siRNA抑制人乳腺癌KLK6基因表达的实验研究

目的探讨siRNA沉默KLK6基因表达对乳腺癌细胞生长的抑制作用及其机制,为乳腺癌的基因诊断和治疗提供理论依据。方法针对KLK6 mRNA序列设计合成siRNA,构建2个重组质粒PGCsilencerTMH1/GFP/Neo/KLK6和PGCsilen-cerTMH1/GFP/Neo/Non;将重组质粒导入乳腺癌MCF-7细胞株,G418筛选获得稳定转染的细胞株;实验分为脂质体对照、阴性质粒转染对照及KLK6 siRNA重组质粒转染组,实时荧光定量PCR法检测KLK6 mRNA的表达的变化,用四甲基偶氮唑盐(MTT)法测量细胞生长情况。结果测序证实表达载体构建成功,在稳定转染重组质粒PGCsilencerTMH1/GFP/Neo/KLK6的乳腺癌MCF-7细胞株中,KLK6 mRNA抑制率(76%)明显高于阴性质粒对照组(2.7%),MCF-7细胞增殖活性显著低于阴性对照组和脂质体对照组。结论重组质粒PGCsilencerTMH1/GFP/Neo/KLK6可抑制乳腺癌细胞中KLK6基因的表达,并抑制乳腺癌细胞的生长。     

KLK6在脑胶质瘤中的表达及生物学意义

目的探讨KLK6基因在胶质瘤组织中的表达及其与临床病理特征的关系,并观察KLK6基因被沉默后胶质瘤细胞株U251的增殖活性、细胞周期和凋亡变化。方法应用RT-PCR检测39例胶质瘤切除组织及11例瘤旁组织中KLK6基因mRNA的表达量;以特异siRNA沉默胶质瘤细胞株U251的KLK6基因,CCK-8法检测细胞增殖活性,流式细胞仪（FCM）分析细胞周期和凋亡。结果 11例胶质瘤组织中KLK6mRNA表达量与其相应瘤旁组织相比表达下调（P〈0.05）,而39例胶质瘤组织中KLK6 mRNA在不同性别、病理分型、病理分级情况下表达无差异（P〉0.05）。胶质瘤U251细胞株KLK6基因被沉默后,细胞增殖活性增强（P〈0.05）,G2和S期细胞分别增加了5.14%和10.72%。结论 KLK6mRNA在胶质瘤组织表达下调,体外U251细胞株KLK6基因被沉默后细胞生长加快,提示KLK6可能对胶质瘤的生长起抑制性作用。     

卵巢癌组织KLK11基因的表达意义

目的: 探讨卵巢癌KLK11基因中的表达及临床意义. 方法: 采用RT-PCR和免疫组化技术检测48例卵巢癌组织中KLK11 mRNA及其蛋白的表达,并分析其与临床病理资料的关系. 结果: KLK11蛋白表达位于细胞质. KLK11 mRNA及蛋白的表达与临床分期有关,晚期(Ⅲ, Ⅳ期)KLK11 mRNA及蛋白的表达水平明显高于早期(Ⅰ, Ⅱ期,P＜0.05),中低分化癌KLK11 mRNA及蛋白的表达明显高于高分化癌(P＜0.05),但KLK11 mRNA及蛋白的表达与组织学类型无关. 结论: KLK11基因表达可能与卵巢癌的恶性程度有关.     

KLK11对卵巢癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响

目的:探究激肽释放酶相关肽11(KLK11)对卵巢癌细胞增殖、迁移、侵袭能力的影响。方法:qRT-PCR及Western blot技术检测卵巢癌细胞中KLK11基因的表达水平。Western blot评估siRNA特异性抑制KLK11在A2780和HO8910细胞株中表达的抑制效率。CCK-8、划痕实验及Transwell实验检测KLK11对卵巢癌细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响。Western blot检测卵巢癌细胞中上皮-间质转化(EMT)相关蛋白E-钙黏蛋白(E-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)、锌指转录因子(Snail)的表达水平。结果:与人正常卵巢上皮细胞相比,KLK11在卵巢癌细胞株中表达上调(P<0.01);与Control组相比,si-KLK11组卵巢癌细胞中KLK11蛋白表达降低(P<0.01),卵巢癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力被抑制(P<0.01);同时,si-KLK11组A2780和HO8910细胞中Vimentin、Snail蛋白表达水平均下调(P<0.01),而E-cadherin蛋白表达水平上调(P<0.01)。结...     

KLK10蛋白在上皮性卵巢癌中的表达及意义

目的：探讨KLK10蛋白在上皮性卵巢癌中的表达及临床意义。方法：应用免疫组化法检测10例上皮性卵巢良性、12例交界性和45例恶性肿瘤中KLK10蛋白的表达，分析KLK10表达与上皮性卵巢癌临床病理及生存状态的关系。结果：（1）在上皮性卵巢良性、交界性和恶性肿瘤组织中KLK10表达的阳性率分别为10％、58.33％和86．67％，3组间阳性率和阳性级别比较差异均有统计学意义（P〈0．05）；（2）KLK10表达的阳性率和表达强度在晚期组高于早期组，中低分化组高于高分化组，有淋巴结转移组高于无淋巴结转移组，生存时间〈5年组高于≥5年组，各组间比较差异均有统计学意义（P〈0．05）。结论：（1）KLK10蛋白在上皮性卵巢良性、交界性和恶性肿瘤细胞中表达的阳性率和表达强度呈逐渐升高。（2）KLK10蛋白在上皮性卵巢癌中的表达与临床分期、病理分级、淋巴结转移和5年生存率有关。     

siRNA沉默X连锁凋亡抑制蛋白基因逆转人耐紫杉醇卵巢癌细胞耐药性的体内研究

  目的  探究小干扰RNA（siRNA）沉默X连锁凋亡抑制蛋白（XIAP）基因表达对人耐紫杉醇卵巢癌细胞耐药性的逆转。  方法  36只BALB/C-nu雌性裸鼠皮下接种人耐紫杉醇卵巢癌细胞株A2780/T,建立耐紫杉醇卵巢癌裸鼠移植瘤模型,再随机分为6组(每组6只),A组:生理盐水组;B组:紫杉醇组;C组:siRNA-阴性对照（siRNA-NC）+生理盐水组;D组:siRNA-NC+紫杉醇组;E组:siRNA-XIAP+生理盐水组;F组:siRNA-XIAP+紫杉醇组。待接种处形成粟粒大小的移植瘤时,C～F组于瘤体处注射 siRNA-XIAP或siRNA-NC,注射剂量为每次每只裸鼠10 μg,每3 d注射1次,共注射9次。在D、F组第1次siRNA干扰后开始按裸鼠体质量给予2 mg/kg紫杉醇（C、E组注射生理盐水）,每周1次,0.2 mL/次,腹腔内注射,共注射4次。A、B组不给予siRNA干扰,只进行紫杉醇或者生理盐水腹腔注射。siRNA处理27 d后处死裸鼠,取出瘤体测质量,计算抑瘤率;采用实时荧光定量PCR和Western blot分别检测各组移植瘤细胞中XIAP的基因和蛋白表达水平;TUNEL法检测各组移植瘤细胞的凋亡情况。  结果  转染阴性对照序列的生理盐水治疗（C组）抑瘤率最低、肿瘤质量最高、治疗效果最差,仅使用紫杉醇治疗（B组）、仅转染阴性对照序列的紫杉醇治疗组（D组）、仅沉默XIAP而不使用紫杉醇治疗（E组）三者效果相当,沉默XIAP且使用紫杉醇治疗组（F组）抑瘤率最高,治疗效果最好（P<0.05）。沉默XIAP后,F组与E组XIAP的基因和蛋白表达低于A～D组（P<0.05）。细胞凋亡指数:F组最高,A组及C组最低（P<0.05）。  结论  XIAP的沉默可逆转人耐紫杉醇卵巢癌细胞的耐药,增强紫杉醇的治疗效果。     

KLK10蛋白和骨桥蛋白在上皮性卵巢癌中的表达及意义

目的:研究KLK10蛋白和骨桥蛋白(OPN)在上皮性卵巢癌中的表达及临床意义。方法:应用免疫组化法检测10例上皮性卵巢良性、12例交界性和45例恶性肿瘤中KLK10蛋白和OPN的表达,分析KLK10蛋白和OPN表达与上皮性卵巢癌临床病理及生存状态的关系,并分析KLK10蛋白和OPN表达的相关性。结果:在上皮性卵巢良性、交界性和恶性肿瘤组织中KLK10蛋白表达的阳性率分别为10%、58.33%和86.67%;OPN表达的阳性率分别为0%、41.67%和71.11%;两者三组间阳性率和阳性级别比较均有统计学意义(P<0.05);KLK10蛋白和OPN表达的阳性率和表达强度在晚期组高于早期组,中低分化组高于高分化组,有淋巴结转移组高于无淋巴结转移组,生存时间<5年组高于≥5年组,各组之间KLK10蛋白和OPN表达阳性率及阳性级别比较均有统计学意义(P<0.05)。KLK10蛋白和OPN在上皮性卵巢癌中表达呈正相关。结论:KLK10蛋白和OPN在上皮性卵巢良性、交界性和恶性肿瘤细胞中表达的阳性率和表达强度逐渐升高。KLK10蛋白和OPN在上皮性卵巢癌中的表达与临床分期、病理分级、淋巴结转移和5年生存率有关。KLK10...     

KLK11在卵巢肿瘤组织中的表达及其临床相关性

目的探讨KLK11基因在卵巢癌组织中的表达状况。方法应用免疫组织化学检测KLK11在卵巢癌组织、良性卵巢肿瘤组织及正常卵巢组织中的表达状况。结果 KLK11蛋白在正常卵巢上皮细胞中均有表达;KLK11在卵巢癌组织中的表达均低于其在正常卵巢组织和良性卵巢肿瘤组织的表达(P=0.016,P=0.013);KLK11在浆液性卵巢癌组织的表达高于其他类型的卵巢癌组织(P=0.045,P=0.012);早期卵巢癌组织中(Ⅰ/Ⅱ期)KLK11的表达明显高于晚期卵巢癌(Ⅲ/Ⅳ期)(P=0.002,P=0.010);KLK11在卵巢癌组织的表达水平与肿瘤的病理分级无明显关系(P=0.510,P=0.747);KLK11表达与卵巢癌淋巴结转移等预后因素有明显相关性(P=0.027);KLK11阳性与阴性患者的平均生存时间分别为39.3个月和28.9个月(P=0.031)。结论 KLK11在卵巢癌组织中表达下调,且其表达与卵巢癌的临床分期以及淋巴结转移有相关性,提示KLK11的表达失调可能对卵巢癌的诊断及预后有一定价值。     

抑制人PC4基因表达的siRNA载体的构建与筛选

目的 构建和筛选能高效、特异性抑制人转录辅助调控因子4( positive coactivator4,PC4)基因表达的siRNA载体。方法设计并合成人PC4基因特异性的4对siRNA干扰靶点,分别克隆入pSES-HUS腺病毒穿梭质粒,构建重组pSES-HUS-PCi1,pSES-HUS-PCi2,pSES-HUS-P...     

KLK10基因表达增强能够降低人舌癌细胞的增殖和侵袭能力

目的探讨人组织激肽释放酶10（KLK10）对舌癌Tca8113细胞增殖和侵袭力的影响。方法运用分子生物学技术,构建真
核表达载体pIRES2-EGFP-KLK10,转染Tca8113细胞,分别用RT-PCR、Western blot检测KLK10mRNA及蛋白表达水平。
MTS细胞生长实验检测细胞增殖的变化;Transwell小室细胞侵袭实验检测细胞侵袭能力的变化。结果pIRES2-EGFP-KLK10
转染Tca8113细胞获得稳定细胞株,与空白对照组及空载体组比较,KLK10mRNA及蛋白表达水平均明显增高,KLK10增强表
达的舌癌细胞增殖和侵袭能力均明显减弱（P<0.05）。结论KLK10表达增强能够降低人舌癌细胞的增殖和侵袭能力。KLK10
基因可能成为肿瘤治疗上有前途的分子靶点。
     

大鼠IL-6基因siRNA表达载体的构建

目的:构建具有特异性阻断大鼠白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)基因的小干扰RNA(small interfe-rening RNA,si RNA)表达载体。方法:应用si RNA设计软件在大鼠IL-6基因的mRNA上寻找特异性的短核苷酸序列,并设计合成两条互补小发夹结构的DNA序列,经退火后形成双链DNA片段,采用基因克隆技术,将其克隆到pSilencerTM1.0-U6的载体中,转化DH5α大肠杆菌,提取质粒,酶切方法和测序法对重组体进行鉴定。结果:酶切和测序结果表明,成功构建了大鼠IL-6基因的si RNA表达载体。结论:成功构建了si RNA表达载体,为今后利用RNAi技术在大鼠动物模型上研究疾病的发病机理、药物作用靶点提供先进的技术平台。     

卵巢上皮性肿瘤组织中人组织激肽释放酶15和CA125蛋白的表达

目的:检测卵巢上皮性肿瘤组织中人组织激肽释放酶15(KLK15)和CA125蛋白的表达.方法:采用免疫组化SP法检测10例正常卵巢组织、18例卵巢良性肿瘤组织、16例卵巢交界性肿瘤组织和64例卵巢恶性肿瘤组织中KLK15与CA125蛋白的表达.结果:上述4种组织中KLK15蛋白的阳性表达率分别为10.0%、16.7%、62.5%和64.1%,4种组织相比,差异有统计学意义(χ2=20.432,P＜0.001);4种组织中CA125蛋白的阳性表达率分别为0.0%、5.6%、37.5%和71.9%,4种组织相比.差异有统计学意义(χ2=37.448,P＜0.001).KLK15蛋白的表达与卵巢癌患者的临床分期、病理分级及淋巴结转移有关(χ2=3.90,P=0.048;χ2=4.84,P=0.028;χ2=5.49,P:0.019).CA125蛋白的表达与卵巢癌患者的病理类型有关(χ2=37.49,P＜0.001).卵巢浆液性癌组织中KLK15与CA125蛋白的表达有火联(rp=0.334,P=0.033).结论:KLK15蛋白对卵巢上皮性癌的诊断具有一定的价值,可能作为其预后判断的指标.KLK15与CA125蛋白联合检测可能有助于提高卵巢上皮性癌诊断的准确性.     

HER-2／neu·siRNA表达载体的构建及对人乳腺癌细胞株的影响

目的：探讨siRNA对人乳腺癌细胞株SK—BR-3的HER-2／neu基因表达的影响。方法：以HER-2／neu mRNA序列为模板设计合成2对siRNA序列,构建pGenesil-1-HER-2／neusiRNA重组质粒,转化感受态的大肠杆菌,质粒酶切、测序鉴定。转染SK—BR-3细胞48h后,提取RNA进行RT—PCR,采用方差分析（ANOVA）,分析RNA干扰效应。结果：成功构建了pGenesil-1-HER-2／neu siRNA重组质粒,成功转染SK—BR-3细胞。重组质粒抑制HER-2／neu基因的表达接近54．45％（P=0．000）。结论：HER-2／neu siRNA重组质粒明显下调HER-2／neu基因在乳腺癌细胞中的表达。     

PTTG靶向siRNA表达载体构建及其沉默效率评价

目的：构建针对人脑胶质瘤细胞系U251的高效率沉默垂体瘤转化基因(PTTG)的小分子干扰RNA(siRNA)表达载体。 方法：合成特异性干扰PTTG 的siRNA片段,并与pGenesil2 载体连接,构建PTTG干扰载体（pGenesil2-PTTG siRNA）。利用脂质体将其转染U251细胞,分为正常细胞对照组、HK阴性对照组和3个siRNA干扰组（pGenesil2-PTTG siRNA1、pGenesil2-PTTG siRNA2和pGenesil2-PTTG siRNA3）,应用半定量逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)法和流式细胞术对转染后U251细胞中PTTG 的mRNA和蛋白表达水平进行分析。 结果：酶切证实PTTG-siRNA表达载体构建成功,插入片段测序结果与合成的siRNA结果一致;转染pGenesil2-PTTG siRNA后,3个干扰组的U251 细胞中PTTG基因和蛋白表达水平均较正常对照组显著降低（P<0.01）。 结论：成功构建了能高效率沉默PTTG 的RNAi表达载体;pGenesil2-PTTG siRNA高效地抑制了胶质瘤U251细胞中PTTG基因的表达。     

量子点标记人舌癌细胞survivin siRNA的研究

目的　研究量子点标记人舌癌Tca8113细胞survivin siRNA的方法,为后期以量子点为载体转染siRNA进行基因沉默的研究提供理论依据及技术支持。方法 表面带正电荷的水溶性量子点,通过正负电荷的吸引力与表面带负电荷的survivin siRNA结合, 在siRNA定量的基础上改变量子点的量,取三种比例进行试验,并设立阳性对照组、阴性对照组,通过琼脂糖凝胶电泳观察siRNA条带的亮度分析量子点标记siRNA的最佳比例。结果 实验组的siRNA条带亮度均比阳性对照组小,其中实验组3的siRNA条带亮度最小且与阴性对照组接近,说明该组中量子点与siRNA结合最佳。结论 量子点标记人舌癌Tca8113细胞survivin siRNA的最佳比例为1:2,且该比例在量子点的安全使用范围内。     

靶向P75的siRNA对人乳腺癌细胞增殖和凋亡的影响

目的 构建P75特异小干扰RNA(siRNA)表达载体,并观察其对神经生长因子(NGF)促乳腺癌细胞生长及凋亡的影响.方法 通过GenBank提供的P75 mRNA序列,设计3对能转录短发夹状RNA的DNA序列,构建pSilencerTM4.1-CMV neo质粒重组载体,转染乳腺癌SKBR3细胞;通过实时荧光定量PCR和Western blot筛选RNA干扰效果最强的干扰片段;以此干扰片段转染至乳腺癌SKBR3细胞,利用G418筛选稳定表达P75-siRNA的SKBR3细胞株,命名为P75-siRNA;MTT检测P75干扰后NGF对细胞增殖作用的影响;流式细胞术检测细胞凋亡;建立荷乳腺癌小鼠模型,观察P75干扰后对小鼠肿瘤生长和凋亡相关蛋白表达的影响.结果 序列测定表明成功构建P75-siRNA表达载体,实时荧光定量PCR和Western blot检测结果显示P75 mRNA和蛋白表达下调,尤以P75 2-siRNA干扰片段效果显著;MTT检测显示,NGF能刺激细胞增殖,与NGF组相比,P75-siRNA干扰后细胞增殖率均明显增高(P＜0.05);与空白对照组相比,NGF+ P75-siRNA组和NGF组的细胞凋亡率明显降低(P＜0.05),NGF+ P75-siRNA组更为明显;荷乳腺瘤小鼠中,P75-siRNA组小鼠的肿瘤生长明显超过未转染组和空载体转染组(P＜0.05),且P75-siRNA组Caspase-3表达下降,Bcl-2表达增加,Bax表达下降(P＜0.05).结论 P75特异干扰表达载体能有效降低P75的表达,增强NGF促乳腺癌SKBR3细胞的增殖作用和抗凋亡作用,从而使肿瘤生长更为明显.