人β防御素2(HBD2)与人乳头瘤病毒 HPV16E6羧基端编码基因的克隆及其在真核细胞中的表达

目的构建人β防御素与人乳头瘤病毒HPV16E6羧基端基因的真核表达质粒,并检测其在真核细胞中的表达情况,探讨其作为DNA疫苗治疗宫颈癌的可行性.方法利用分子克隆技术,将HBD2基因片段与HPV16E6羧基端基因片段连接,插入真核表达质粒pcDNA3.1,经测序鉴定后,用阳离子脂质体法转染真核细胞COS7,RT-PCR及免疫组化法检测其表达.结果重组质粒pcDNA 3.1/HBD2-HPV16E6C转染COS7细胞48小时后,RT-PCR扩增出插入的HBD2-HPV16E6C片段,免疫组化染色呈棕黄色阳性反应.结论人β防御素与人乳头瘤病毒HPV16E6羧基端融合基因能在真核细胞中有效表达,为今后进行整体动物DNA免疫试验奠定了基础.     

HPV16E6羧基端编码基因的克隆及真核细胞表达

目的：探讨用人乳头瘤病毒１６型（ＨＰＶ１６）早期基因Ｅ６羧基端基因片段（Ｅ６Ｃ）研制ＤＮＡ疫苗的可行性。方法：采用ＰＣＲ方法从质粒ｐＨＰＶ１６中获得Ｅ６Ｃ端基因片段,将其克隆入含巨细胞病毒（ＣＭＶ）启动子的真核表达载体,脂质体介导基因转染ＬＡ７９５小鼠肺腺癌细胞并检测Ｅ６Ｃ的表达。结果：成功构建了真核表达质粒ｐＬＮＣＥ６Ｃ,免疫组化结果显示真核表达质粒ｐＬＮＣＥ６Ｃ在ＬＡ７９５细胞中获得有效表达。     

HPV16E6羧基端编码基因的克隆及真核细胞表达

目的探讨用人乳头瘤病毒16型(HPV16)早期基因E6羧基端基因片段(E6C)研制DNA疫苗的可行性。方法采用PCR方法从质粒pHPVl6中获得E6C端基因片段,将其克隆入含巨细胞病毒(CMV)启动子的真核表达载体,脂质体介导基因转染LA795小鼠肺腺癌细胞并检测E6C的表达。结果成功构建了真核表达质粒pLNCE6C,免疫组化结果显示真核表达质粒pLNCF6C在LA795细胞中获得有效表达。结论选择去除转化功能区的E6C端基因构建真核表达质粒是一有益的尝试,为进行动物DNA免疫试验奠定了基础。     

重庆地区1例宫颈癌组织人乳头瘤病毒16型E6,E7基因的结构和变异

目的：报告1例重庆地区宫颈癌组织人乳头瘤病毒16型E6，E7基因的结构及其变异，方法：应用聚合酶链式反应（PCR）从宫颈癌组织扩增出人乳头瘤病毒16型重庆株E6，E7基因，分子克隆技术进行基因的克隆，测序。结果：成功地扩增出重庆地区宫颈癌人乳头瘤病毒16型株E6，E7基因，并克隆于质粒载体pBKS( )，结论：该例宫颈癌组织人乳头瘤病毒16型E6，E7与标准株HPV16 E6，E7基因的长度相同，E6基因无变异，但E7基因有两处点突变。     

人乳头瘤病毒16型主要衣壳蛋白L1基因的克隆和序列分析

目的 从已感染人乳头瘤病毒（HPV）的新鲜宫颈癌组织中获得HPV16型晚期表达基因L1，为HPV感染的检测和治疗奠定基础。方法 根据引物设计原则设计一对特异引物，并用PCR方法从宫颈癌组织中获得L1基因，用pGEM-T作为克隆物体，构建重组质粒并以双脱氧法双向测定插入片段序列，拼接出L1基因序列，自动测序验证并分析序列。结果 从西安地区1例宫颈癌临床标本克隆到的1株HPV16型L1蛋白编码序列经BLAST2．0分析与既往报道序列存在高度同蛋白编码序列经BLAST2．0分析与既往报道序列存在高度同源性。结论 构建的重组质粒为进一步研究L1蛋白的表达及其免疫学创造了条件。     

人CD38分子基因的克隆及其在真核细胞中的表达

目的：克隆并表达人CD38抗原分子的全长cDNA。方法：采用RT－PCR法，从高表达CD38抗原的Daudi细胞系中克隆出CD38全长cDNA并将其插入pGEM-T载体中，重新设计引物，引入酶切 位点，二次PCR；从重组pGEMT载体上扩增CD38抗原分子的cDNA编码序列，再亚克隆至真核表达载体pcDNA3.1( )，用脂质体法转染COS7细胞。用免疫荧光及A－PAAP方法检测CD38抗原的表达。结果：克隆的CD38抗原的全长cDNA，经酶切鉴定及序列分析表明，其序列与文献报道完全一致。免疫荧光及APAAP方法检测表明，CD38抗原分子在COS7细胞中获得表达。结论：成功构建了CD38真核表达载体，并在COS7细胞中获得表达，对研究CD38分子的功能具有重要的意义。     

人乳头瘤病毒16型早期基因E7的克隆及其在原核细胞中的表达

目的 进一步研究与宫颈癌密切相关的人乳头瘤病毒１６型（ＨＰＶ１６）Ｅ７基因的生物学活性。方法 采用ＰＣＲ法从妇女宫颈癌标本中扩增ＨＰＶ１６早期基因Ｅ７,测人ＤＮＡ诉序列,结果 克隆的ＨＰＶ１６Ｅ７基因与标准型进行比较表明,前者无核苷酸突变。将此基因装入原核表达载体,能在Ｅ．Ｃｏｌｉ中高效表达出谷胱甘肽Ｓ－转移酶（ＧＳＴ）－Ｅ７蛋白,Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹分析表明,此融合蛋白能在Ｅ７抗体特异地结合。结论     

人防御素α5、人防御素β2在不孕患者输卵管的表达及意义

目的 通过分析粘连、闭锁的输卵管伞和正常输卵管伞中人防御素α5(human α defensin-5,HαD-5)、人防御素β2(human β defensin-2,HβD-2)的相关性,初步探讨HαD-5和HβD-2在输卵管伞粘连发生中的作用与意义,为临床防治输卵管伞粘连闭锁引起的不孕提供新的思路.方法 收集临床手术切除的输卵管伞组织,将输卵管伞分为粘连组(30例)和非粘连组(30例),应用免疫组化SP法检测HαD-5 和HβD-2的表达情况,分析二者的相关性.结果 免疫组化染色结果显示HαD-5、HβD-2两种因子在粘连组的表达强于不粘连组,且差异有统计学意义(P<0.05).不粘连组中HαD-5和HβD-2的表达呈正相关(r=0.404,P<0.05).粘连组中HαD-5和HβD-2的表达无相关性(P=0.089).结论 HαD-5、HβD-2在炎症发生时表达明显增强,在正常情况下,两者存在相互促进的协同作用,这种协同作用的破坏可能是粘连形成的原因之一.     

人乳头瘤病毒DNA6B／11,16,18在喉鳞癌组织中的表达

为了证实人乳头瘤病毒亚型的感染与喉鳞癌的关系，采用原位杂交技术，荧光素标记ＨＰＶ ６Ｂ／１１，１６，１８ＤＮＡ为探针，分别为３２例福尔马林固定，石蜡包埋的喉鳞癌进行ＨＰＢ ６Ｂ／１１，１６，１８型检测。结果显示：ＨＰＶ１６型ＤＮＡ阳性，ＨＰＶ１８型阳性９例，ＨＰＶ６Ｂ／１１阴性。提示：喉鳞癌的发生与ＨＰＶ１６，１８型感染有关。     

人β-防御素1对宫颈癌Hela细胞HPV18复制和表达的影响

目的 观察人β-防御素1(hβD1)对宫颈癌Hela细胞HPV18复制和表达的影响.方法 基因转染:通过FugenHD介导,将已构建的hβD1/psectag质粒转染至Hela细胞(实验组),并设空载组和空白组.通过免疫细胞化学染色观察转染后目的 基因在细胞中的表达;荧光定量PCR检测转染48 h和72 h后Hela细胞HPV18 DNA拷贝数的变化; 半定量RT-PCR检测转染后48 h和72 h的Hela细胞HPV18 E6 mRNA表达的改变.结果 转染hβD1/psectag质粒48 h和72 h后的Hela细胞均有hβD1的表达,后者明显增强,而空载组和空白组未见表达.较之空载组和空白组,实验组48 h HPV18 DNA拷贝数增多,72 h HPV18 DNA拷贝数减少,但差异无统计学意义.实验组48 h的Hela细胞HPV18 E6 mRNA表达较空载组和空白组未见明显改变,而72 h的Hela细胞HPV18 E6 mRNA表达较空白组减少(P<0.05).结论 hβD1对Hela细胞HPV18 E6 mRNA表达有抑制作用并呈浓度依赖性,而对其DNA复制作用不明显.     

宫颈癌人乳头瘤病毒与人巨细胞病毒感染的病例对照研究

了解宫颈癌患者及对照患者宫颈组织中人乳头瘤病毒（ＨＰＶ）与人巨细胞病毒（ＨＣＭＶ）的感染状况。应用聚合酶链反应方法检测宫颈新鲜活检组织ＨＰＶ与ＨＣＭＶ。３６例宫颈癌及３８例子宫肌瘤患者的宫颈组织中，ＨＰＶ合并入ＨＣＭＶ感染检测阴性率分别为２．８％和３１．６％，ＨＰＶ单独感染的检出率分别为２５．０％和１５．８％（Ｐ〈０．０５），ＯＲ＝１８．０；ＨＣＭＶ单独感染的检出率分别为８．３％和２８．９％（Ｐ〉     

人β防御素-2基因在SPC细胞中的转染表达

目的合成人β防御素-2(hum anβ-defensin-2,hBD-2)基因并构建其真核表达载体,转染SPC细胞,检测其表达,明确hBD-2重组载体的表达活性,为hBD-2基因转染和表达的研究奠定基础。方法根据Genebank中的hBD-2结构基因序列设计合成三条引物,用PCR延伸扩增的方法合成hBD-2基因,克隆入真核表达载体pLXSN;通过脂质体转染法将pLXSN-hBD-2导入SPC细胞,采用W estern-b lot法检测hBD-2的表达。结果经凝胶电泳及测序分析,证实合成的基因与原序列一致,并成功克隆到真核表达载体pLXSN上,所构建的真核表达重组载体pLX-SN-hBD-2转染SPC细胞后呈现有效表达。结论成功构建了PCR合成的hBD-2基因真核表达重组载体pLXSN-hBD-2,通过基因转染的方法导入SPC细胞并获得表达hBD-2,为进一步的动物转基因抗感染实验研究提供了依据。     

重组人β防御素2在膀胱上皮细胞中的表达及活性检测

目的探讨重组人β防御素2(hBD2)真核表达载体在人膀胱上皮细胞中的表达,并观察重组hBD2的体外抗菌活性。方法采用脂质体转染法将hBD2重组真核表达质粒pCAGG-hBD2导入无血清培养的人膀胱上皮细胞株T24细胞,利用RT-PCR法、Western blotting分别在核酸水平及蛋白质水平检测hBD2的表达。ELISA测定培养上清中hBD2的浓度,菌落计数法检测上清对尿路致病性大肠杆菌(UTI89)和克雷白杆菌(TOP52)的临床分离株的抗菌效果。结果 RT-PCR和Western blotting结果显示,转染后hBD2可在T24细胞中有效地表达。上清中hBD2的含量为(36.5±3.2)ng/106个细胞,菌落计数法显示,hBD2对UTI89和TOP52临床分离株有显著的杀菌作用。结论 hBD2重组真核表达载体脂质体法转染人膀胱上皮细胞后,可高效表达具抗菌活性的基因重组hBD2。     

β防御素2在中耳胆脂瘤上皮中的表达及意义

人β防御素2是细菌和前炎性因子刺激下合成表达的抗菌肽,主要分布在感染后的皮肤和黏膜组织中,构成机体抵御微生物的第一道化学屏障,在中耳胆脂瘤形成和发展的免疫学机制中发挥了重要作用。     

宫颈病变患者人乳头瘤病毒16亚型E2基因多态性检测

目的分析宫颈病变中人乳头瘤病毒（HPV）16亚型E2基因的多态与宫颈病变的关系,了解E2基因变异情况及其与宫颈
病变的相关性。方法应用PCR和高分辨率熔解曲线方法针对379例HPV高危亚型阳性宫颈脱落细胞样本进行HPV16感染
情况及HPV16亚型E2基因68位点和133位点多态分布情况进行检测。结果379例HPV高危亚型阳性宫颈标本共检出78例
HPV16亚型阳性,其在宫颈癌、CINⅡ~Ⅲ、CINⅠ、炎症患者中的检出率分别为44.8%、31.5%、24.1%和9.6%;HPV16E2基因
68C和133G的频率在中重度宫颈内瘤样病变和宫颈癌中明显高于轻度上皮内瘤样病变和炎症患者（P<0.05）。结论HPV16是
导致宫颈恶性病变的重要致病因素;随着病理类型的进展,HPV16感染率也逐渐增加;同时基因位点改变说明HPV16E2基因
单核苷酸变异可能使致癌能力发生改变。