锌铁调控蛋白4cDNA片断的获得及mRNA表达

目的获得锌铁调控蛋白4(ZRT，IRT-like protein 4．ZIP4)cDNA片断，并了解ZIP4 mRNA在小鼠各组织中的表达情况。方法用反转录多聚酶链反应法(RT—PCR)获得ZIP4 cDNA片断并比较ZIP4 mRNA在各组织中的表达量。结果RT—PCR获得单一条带的片断。其大小475bp，并经测序确认；在小肠、肝、睾丸等组织中检测到ZIP4 mRNA表达，其中小肠表达量最高，心、脾、脑、肾、肺等组织中未见ZIP4 mRNA表达。结论获得ZIP4 cDNA片段；ZIP4主要表达于小肠，提示ZIP4可能在锌吸收中具有重要作用。     

锌对原代培养海马神经元MT mRNA表达的影响

目的　为探讨神经元锌内稳态机制。方法　采用实时荧光定量RT PCR法检测 :原代培养大鼠海马神经元 10 0 μmol L锌诱导后 ,不同时间点 (0、2、4、6和 8h)MT1 MT2 MT3mRNA的表达 ;及 0、5 0、75、10 0、12 5、15 0 μmol L锌诱导 4h后 ,各浓度组MT1 MT2 MT3mRNA的表达。 结果　基础状态下 ,MT的三个异构体在海马神经元内的表达峰度为 :MT3>MT1>MT2 ;在 0～ 10 0 μmol L范围内 ,MT1、MT2mRNA的表达随锌浓度增加而显著增加 ,锌浓度进一步增加时 ,MT1、MT2mRNA的表达进入平台期 ;MT3mRNA的表达随锌浓度的升高而下降 ;锌可显著上调MT1和MT2mRNA表达 ,峰值时间点在 6h左右 ;锌可使MT3mRNA的含量降低约6 0 %。结论　除MT3mRNA外 ,MT1和MT2mRNA在神经元内也有表达 ;象神经胶质细胞一样 ,神经元同样可通过增加MT1和MT2mRNA的表达以维持锌内稳态     

皮质酮对海马HT-22细胞株锌含量的影响及机制研究

目的通过观察皮质酮(corticosterone,CORT)对海马HT-22细胞总锌含量的影响,对其可能机制进行探讨,为研究应激相关疾病提供实验依据。方法小鼠海马神经元HT-22细胞株,经10μmol/L CORT处理6h后,采用原子吸收分光光度计火焰法测定胞内总锌含量,并采用实时荧光定量PCR法检测MT1、MT3、ZnT1、ZnT3和ZIP1m RNA表达。结果与对照组相比,10μmol/L CORT处理HT-22细胞6h后,HT-22细胞内总锌含量显著下降,而先于CORT处理前加入糖皮质激素受体阻断剂RU486组总锌含量与对照组无明显变化。与对照组相比,CORT组HT-22细胞MT1、MT3、ZnT1、ZnT3、ZIP1 mRNA表达水平上升,而先于CORT处理前加入糖皮质激素受体阻断剂RU486组上述基因mRNA表达均无明显变化。结论 CORT可影响海马HT-22细胞锌稳态调节分子的表达,进而影响细胞锌稳态失衡。     

锌对体外海马神经细胞MEK/ERK信号通路的调控作用研究

目的探讨锌对海马神经细胞MEK/ERK通路的调控机制。方法将原代培养乳鼠海马神经细胞分为3组。(1)对照组(Control组):不加任何处理因素。(2)四吡啶甲基乙二胺[N,N,N',N'-tetrakis(2-pyridylmethyl)ethylenediamine,TPEN]干预组(TPEN组):2μmol/L TPEN处理海马神经细胞24h,以诱导海马神经细胞缺锌。(3)TPEN+5μmol/L Zn组:同时加入终浓度为2μmol/L TPEN及5μmol/L的Zn SO4。采用Western-Blot法检测pMEK,perk,Total-MEK、Total-ERK蛋白表达;免疫荧光法检测细胞内[Ca~(2+)]_i浓度;分子探针DCFH-DA检测细胞内活性氧(ROS)含量。结果 (1)与对照组比较,TPEN组海马神经细胞上清液中LDH活性明显升高(P0.05);加入5μmol/L Zn后LDH活性显著降低(P0.05)。(2)与对照组比较,TPEN组pMEK及pERK蛋白表达均明显下降(P0.05);5μmol/L Zn可明显抑制TPEN诱导的海马神经细胞pMEK及pERK蛋白表达的降低(P0.05)。(3)与对照组比较,TPEN组细胞内[Ca~(2+)]_i浓度及ROS水平明显升高(P0.05);5μmol/L Zn能明显抑制细胞内[Ca~(2+)]_i及ROS水平的升高(P0.05)。结论缺锌可下调海马神经细胞MEK/ERK信号通路,其作用机制可能与细胞内[Ca~(2+)]_i及ROS的调控有关。     

锌对HL-60细胞凋亡及p53等基因表达影响

目的研究微量元素锌在体外对HL-60细胞凋亡的作用机制。方法HL-60细胞常规培养24h，分为对照组、四吡啶甲基乙二胺N，N，N＇，N＇-tetrakis（2-pyridylmethyl）ethylenediamine（TPEN）处理组、TPEN＋ZnSO4组。以细胞形态学改变、流式细胞仪和DNA凝胶电泳分析为凋亡观察指标，并用mRNA狭缝杂交和Western-blot测定细胞凋亡相关基因的改变。结果细胞内Zn^2＋减少可诱导人髓性细胞白血病细胞系HL-60凋亡，引起bcl-2、c-myc mRNA及蛋白的表达降低，补充ZnSO4（终浓度为20μmol／L）可改善上述现象。结论细胞内Zn^2＋减少诱导HL-60细胞凋亡过程与细胞内下调bcl-2、c-mvc基因的表达有关。     

无机砷对Chang肝细胞株血红素单加氧酶-1 mRNA和蛋白表达的诱导作用

[目的]观察亚砷酸钠（sodium arsenite,NaAsO2）对Chang肝细胞株血红素单加氧酶-1（heme oxygenase-1,HO-1）mRNA和蛋白表达的诱导作用。[方法]以5μmol／L和10μmol／L的NaAsO2作用Chang肝细胞株2、6、12h和24h,分别用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）和Western Blot法检测细胞内HO-1的mRNA和蛋白表达情况。[结果]5μmol／L和10μmol／LNaAs02暴露2h开始出现HO-1mRNA的诱导表达;6h的表达水平明显高于对照组和2h暴露组（P〈0．01）。其中,10μmol／LNaAsO2暴露12h和24h的mRNA表达均明显高于该浓度的6h暴露组（P〈0．01）;但24h的HO-1 mRNA表达水平与12h组相比没有明显升高。NaAsO2暴露诱导的HO-1蛋白表达则从6h开始出现,12h组明显高于6h组,24h组明显高于12h组（均P〈0．01）;5μmol／L和10μmol／L NaAsO2分别暴露6、12h和24h的HO-1蛋白表达量分别是对照组的2．80、9．34、18．15和3．97、12．92、23．29倍;此外,10μmol/LNaAsO2暴露12h和24h的HO-1 mRNA和蛋白表达均明显高于对应时间的5μmol／L组（P〈0．01）。[结论]NaAsO2暴露能够有效和持续性诱导Chang肝细胞株HO-1的mRNA和蛋白表达,是无机砷暴露的一种细胞保护性适应性反应。     

高锌与缺锌对鼠胶质瘤细胞野生型-p53 mRNA表达的影响

野生型－p53(wt-p53)作为关卡基因在DNA受损伤时使细胞停止在G1期，使受损细胞修复或发生细胞凋亡，本研究利用RT0PCR法研究高Zn^2 ,缺Zn^2 作用24小时后对鼠胶质瘤细胞wt-p53 mRNA表达的影响，取对数生长期的鼠胶质瘤细胞，在RPMI－1640常规培养液中分别加入0．3mmol/L的Zn^2 和5μmol/L的TPEN培养24h后发现0．3mmol/L的Zn^2 作用24小时抑制鼠胶质细胞wt-p53表达，5μmol/L的TPEN作用24小时鼠胶质瘤细胞wt-p53mRNA表达水平升高，这表明高Zn^2 抑制鼠胶质瘤细胞wt-p53RNA表达，缺Zn^2 可提高 鼠胶质瘤细胞wt-p53RNA表达水平。     

缺锌致海马神经细胞损伤的表观遗传机制初探

目的观察锌缺乏致原代培养的大鼠海马神经细胞损伤中DNA甲基化及组蛋白去乙酰化相关酶的变化,对缺锌致海马神经细胞损伤的表观遗传机制进行初探。方法将原代培养的大鼠海马神经细胞随机分为对照(control);缺锌[四吡啶甲基乙二胺,N,N,N',N'-tetrakis(2-pyridylmethyl)ethylenediamine,TPEN];补锌5和50μmol/L(TPEN+5μmol/L Zn SO_4,TPEN+50μmol/L Zn SO_4)4组,除对照组不加任何处理外,其余3组分别在培养液中加入2μmol/L TPEN,补锌组则对应加入5和50μmol/L Zn SO_4,作用24h。MTT法检测细胞存活率;免疫酶学法检测HDAC活性;RT-PCR法检测DNA甲基转移酶(DNMT3a、DNMT3b)及组蛋白去乙酰化酶HDACs(HDAC1、HDAC2、HDAC3)的m RNA表达水平。结果与对照组比较,(1)缺锌组海马神经存活率明显降低(P0.05);5μmol/L补锌和50μmol/L补锌均可显著抑制TPEN诱导的细胞存活率降低(P0.05)。(2)缺锌组海马神经细胞内DNMT1 m RNA的表达明显上调,DNMT3a m RNA的表达明显下调(P0.05),而5μmol/L补锌组或50μmol/L补锌组均能够显著抑制TPEN诱导的DNMT1 m RNA和DNMT3a m RNA表达异常(P0.05)。与对照组比较,缺锌组海马神经细胞内DNMT3b m RNA的表达无明显变化(P0.05),与对照组比较,50μmol/L补锌后,DNMT3b m RNA表达明显上调(P0.05)。(3)缺锌组海马神经细胞内HDAC活性及HDAC2的m RNA表达明显升高(P0.05),HDAC1及HDAC3 m RNA的表达无明显变化(P0.05);补锌能显著抑制TPEN诱导的HDAC活性及HDAC2 m RNA表达异常(P0.05)。结论细胞内缺锌诱导海马神经细胞损伤,造成DNA甲基化和组蛋白去乙酰化修饰的改变。     

锌与金雀异黄素对小鼠胚胎肢芽的影响

[目的]研究锌与金雀异黄素对软骨发育分化的影响。[方法]利用12d小鼠胚胎肢芽体外培养方法,在培养基中分别加入10-7～10-5mol/L不同含量的金雀异黄素以及在加入10-5mol/L金雀异黄素的同时加ZnSO450μmol/L和70μmol/L,并设对照组,培养3d后,收获肢芽用原位杂交的方法测量肢芽软骨细胞II型胶原mRNA及BMP-2mR-NA的表达水平以及IL-6的表达水平。[结果]体外培养3d的肢芽在金雀异黄素(10-5mol/L)组与金雀异黄素(10-5mol/L)加ZnSo4组的II型胶原mRNA及BMP-2mRNA阳性表达密度与积分光密度显著高于对照组;体外培养3d的IL-6表达水平在金雀异黄素(10-5mol/L)组与金雀异黄素(10-5mol/L)加ZnSo4组显著低于对照组。[结论]锌与金雀异黄素在一定浓度下能协同促进胚胎肢芽软骨细胞BMP-2mRNA及II型胶原mRNA的表达,以及降低IL-6的表达水平,促进发育中软骨面积的增加,具有刺激胚胎软骨发育分化的作用。     

镉诱导PC-3细胞金属硫蛋白和锌转运体的基因表达

[目的]研究镉对前列腺癌PC-3细胞中金属硫蛋白(Metalllothionein,MT)和锌转运体(Zinctransporter,ZnT)基因表达的影响。[方法]0、10、20、40、80和100μmol/L氯化镉处理PC-3细胞,细胞存活率用噻唑蓝(MTT)方法检测;MT-1F、MT-1X、MT-2A和ZnT-1基因的mRNA表达用RT-PCR进行检测。[结果]氯化镉(≥40μmol/L)对PC-3细胞具有明显的抑制生长作用(P<0.05)。MT-1F和MT-2A的mRNA水平在5μmol/L氯化镉诱导时表达水平达最高,随着氯化镉浓度的增高mRNA的表达呈下降趋势。MT-1X的mRNA表达水平随氯化镉浓度增加呈不断上升趋势,在40μmol/L表达水平为最高。ZnT-1的mRNA在10μmol/L氯化镉诱导表达水平为最高,随着氯化镉浓度的增高mRNA表达呈下降趋势。[结论]镉可诱导PC-3细胞MT-1F、MT-1X、MT-2A和ZnT-1基因mRNA表达增高。     

小鼠ZnT3 cDNA片断的克隆及其mRNA表达

为了解ZnT3(zinc transporter3)mRNA在小鼠各组织中的表达状况，用反转录多聚酶链反应法（RTPCR）克隆ZnT3 cDNA片段，荧光标记的全自动测序法确定ZnT3 cDNA片断的减基顺序，RT－PCR法检测小鼠各组织ZnT3mRNA表达并比较在组织中的表达量，结果：RT－PCR获得单一条带的片断，其大小700bp，碱基顺序与文献报道序列一致，在大脑皮层，海马和睾丸中检测到ZnT3 mRNA表达，其中睾丸中表达量最高，大脑皮层，海马表达量无显著性差别，心，肝脾，肺，肾，小肠及嗅球，小脑等组织中未见ZnT3 mRNA表达，说明克隆到正确的ZnT3 cDNA片断，ZnT3 mRNA主要表达于睾丸，大脑皮层，海马，提示ZnT3可能在脑功能和生殖功能中具有重要作用。     

Effects of intracellular zinc depletion on the expression of VDAC in cultured hippocampal neurons

An experiment was conducted to investigate whether intracellular zinc depletion can actually change expression of voltage-dependent anion channel 1 (VDAC1) and VPAC2 in cultured hippocampal neurons as well as their significance. Hippocampal neurons were obtained by primary culture from hippocampus of newborn Wistar rats. Cultured hippocampal neurons were exposed to a cell membrane-permeable zinc chelator N,N,N',N'-tetrakis (2-pyridyl methyl) ethylenediamine (TPEN) (2 μM), and to TPEN plus zinc sulfate (5 μM) for 1 or 24 hours. Cultures were then processed to detect neuronal injury by lactate dehydrogenase (LDH) assay, intracellular Ca(2+) with the fluorescent probe fluo-3/AM, reactive oxygen species (ROS) generation using 2',7'-dichlorofluorescein diacetate (DCFH-DA) assay, nuclear morphology by Hoechst 33342, VDAC1, and VDAC2 protein levels by western blot, and VDAC1 and VDAC2 mRNA levels by RT-PCR. The results demonstrated that exposure of hippocampal neurons to TPEN (2 μM) for 24 hours induced notably neuronal injury, significantly increased the number of apoptotic nuclei, up-regulated the expression of VDAC1 protein level and down-regulated the expression of VDAC2 protein level. Significant down-regulation of mRNA levels for VDAC1 and VDAC2 were observed in TPEN-treated neurons. Co-addition of zinc almost completely reversed TPEN-induced neuronal injury and above alterations in VDAC1 and VDAC2 protein levels and mRNA levels. Present results implicate a possibility that up-regulation of VDAC1 and down-regulation of VDAC2 may participate in hippocampal neuron injury induced by zinc deficiency.     

Investigation of lymphocyte gene expression for use as biomarkers for zinc status in humans

A bioassay for zinc status in humans has been sought due to the importance of zinc, an essential trace metal, for many divergent functions in the human body; however, a sensitive bioassay for zinc status in humans is lacking. To address this issue, we established gene expression profiles of human lymphoblastoid cells treated with 0 or 30 micro mol/L ZnSO(4) using microarray technology. A limited number of genes were responsive to 30 micro mol/L zinc based on the analysis of Affymetrix human genome U133A GeneChips. We also examined the gene expression patterns of zinc transporters in human lymphoblastoid cells using quantitative RT-PCR analysis. ZNT1 was upregulated in lymphoblastoid cells, whereas ZIP1 was downregulated in response to the increased zinc concentrations in the culture media. To evaluate the potential applications of using both zinc transporter genes as biomarkers of zinc status, we measured the expression levels of ZIP1 and ZNT1 in the peripheral leukocytes collected from 2 different age groups of Korean women. After administration of a zinc supplement (22 mg zinc gluconate/d for 27 d), ZIP1 expression decreased by 17% (P < 0.01) and 21% (P < 0.05) in the peripheral leukocytes collected from 15 young (20-25 y) and 10 elderly (64-75 y) subjects, respectively. ZNT1 expression was not affected by taking the zinc supplement. These data suggest a potential application of ZIP1 as a biomarker of zinc status in humans.     

锌对热应激大鼠垂体POMC mRNA表达的影响

目的：通过锌对热应激大鼠垂体阿黑皮素原（ＰＯＭＣ）ｍＲＮＡ表达的影响研究，探讨锌对热应激大鼠的保护机理。方法：２０只ＳＤ雄性大鼠随机等分４组，即高锌高温暴露组（Ａ组）、中锌高温暴露组（Ｂ组）、低锌高温暴露组（Ｃ组）和正常锌室温对照组（Ｄ组）。在ＡＩＮ－９３Ｍ饲料配方基础上，以碳酸锌为锌源，配制成高锌、中锌、低锌和正常锌饲料，每公斤饲料锌含量测定值分别为９２．２ｍｇ、４５．６１ｍｇ、２１．７０ｍｇ和４５．６１ｍｇ。４组大鼠在室温下饲以相应饲料１４天后，将Ａ、Ｂ、Ｃ组大鼠置于高温室（Ｔｄｂ４０℃，Ｔｗｂ３０．８℃）中连续暴露３小时。用Ｎｏｒｔｈｅｒｎｂｌｏｔ杂交分析法（探针为地高锌标记的ＰＯＭＣｃＲＮＡ），观察垂体ＰＯＭＣｍＲＮＡ表达水平。结果：（１）高温应激可使大鼠垂体ＰＯＭＣｍＲＮＡ表达水平增高；（２）高锌摄入可使热应激大鼠垂体ＰＯＭ－ＣｍＲＮＡ表达水平升高，而低锌摄入则相反。结论：锌对热应激大鼠垂体ＰＯＭＣ基因有调控作用，作用环节可能在转录水平上     

Effects of intracellular zinc depletion on the expression of VDAC in cultured hippocampal neurons

Abstract

An experiment was conducted to investigate whether intracellular zinc depletion can actually change expression of voltage-dependent anion channel 1 (VDAC1) and VPAC2 in cultured hippocampal neurons as well as their significance. Hippocampal neurons were obtained by primary culture from hippocampus of newborn Wistar rats. Cultured hippocampal neurons were exposed to a cell membrane-permeable zinc chelator N,N,N′,N′-tetrakis (2-pyridyl methyl) ethylenediamine (TPEN) (2 µM), and to TPEN plus zinc sulfate (5 µM) for 1 or 24 hours. Cultures were then processed to detect neuronal injury by lactate dehydrogenase (LDH) assay, intracellular Ca²⁺ with the fluorescent probe fluo-3/AM, reactive oxygen species (ROS) generation using 2′,7′-dichlorofluorescein diacetate (DCFH-DA) assay, nuclear morphology by Hoechst 33342, VDAC1, and VDAC2 protein levels by western blot, and VDAC1 and VDAC2 mRNA levels by RT–PCR. The results demonstrated that exposure of hippocampal neurons to TPEN (2 µM) for 24 hours induced notably neuronal injury, significantly increased the number of apoptotic nuclei, up-regulated the expression of VDAC1 protein level and down-regulated the expression of VDAC2 protein level. Significant down-regulation of mRNA levels for VDAC1 and VDAC2 were observed in TPEN-treated neurons. Co-addition of zinc almost completely reversed TPEN-induced neuronal injury and above alterations in VDAC1 and VDAC2 protein levels and mRNA levels. Present results implicate a possibility that up-regulation of VDAC1 and down-regulation of VDAC2 may participate in hippocampal neuron injury induced by zinc deficiency.     

不同锌营养状况对大鼠铁代谢的影响

目的研究不同锌营养状况对大鼠铁代谢和肝脏铁调节蛋白(IRP)mRNA、铁蛋白(Fn)mRNA及转铁蛋白受体(TfR)mRNA的影响。方法 40只雄性SD大鼠按体重随机分为4组,每组10只,铁和锌正常对照组(ZA组),铁正常锌缺乏组(ZD组),铁和锌正常配饲组(PF组),铁正常锌过量组(ZE组)。喂饲8周后麻醉处死,取大鼠肝脏、脾脏和血清,测定血红蛋白,血清锌、血清铁、血清转铁蛋白受体、血清铁蛋白、肝脏铁和锌含量、脾脏铁和锌含量,并用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法检测各组大鼠IRP2 mRNA和肝脏TfR mRNA以及Fn mRNA的表达水平。结果与对照组相比,锌过量使肝脏和脾脏铁含量、血清铁水平显著降低(P<0.05);锌缺乏使肝脏铁含量、血清转铁蛋白受体水平显著增高(P<0.05),同时,血清铁水平显著降低(P<0.05);锌缺乏时肝脏IRP mRNA及TfR mRNA表达显著增强。结论锌缺乏可能通过影响铁吸收、储存、转运来影响体内铁的营养状况。锌缺乏通过改变IRP2表达、IRP-RNA结合活性,在转录后水平改变TfR mRNA和FnmRNA表达,影响铁稳态。     

锌缺乏对生长期大鼠免疫细胞凋亡的影响

目的: 观察饲料锌缺乏对生长期大鼠免疫细胞凋亡的影响,并探讨其分子机制。方法: 通过喂食锌含量不同的饲料,构建生长期缺锌大鼠模型;TUNEL方法原位检测胸腺、脾脏组织淋巴细胞凋亡,半定量RT-PCR方法检测一对凋亡调控基因bcl-2/bax mRNA的表达。结果: 与锌充足组(ZA)和配饲组(PF)相比,缺锌组(ZD)大鼠胸腺、脾脏淋巴细胞凋亡增多,促凋亡基因bax mRNA表达增高,补锌后上述改变可得到恢复。结论: 饲料锌缺乏导致发育中和成熟的淋巴细胞凋亡增多,凋亡调控基因bcl-2/bax表达失衡是重要机制之一。