一种新的人端粒相关蛋白T-STAR 的克隆及功能分析

目的 筛选、鉴定新的人端粒相关蛋白，为进一步了解端粒酶全酶的结构、生物学功能及其作用机制奠定实验基础。方法 采用研究蛋白质间相互作用非常有效的分子生物学方法酵母双杂交技术、哺乳细胞双杂交技术进行人端粒相关蛋白分子的筛选、鉴定。结果 成功构建端粒酶催化亚单位诱饵融合蛋白表达载体pGBKT7-hTERT，无自身激活活性，pG—BKT-7hTERT融合蛋白在酵母细胞AH109内有效稳定表达。以pGBKT7-hTERT为诱饵进行cDNA库筛选，将阳性克隆质粒cDNA测序，同源性比较获得了已收录人cDNA序列T—STAR。成功构建真核表达载体pVP16-T-STAR、pM—hTERT，证明T-STAR与hTERT在哺乳细胞内发生相互作用。T—STAR mRNA在正常胃粘膜组织低表达，在胃癌细胞内高表达。结论 T—STAR是人端粒相关蛋白新成员，可能参与酪氨酸蛋白激酶信号传递并通过介入hTERT的磷酸化或去磷酸化调节端粒酶的活性。     

hPer1 bHLH-PAS结构域酵母双杂交系统的构建

目的构建hPer1 bHLH-PAS结构域的酵母双杂交系统,以寻找与hPer1相互作用的新蛋白.方法构建pGBKT7-hPer1 bHLH-PAS重组诱饵质粒及pGADT7-Rec-脑cDNA文库质粒;将两种质粒顺序转染至酵母细胞AH109中,进行营养缺陷筛选阳性克隆株.结果经酶切和基因测序鉴定,证实重组诱饵质粒pGBKT7-hPer1 bHLH-PAS构建成功.脑cDNA文库转化效率为1.2×106/3 μg pGADT7-Rec.结论酵母双杂交文库筛选得到24个阳性克隆.这为寻找脑组织中与hPer1相互作用的未知蛋白奠定了基础.     

人肠三叶因子酵母双杂交诱饵载体的构建及其自激活作用鉴定

目的 构建人肠三叶因子酵母双杂交诱饵载体并验证其自激活作用.方法 以pET32a-hITF质粒为模板,PCR扩增hITF成熟肽cDNA片段,Sal I和EcpRV双酶切后连接到pENTR3c载体,通过λ噬菌体臂同源重组反应(LR重组反应)将hITF片段连接到酵母双杂交诱饵载体pDEST32,获得诱饵质粒pDEST32-hITF,测序后与酵母双杂交空质粒pDEST22共转化到酵母菌株Mav203,经营养缺陷培养基筛选后,观察在含不同浓度3-氨基三唑(3AT)的营养缺陷培养基中pDEST32-HITF的自激活作用.结果 成功克隆hITF基因片段,构建酵母双杂交诱饵质粒pDEST32-hITF,其与酵母双杂交空载体pDEST22共转化到酵母菌株Mav203后,可在3AT浓度为0、10、25mmol/L的营养缺陷培养基上生长,而在3AT浓度为50、75、100mmol/L的营养缺陷培养基上不能生长.结论 成功构建酵母双杂交诱饵载体,经验证50mmol/L及以上浓度的3AT营养缺陷培养基可以抑制其自激活作用.     

分化抑制因子ID1''基因酵母双杂交诱饵载体的构建及自激活作用的检测

目的：构建酵母双杂交用分化抑制因子IDl’基因的诱饵载体，并检测其自激活作用。方法：PCR扩增ID1’，基因全长，酶切后与诱饵载体pHybLex/Zeo连接形成重组诱饵载体，电穿孔方法转化到酵母细胞EGY48中，β—半乳搪昔酶滤膜分析检测重组诱饵载体对报告基因LacZ的自激活情况。结果：扩增出IDl’基因全长，成功构建了重组诱饵载体pHybLex/Zeo—IDl’，经酶切和测序鉴定正确；重组诱饵载体无自发激活报告基因功能。结论：重组诱饵载体构建成功，对报告基因无自激活作用，为下一步cDNA文库筛选莫定了基础。     

HLH缺失型Id2候选相互作用蛋白

目的:筛选可以与螺旋-环-螺旋(HLH)结构域缺失的Id2相互作用的蛋白.方法:用重叠延伸PCR方法将Id2中的HLH结构域缺失,并插入到pGBKT7载体,构建 BD∶ Id2-DBM-δHLH融合诱饵质粒;构建MCF-7细胞的ds cDNA文库;采用共转化方法进行Id2-DBM-δHLH相互作用蛋白的酵母双杂交筛选,采用PCR方法扩增阳性克隆中的AD∶ cDNA序列并测序;将获得的AD∶ cDNA质粒分别与BD∶ Id2-DBM-δHLH诱饵质粒共转化酵母进行配对验证.结果:酵母双杂交方法共筛选到19个阳性克隆,PCR方法在这19个克隆中共扩增到28条片段,序列测定证实含18个不同的基因,对其中的13个进行配对验证后证实了其中8个与HLH缺失型Id2相互作用,这8个基因分别是:UXT、VIM、KRT7、FHL2、SEI1、PCBP1、SIVA和LSM2.结论:本研究首次利用HLH缺失型Id2作为诱饵,利用酵母双杂交技术筛选识别了一族新的Id2相互作用蛋白,为进一步研究Id2的功能调控以及非HLH依赖的功能活性奠定基础.     

KGF-2与PRO2605蛋白相互作用的初步研究

目的：利用酵母双杂交系统筛选KGF-2的相互作用蛋白，为阐明其分子作用机制提供有益线索。方法：通过聚合酶链反应从人胎肝cDNA文库中钓取KGF-2 cDNA，构建诱饵蛋白载体pAS2-1-KGF-2，并对其自身转录激活活性进行鉴定，利用酵母双杂交系统筛选人胎肝cDNA文库，挑选双阳性克隆。将KGF-2和候选蛋白分别克隆至哺乳动物细胞双杂交的BD、AD质粒中，共同转染COS-7细胞，通过CAT分析验证KGF-2和候选蛋白之间的相互作用。结果：VDNA序列分析和同源检索显示所获候选蛋白为PR02605。以KGF-2和PRO2605 cDNA共转化酵母宿主Y190后可激活报道基因，但共转染COS-7细胞后，CAT分析结果阴性。结论：KGF-2和PRO2605在酵母体内存在相互作用，但在COS-7细胞中未能检测到两者的相互作用。     

神经特异性转录因子DAT1酵母双杂交诱饵载体的构建

目的：用神经特异性转录因子DAT1构建酵母双杂交系统中的诱饵载体。方法：根据GenBank中提供的DATl序列设计引物，以小鼠脑组织cDNA文库为模板，PCR扩增DAT1，并与pLexA载体连接，测序鉴定。用醋酸锂法转化酵母菌EGY48，在选择性培养基上观察pLexA-DATl在EGY48中的表达。结果：PCR扩增出的DNA片段约490bp，大小正确，构建的融合表达载体pLexA-DAT1，测序结果表明序列完全正确，融合区域的读码框正确。转化了pLexA-DAT1的酵母菌EGY48在加有X-Gal的SD／Gal／Raf／-His／-Ura营养缺陷型诱导平板上菌落不变蓝，证明LexA-DAT1融合蛋白本身不具有激活p80p-LaeZ报告基因的能力，可以用作进一步的实验。结论：获得了在酵母细胞中正确表达且未自主激活报告基因的融合表达载体pLexA-DAT1，可作为酵母双杂交系统中的“诱饵”。     

hPer1相互作用蛋白的筛选

目的 应用酵母双杂交系统筛选血液中与人体生物钟蛋白Per1相互作用的新蛋白.方法 以人Per1的basic HLH-PAS结构域为诱饵,在人血液cDNA文库中筛选与之相互作用的新蛋白.阳性克隆送测序后用生物信息学分析.结果 酵母双杂交文库营养缺陷筛选得到114个阳性克隆,β-半乳糖苷酶检测报告基因获得46个蓝色克隆.通过测序和生物信息学分析,其中之一能与Per1相互作用的蛋白为LSMD1.结论 通过酵母双杂交系统证明Per1能够与LSMD1发生相互作用.     

运用酵母双杂交系统筛选与埃博拉病毒GP、VP30、NP、L蛋白存在相互作用的宿主蛋白

目的 运用酵母双杂交技术从人肝cDNA文库中筛选出与埃博拉病毒(EBOV)GP、VP30、NP、L蛋白存在相互作用的宿主蛋白,用于研究GP、VP30、NP、L蛋白在EBOV传染病中的生物学功能.方法 利用重组PCR技术构建诱饵质粒pGBKT7-GP、pGBKT7-VP30、pGBKT7-NP、pGBKT7-L,将诱饵菌株与人肝cDNA文库菌株进行杂交筛选,对筛选到的阳性克隆进行DNA测序和生物信息学分析,然后再利用酵母回复性实验进一步验证,排除假阳性结果.结果 成功构建了诱饵质粒pGBKT7-GP、pGBKT7-VP30、pGBKT7-NP、pGBKT7-L,筛选出6个可能与GP、VP30、NP、L蛋白有相互作用的宿主蛋白,分别是COMMD1、ALB、PSMD8、APOA2、CYP2E1、HP.酵母回复性实验进一步说明了COMMD1和APOA2与NP蛋白可能存在相互作用.结论 酵母双杂交筛选出多个可能与EBOV的GP、VP30、NP、L蛋白存在相互作用的捕获蛋白,为研究EBOV的致病机制提供了参考.     

酵母双杂交技术筛选人95D细胞中肺癌转移相关蛋白1相互作用蛋白及其验证

 目的 通过酵母双杂交实验、免疫共沉淀及GST pull down技术筛选并验证肺癌细胞系95D细胞中与肺癌转移相关蛋白1(lung cancer metastasis-related protein 1,LCMR1)相互作用蛋白,为进一步研究LCMR1在肺癌发生发展中的作用提供科学依据。方法 将诱饵质粒pGBKT7-LCMR转化AH109,应用酵母双杂交系统筛选出95D细胞中与LCMR1相互作用的候选克隆;应用反复划线法、X-α-Gal显色法和共转化回复验证法排除假阳性克隆,对真阳性克隆进行测序及生物学分析;构建含Myc标签的LCMR1融合蛋白的重组载体pCMV - Myc-LCMR1载体,以及带flag标签的目标相互作用蛋白载体,共转染细胞,利用免疫共沉淀技术验证LCMR1与相互作用蛋白之前的相互作用;融合蛋白沉降(GST pull- down)法进一步体外验证LCMR1与相互作用蛋白之间的作用。结果 诱饵质粒pGBKT7 -LCMR1与95D细胞cDNA文库共转化AH109,初步获得20个候选克隆;重复划线法后获得16个阳性克隆,X-α-Gal显色法获得12个蓝色阳性克隆,进一步将文库质粒与诱饵质粒共转化酵母菌回复验证,最终获得6个真阳性克隆;成功构建含标签重组载pCMV-Myc-LCMR1、pcDNA3.0-flag-RPL29及pcDNA3.0- flag-GNG5载体,经免疫共沉淀验证LCMR1与RPL29在细胞内有相互作用,与GNG5在细胞内无相互作用;GST pull-down实验验证LCMR1与RPL29在体外有相互作用,与GNG5在细胞外无相互作用。结论 酵母双杂交技术筛选出95D细胞中相互作用蛋白6个,经免疫共沉淀和GST pull-down实验验证LCMR1与RPL29体内体外均有相互作用。     

HBeAg结合蛋白4剪切体HBeBP4A基因酵母表达载体的构建及表达研究

目的 在真核生物酵母细胞中表达乙型肝炎病毒e抗原结合蛋白4基因剪切体HBeBP4A基因.方法 以pcDNATM3.1/myc-HisA-HBeBP4A重组质粒作为模板,经RT-PCR扩增HBeBP4A基因,克隆到pGEM-T载体中并测序鉴定,酶切回收后连接到酵母表达质粒pGBKT7中并转化酵母AH109,色氨酸缺陷型培养基(SD/-Trp)上筛选阳性菌落,提取酵母蛋白质,行SDS-PAGE电泳和Western blotting分析.结果 成功扩增出HBeBP4A基因,测序结果符合GenBank报告序列.酶切回收的HBeBP4A基因片段成功克隆入酵母表达载体pGBKT7并转化入酵母细胞AH109中,Western blotting分析显示该基因在酵母细胞中表达,表达产物相对分子量为61.37kD.结论 成功构建了HBeBP4A酵母表达载体,并在酵母细胞中表达.     

乙型肝炎病毒前S1基因酵母表达载体的构建及表达

为探讨乙型肝炎病毒（HBV）前S1蛋白的功能，在真核生物酵母细胞中表达HBV前S1基因。以HBV ayw亚型全长质粒pCP10为模板，多聚酶链反应（PCR）扩增HBV前S1基因，克隆到pGEM-Tfawsk ,双酶切后回收与酵母表达质粒pGBKT7连接，将重组载体转化酶母细胞AH109，提取酵母蛋白质，进行十二烷基磺酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS－PAGE）和Western免疫印迹分析，结果成功地构建了HBV前S1基因酵母表达载体，Western免疫印迹显示HBV前S1在酵母细胞中表达，表达产物在胞内存在，分子量30kD左右。表明HBV前S1蛋白在酵母细胞中表达成功。     

应用酵母双杂交技术筛选和验证与DNA-PKcs磷酸化簇区域相互作用的蛋白

目的 通过酵母双杂交技术筛选与DNA依赖蛋白激酶的催化亚单位（DNA dependent protein kinase catalytic subunit,DNA-PKcs）磷酸化簇区域相互作用的蛋白并进行验证。方法 通过酵母双杂交技术,以之前构建的pGBKT7-DPC载体为诱饵,在人肝组织酵母文库中筛选与DNA-PKcs磷酸化簇区域相互作用的蛋白,对筛选出来的阳性酵母细胞克隆进行PCR鉴定、回转验证以及测序分析;构建诱饵蛋白和阳性克隆蛋白的真核表达载体,分别转染至人胚肾293T细胞中,检测诱饵蛋白和阳性克隆蛋白能否正确表达;最后将阳性克隆蛋白与诱饵蛋白共转染至293T细胞中,通过免疫共沉淀实验检测阳性克隆蛋白与诱饵蛋白之间的相互作用。结果 经过两轮酵母双杂交实验筛选得到12个文库质粒克隆,通过PCR鉴定确定7个插入片段长度互不相同的文库克隆,对7个文库克隆进行回转验证得到3个与DNA-PKcs磷酸化簇区域相互作用的蛋白,经测序分析显示分别为MBNL1、SIK2和YY1AP1。成功构建诱饵蛋白和3个阳性克隆蛋白的真核表达载体,且均能够在293T细胞中正确表达。免疫共沉淀实验证实筛选出来的3个阳性克隆蛋白均能够与DNA-PKcs磷酸化簇区域发生相互作用。结论 成功筛选到与DNA-PKcs磷酸化簇区域相互作用的蛋白并进行了验证。     

丙型肝炎病毒非结构蛋白5A结合蛋白37基因的克隆化研究

丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白5A(NS5A)可与多种细胞内蛋白发生结合，涉及调节细胞生长、干扰素耐受、脂质代谢和其他细胞内信号转导通路。本实验通过酵母双杂交技术筛选得到一个与NS5A相结合的未知功能蛋白基因，命名为NS5ABP37，根据GenBank数据库推定蛋白编码序列的信息，应用反转录聚合酶链反应(PCR)扩增出该基因序列。连接人酵母和真核细胞表达载体表达成功，并经回交实验证实NS5A与NS5ABP37的结合作用，为进一步研究奠定基础。