,寻找到新的能在人体内产生体液免疫的蛋白。     

鼠疫血清抗体谱的研究进展(摘要)

目的 利用蛋白芯片技术对鼠疫血清进行检测,分析其血清抗体谱.方法 用制备好的蛋白芯片和未知的血清进行杂交后荧光检测并数据分析.结果 发现具有抗原性,免疫原性的相关蛋白.结论 通过分析血清抗体谱而得到新的具有免疫原性的蛋白作为潜在的候选疫苗组;得到新的可以用于鼠疫菌诊断的抗原,作为目前血清学检测的辅助诊断抗原;通过对系列血清抗体变化趋势以及不同种属间抗体谱的区别的分析,加深对鼠疫菌致病机制的认识.     

青海省鼠疫患者血清抗体谱研究

目的研究在鼠疫感染过程中,患者对鼠疫耶尔森菌产生体液免疫反应的规律.寻找鼠疫菌新的具有免疫原性的蛋白。方法利用鼠疫耶尔森菌重要毒力相关蛋白芯片对鼠疫患者的血清抗体谱进行检测。结果利用含145个鼠疫耶尔森菌蛋白质的蛋白芯片。共检测到鼠疫患者血清中29个蛋白的抗体。其中13种蛋白的抗体在患者体内明显上升,除已知的8个具有免疫原性的蛋白外,发现了鼠疫菌5个新的具有免疫原性的蛋白(SycE、SycH、OmpA、pH6与YPO2098)。结论这5个新的具有免疫原性的蛋白将是下一步鼠疫疫苗研究的靶点。     

肺鼠疫患者血清蛋白抗体的测定

目的 分析肺鼠疫患者血清中蛋白抗体产生的种类和机体免疫应答能力,为筛选新的疫苗亚单位提供试验依据.方法 利用蛋白微阵列技术构建蛋白芯片.对2例肺鼠疫患者发病后6个月的血清,采用蛋白质芯片(含有149个鼠疫菌毒力相关基因蛋白)技术检测血清中鼠疫蛋白抗体的种类和机体的免疫应答能力.结果 患者1血清中除了YPMT1.23c、YPMT1.86、YP00406、YP01071基因编码的蛋白没检测出相应的蛋白抗体外,其他88种蛋白均检测出相应的蛋白抗体;患者2血清中检测出43种基因编码的蛋白抗体,其他49种没有检查到.有39种基因蛋白抗体在患者1、2血清中都存在,其中有YPMT1.81c、YPMT1.84、rv10、YPCD1.31c、YPCD1.28、YPCD1.58、YPMT1.62c、YP03247共8种蛋白抗体明显升高.与正常值比较,患者1、2血清中8种蛋白抗体升高的阳性倍数分别为:109.96、176.4,20.64、17.73,16.50、7.16,23.51、7.65,46.00、25.61,4.50、8.24,5.98、5.08,23.98、4.76.结论 通过对肺鼠疫患者血清抗体测定,8种蛋白抗体不仅可作为免疫诊断的靶标,同时也是今后亚单位疫苗的研究重点.     

腺鼠疫患者血清抗体谱的研究

目的检测腺鼠疫患者血清抗体谱及抗体随时间变化趋势。方法利用一包含145个鼠疫耶尔森氏菌毒力相关蛋白质的蛋白芯片检测云南腺鼠疫患者血清抗体谱及抗体随时间变化趋势。结果在腺鼠疫患者体内检测到32种蛋白相应的抗体。结论FI抗体产生的速度最快、幅度最高、持续的时间最长;YopM、YopH、YopE抗体升高不明显;V抗体在患者体内未检测到;在发病后14 d才检测到pH6抗原的抗体,3个月时抗体荧光值没有下降,可持续半年。YopD的抗体在部分患者体内明显升高,但在半年后下降到正常水平。     

日本血吸虫PA28亚单位蛋白的表达与鉴定、纯化及免疫反应性的评价

目的 将亚克隆在pET32a( )质粒上的日本血吸虫蛋白酶体激活因子PA28亚单位基因进行表达及蛋白纯化，并对表达产物用Western—blot：及ELISA方法进行免疫反应性的评价。方法 将重组表达质粒pET32a( )-PA28转化入大肠杆菌BL21中，IPTG诱导表达后超声裂菌，离心后取上清进行SDS—PAGE，观察融合蛋白的表达情况；用Ni—NTA柱子纯化目标蛋白；将SDS-PAGE后的蛋白从凝胶转移到PVDF膜上，分别用6-His抗体、日本血吸虫尾蚴感染6周的兔血清及紫外照射减毒尾蚴免疫的兔血清作一抗进行免疫印迹，将纯化后的融合蛋白作为包被抗原，检测正常兔血清及感染兔血清，对该蛋白的免疫反应性作出评价。结果 重组菌株用IPTG诱导后于48kDa处有一表达条带，该蛋白与硫氧还蛋白融合表达，带有6-His，用抗6-His抗体做免疫印迹有特异性的单一反应带，用尾蚴感染兔血清及紫外照射减毒尾蚴免疫的兔血清做免疫印迹，结果显示该目的蛋白带与以上多抗具有敏感特异的反应条带。ELISA的结果显示该蛋白与血吸虫感染兔血清具有较敏感特异的免疫反应性。结论 PA28蛋白与硫氧还蛋白融合表达后为可溶性蛋白且分子量约为48kDa。该蛋白与血吸虫感染兔血清及紫外照射减毒尾蚴免疫的兔血清具有较敏感特异的免疫反应性。     

从表达菌培养液中提取鼠疫菌重组F1抗原

目的从表达鼠疫耶尔森氏菌F1蛋白的诱导培养液中提取纯化重组F1并检测其免疫反应性。方法收集诱导培养后离心去除菌体的培养液,采用硫酸铵沉淀法和PEG浓缩法提取F1蛋白,产物经镍离子金属螯合亲和层析纯化,免疫印迹(Western blot)鉴定其免疫反应性。结果硫酸铵沉淀法和PEG浓缩法均能从培养液中提取到重组F1蛋白,产物经纯化后可与鼠疫疫苗株免疫兔血清和既往鼠疫患者血清发生特异性结合反应。结论该表达菌表达效能较高,在诱导培养液中存在大量具有免疫学活性的重组F1蛋白。     

A族链球菌表面蛋白Fba的原核表达及免疫原性分析

目的 研究A族链球菌(GAS)表面新型纤连蛋白Fba的免疫原性,探讨GAS感染机体的免疫应答机制.方法 PCR扩增fba基因,测序正确后克隆至原核表达质粒pGEX4T-2,并在E.coli BL21中表达,应用ELISA和Western印迹法鉴定目的 蛋白表达,以该蛋白作为抗原,包被酶联板,检测GAS全菌免疫鼠血清、33份抗链球菌"O"阳性患者血清.同时,将该蛋白免疫Balb/C小鼠,3次免疫后收集皿清,检测IgG效价.结果 ELISA和Western印迹证实,表达的Fba重组蛋白可与已知兔抗Fba阳性血清产生特异性反应;且Fba蛋白可与GAS全菌免疫鼠血清、抗链球菌"O"阳性患者血清发生特异性结合.Fba蛋白免疫小鼠后抗血清IgG效价达1:4800.结论 GAS感染或Fba蛋白免疫动物后均可诱导动物体产生Fba抗体,该抗体与Fba重组蛋白可产生特异性反应,提示Fba蛋白具有良好的免疫原性和抗原性.Fba蛋白可作为GAS的候选疫苗及检测GAS感染患者血清效价的重要工具.     

鼠疫耶尔森氏菌染色体上重要致病相关基因的克隆与表达

目的 在大肠杆菌中表达鼠疫耶尔森氏菌染色体编码的重要致病相关基因。方法 运用生物信息学技术对鼠疫耶尔森氏菌基因组序列信息进行分析，选定了18个与病原菌粘附、侵袭宿主细胞相关的基因为克隆与表达的目的基因。通过PCR和TA克隆技术从鼠疫耶尔森氏菌基因组中克隆了这些目的基因。上述目的基因经双酶切回收后，分别导入原核表达载体pET32a中，转化大肠杆菌BL21（DE3），用异丙基-β-D硫代半乳糖苷（IPTG）诱导后进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析和Westernblot检测蛋白表达。结果 共获得14个可经IPTG诱导的高表达的重组转化子菌株。结论 上述重组转化子菌株表达的融合蛋白经进一步纯化可进行宿主感染鼠疫耶尔森氏菌后免疫应答的研究及抗体表达谱变化的研究。这些研究不仅对于鼠疫耶尔森氏菌致病机理的研究有意义，而且在鼠疫疫苗的研制上有重要价值。     

压电免疫传感器检测日本血吸虫循环抗原的研究

通过葡萄球菌蛋白A(SPA)将从感染兔血清 (InRS)或免疫兔血清 (ImRS)中纯化的IgG抗体固定于镀金的石英晶片上 ,制成一种新型的液相压电免疫传感器 ,用于检测感染兔血清中的日本血吸虫循环抗原 (SjCAg)。分别比较了提纯前血清、部分纯化抗体和完全纯化抗体 ,以及感染和免疫兔血清纯化IgG的固定效率和检测效果。结果表明 ,以完全纯化抗体的效果最好 ,免疫兔血清纯化IgG优于感染兔血清纯化IgG。同时 ,还研究了SPA的固定浓度、检测时间、血清最适稀释度及晶体的再生性等。用该法检测了不同感染度的兔血清 ,发现频移值变化在一定范围内与感染度成正比     

不同给药时间治疗实验感染动物鼠疫的效果观察

目的观察不同给药时间治疗实验感染动物鼠疫的效果。方法新西兰兔实验感染鼠疫后用环丙沙星分别于24、48h按每日每公斤体重0.04g/kg/d、2次/d静脉注射,治疗9d后停药观察。结果两组动物治疗后,治愈率均为100%,停药后9d处死剖检动物鼠疫细菌学培养阴性。结论动物实验感染鼠疫后用环丙沙星24或48h开始治疗均能治愈。     

环丙沙星治疗家兔实验感染鼠疫疗效观察

目的观察环丙沙星治疗实验感染动物鼠疫疗效。方法实验感染鼠疫24h后的新西兰白兔按每日每公斤体重0.04g,2次静脉注射环丙沙星。结果环丙沙星治疗组动物全部治愈,停药后9d处死,鼠疫细菌学培养阴性。结论环丙沙星可用于鼠疫的临床治疗。     

基于上转发光免疫层析检测鼠疫抗体方-法的初步优化与评价

目的 优化基于上转发光免疫层析检测鼠疫抗体的方-法(YPAb-UPT-LF)并对其进行评价。方法 依据《中国生物制品规程》收录方-法改进制备的F1抗原免疫家兔,制备兔多抗作为质控品和质控带;通过筛选试纸上的最适F1抗原对YPAb-UPT-LF进行优化,再用健康人血清稀释的多种血清和多抗进行评价。结果 质控品兔抗F1抗体的ELISA效价为31.25 ~ 62.5 μg/L。优化后的YPAb-UPT-LF对质控品的检测灵敏度为1 mg/L,比之前提升了10倍;已被ELISA方-法滴定的F1疫苗接种者血清和多种鼠疫菌株兔免血清稀释100倍后均可被YPAb-UPT-LF检出,覆盖度良好;对F1免疫兔血清、兔抗EV76和羊抗EV76的检测灵敏度分别为1:40 960、1.25 mg/L、0.625 mg/L,考虑到免疫层析的样本需经10倍稀释处理,判定YPAb-UPT-LF的检测能力与ELISA基本持平。结论 本研究成功优化了YPAb-UPT-LF,为鼠疫免疫诊断和F1疫苗评估等提供了备选方-法。     

Recombinant capsular antigen (fraction 1) from Yersinia pestis induces a protective antibody response in BALB/c mice

Yersinia pestis produces a glycoprotein capsule, the biosynthesis of which appears to be temperature dependent. The fraction I (F1) component of this capsule is specific to Y. pestis and the detection of F1 antibodies is the basis for several serological tests. We report the cloning of the F1 gene and its expression in Escherichia coli using the phagemid vector lambda ZAPII and a F1-specific monoclonal antibody. The recombinant F1 antigen had a molecular weight of 17 kDa, which proved to be identical to that of the F1 antigen produced by Y. pestis. The recombinant cells produced F1 antigen at 37 degrees C but only minimal amounts at 27 degrees C, suggesting that the genetic features affected by temperature in Y. pestis may be operating in the E. coli clone. It is not known if their similar molecular weights reflect the glycosylated nature of both proteins. F1 antigen purified from the E. coli recombinant induced a protective immune response in BALB/c mice challenged with up to 10(5) virulent Y. pestis. The resistance of immunized mice to plague infection correlated with high titers of F1 antibody. The cloned gene expresses an immunogenically competent F1 antigen suitable for use in plague serodiagnostics and vaccine development.     

Experimental model to evaluate the human body louse as a vector of plague

Yersinia pestis has been found in human body lice during plague outbreaks. To evaluate the role that the human body louse plays as a vector of plague, we allowed lice to feed on rabbits made bacteremic by intravenous inoculation of 10(9) colony-forming units of 3 strains of Y. pestis. High mortality rates were observed in all lice 2 and 3 days after infection. The lice remained infected with the strains for their life span and excreted viable organisms in their feces from day 1, although they were unable to lay eggs. The lice infected with 2 virulent strains of Y. pestis transmitted the organisms during feeding to uninfected rabbits, which became septicemic and died of plague (with 1 exception) 1 day later. Infections were transmitted to naive lice that were fed on these rabbits, showing that lice can be vectors of Y. pestis in an experimental model.     

Serologic survey of the sentinel animals for plague surveillance and screening for complementary diagnostic markers to F1 antigen by protein microarray

Plague is a deadly infectious disease caused by the gram-negative bacterium, Yersinia pestis. In 2005, five plague patients were confirmed in the Yulong County of the Yunnan Province, China. In this study, the serologic survey of > 2,900 serum samples from domestic dogs and cats in and around the county, where human plague occurred, confirmed that domestic dogs and cats could serve as sentinel animals for plague surveillance. Meanwhile, the antibody responses in the infected dogs and cats were profiled by microarray containing 218 proteins of Y. pestis. In addition to F1, LcrV, YPCD1.28c, and YPO2118 induced humoral responses in all or most of the individuals, providing complementary candidates to F1 antigen for diagnostic markers of plague.