腺病毒介导的心肌营养素1基因修饰大鼠神经干细胞

目的：以心肌营养素1基因修饰大鼠神经干细胞,为心肌营养素1基因修饰的神经干细胞移植治疗中枢神经系统损伤提供物质基础.方法：实验于2002-06/2003-06在第三军医大学野战外科研究所全军重点开放实验室进行.从Wistar大鼠胚胎海马和室管膜区组织分离、培养大鼠胚胎神经干细胞,以构建纯化好的重组腺病毒-心肌营养素1和重组腺病毒-增强绿色荧光蛋白载体转染神经干细胞.相差显微镜下直接观察细胞生长存活情况,应用免疫细胞化学和免疫荧光技术检测神经干细胞及其诱导后分化细胞的特异性蛋白巢蛋白、神经微丝蛋白、胶质纤维酸性蛋白,外源性Brdu和增强绿色荧光蛋白的掺入情况,并观察心肌营养素1基因在神经干细胞中的表达.结果：①从胚胎大鼠分离的神经干细胞可在体外多次传代,经细胞增殖标记物Brdu掺入实验证明神经干细胞具有分裂增殖能力.②检测神经干细胞标志物巢蛋白、神经元标志物神经微丝蛋白和胶质细胞标志物胶质纤维酸性蛋白,证实神经干细胞具有多向分化潜能.③重组腺病毒-心肌营养素1及重组腺病毒-增强绿色荧光蛋白转染神经干细胞后应用免疫组化和荧光示踪技术,检测到神经干细胞中心肌营养素1和报告基因增强绿色荧光蛋白表达明显持续增加.结论：①实验成功地分离和培养出大鼠神经干细胞,并在体外可多次传代增殖并可诱导分化为神经元和胶质细胞.②重组腺病毒-心肌营养素1和重组腺病毒-增强绿色荧光蛋白转染神经干细胞后,外源性心肌营养素1基因和增强绿色荧光蛋白在细胞中可持续稳定表达.     

绿色荧光蛋白标记的大鼠胶质细胞源性神经营养因子重组腺病毒载体的构建及其表达

目的:构建大鼠胶质细胞源性神经营养因子基因的重组腺病毒并观察其在神经干细胞上的表达,探索胶质细胞源性神经营养因子作为基因治疗神经病变的价值。方法:实验于2004-8/12在四川大学华西医院眼疾病分子遗传实验室进行。以新生SD大鼠大脑皮层细胞RNA为模板,反转录聚合酶链反应扩增出全长的胶质细胞源性神经营养因子基因,经测序验证后,亚克隆至穿梭质粒pAdTrackCMV中,与骨架质粒pAdEasy1同源重组为腺病毒载体。线形化后转染293细胞进行包装扩增,利用AdEasy1系统上的绿色荧光蛋白鉴定病毒表达,并用病毒上清转化大鼠神经干细胞,检测胶质细胞源性神经营养因子基因的表达。结果:①胶质细胞源性神经营养因子基因扩增后进行测序显示扩增片段为653bp个核苷酸,同源性比较该序列正确。②重组腺病毒载体经酶切验证为阳性克隆,转染293细胞包装后的病毒滴度为1x109PFU/mL。③转入胶质细胞源性神经营养因子的重组腺病毒的神经干细胞扩增出653bp的带。结论:成功构建了胶质细胞源性神经营养因子重组腺病毒并见其在大鼠神经干细胞中进行了表达。     

绿色荧光蛋白标记的大鼠胶质细胞源性神经营养因子重组腺病毒载体的构建及其表达

目的：构建大鼠胶质细胞源性神经营养因子基因的重组腺病毒并观察其在神经干细胞上的表达，探索胶质细胞源性神经营养因子作为基因治疗神经病变的价值。方法：实验于2004-8／12在四川大学华西医院眼疾病分子遗传实验室进行。以新生SD大鼠大脑皮层细胞RNA为模板，反转录聚合酶链反应扩增出全长的胶质细胞源性神经营养因子基因，经测序验证后，亚克隆至穿梭质粒pAdTrack CMV中，与骨架质粒pAdEasy 1同源重组为腺病毒载体。线形化后转染293细胞进行包装扩增，利用AdEasy 1系统上的绿色荧光蛋白鉴定病毒表达，并用病毒上清转化大鼠神经干细胞，检测胶质细胞源性神经营养因子基因的表达。结果：①胶质细胞源性神经营养因子基因扩增后进行测序显示扩增片段为653bp个核苷酸，同源性比较该序列正确。②重组腺病毒载体经酶切验证为阳性克隆，转染293细胞包装后的病毒滴度为lxl09PFU／mL。③转入胶质细胞源性神经营养因子的重组腺病毒的神经干细胞扩增出653bp的带。结论：成功构建了胶质细胞源性神经营养因子重组腺病毒并见其在大鼠神经干细胞中进行了表达。     

腺病毒重组绿色荧光蛋白转染脂肪组织来源干细胞的特点

目的:体外基因转染成人脂肪组织来源的干细胞后,观察腺病毒载体能否有效地转染及对细胞的影响。实验应用腺病毒增强型绿色荧光蛋白进行体外基因转染以验证基因修饰效果。方法:实验于2006-10/2007-02在南方医科大学生物技术工程研究所实验室完成。实验对象:脂肪组织取自南方医科大学附属医院整形科手术室5例成年女性腹部吸脂术患者,排除了冠心病、高血压及糖尿病等。手术前均与患者本人谈话并征得其同意,获取脂肪组织进行实验,并经医院伦理委员会批准。实验方法:分离人脂肪组织,进行原代和传代培养。取第4代脂肪组织来源干细胞进行流式细胞术表型鉴定,并将0,10,20,30,50,100感染复数值的腺病毒重组增强型绿色荧光蛋白,通过活力和增殖实验进行体外转染,观察其对脂肪组织来源干细胞的影响。结果:5份标本均成功培养出脂肪组织来源干细胞,生长良好,均成功进行了腺病毒重组增强型绿色荧光蛋白基因转染。①原代细胞培养48h后可见细胞贴壁,13d后可见细胞铺满瓶底80%细胞绝大多数呈梭形。1∶2传代后细胞增殖速度明显加快,3d后细胞即已长满培养瓶底,即可传代。第4代的脂肪组织来源干细胞表型,呈CD29 ,CD34-,CD44 ,CD106-,CD133-和HLA-DR-。②腺病毒重组增强型绿色荧光蛋白转染24h可见绿色荧光,5d荧光表达强度最强,脂肪组织来源干细胞细胞传代培养后仍有强荧光表达。③转染组和未转染组细胞培养1,3,5,7,9,11d时细胞活力、增殖分化均无统计学差异。结论:腺病毒重组增强型绿色荧光蛋白可成功进入脂肪组织来源干细胞,感染复数值为50时较为理想。     

神经营养素3基因转染神经干细胞及其表达

背景:应用包括神经营养素3的神经营养因子促进周围神经再生是当今周围神经再生研究的热点之一,但是临床应用上缺乏安全、有效的给药途径.基因转染技术为神经营养因子的临床应用提供了新的思路和途径.目的:用神经营养素3基因修饰神经干细胞,并观察在转染后的神经干细胞内的表达情况.设计:完全随机试验.单位:广西医科大学第一附属医院创伤骨科手外科和华中科技大学同济医学院附属协和医院手外科.材料:实验选用健康SD大鼠3只,鼠龄4个月,雌雄不拘,由华中科技大学同济医学院动物房提供.用于转染神经干细胞的重组腺病毒表达载体由华中科技大学同济医学院协和医院骨科实验室构建,浓度为0.15 g/L.方法:实验于2002-12/2004-03在华中科技大学同济医学院协和医院骨科实验室和同济医院中心实验室完成.采用阳离子脂质体介入法,将含绿色荧光蛋白(GFP)基因的组组质粒pAd-神经营养素3转染原代培养的神经干细胞,转染72 h后采用荧光倒置显微镜观察绿色荧光蛋白在神经干细胞上的表达,测定转染率.采用免疫细胞化学染色法和反转录-聚合酶链反应检测转染72 h,1,5周后神经营养素3基因在神经干细胞中的表达和转录情况.主要观察指标:神经营养素3基因在转染后的神经干细胞内的表达情况.结果:①重组质粒pAd-神经营养素3转染神经干细胞:转染72h绿色荧光蛋白在部分神经干细胞上有表达,转染率为40%.5周后仍可见绿色荧光蛋白的表达.②神经营养素3基因在神经干细胞中的转录与表达:转染72 h,1,5周后神经干细胞中均有神经营养素3 mRNA的转录,转染5周后仍有神经营养素3 mRNA的表达.结论:神经营养素3基因以阳离子脂质体为载体,通过腺病毒的介导,可有效的转染培养的神经干细胞并长期表达.     

绿色荧光蛋白转染大鼠骨髓间充质干细胞及体外向神经元样细胞的分化

背景:成年骨髓间充质干细胞诱导后在体外可分化为神经元样细胞,利用细胞转染技术让其表达绿色荧光蛋白,便于在动物模型体内跟踪观察。目的:观察增强型绿色荧光蛋白转染的骨髓间充质干细胞体外分化为神经元样细胞的能力,拟为增强型绿色荧光蛋白基因作标志物对外源性骨髓间充质干细胞进行体内追踪做准备。设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2006-06/2007-06在中国医科大学医学分子生物学国家重点实验室完成。材料:清洁级成年Wistar大鼠32只,由中国医科大学实验动物部提供。增强型绿色荧光蛋白质粒为Sigma公司产品。方法:取大鼠两侧股骨及胫骨,Percoll密度梯度离心 贴壁法体外分离培养骨髓间充质干细胞,达90%融合后消化传代扩增。由脂质体介导,将含有增强型绿色荧光蛋白质粒cDNA转入骨髓间充质干细胞,经G418筛选后,按0.4×109L-1接种,加入含FBS、碱性成纤维细胞生长因子的DMEM预诱导24h,更换培养液后再以含BHA、DMSO的无血清DMEM诱导5h～6d。主要观察指标:荧光显微镜观察细胞转染情况,免疫细胞化学染色检测转染细胞诱导后神经元表面抗原的表达。结果:携带增强型绿色荧光蛋白基因的骨髓间充质干细胞生长旺盛,转染24h后在细胞核中就可见弥散绿色荧光,转染48h后绿色荧光更加集中,在细胞核中聚集成团块、颗粒状,体外培养3个月后仍能够高水平表达增强型绿色荧光蛋白。与未转染细胞比较,转染细胞诱导后其神经元特异性烯醇化酶、神经丝蛋白、巢蛋白阳性率均无明显变化(P>0.05),胶质纤维酸性蛋白呈阴性表达。结论:骨髓间充质干细胞体内能稳定、高效和持久地表达增强型绿色荧光蛋白,转染后生物学性状未发生改变,体外在细胞因子和氧化剂的诱导作用下仍可以分化为神经元样细胞。     

小鼠胚胎神经干细胞的体外生长特性和相关基因的表达

目的:观察小鼠胚胎神经干细胞的体外生长特性并检测其相关基因的表达。方法:实验于2005-02/06在暨南大学医学院中心实验室进行。①取妊娠13.5d昆明小鼠分离胚胎大脑中的神经干细胞,用添加碱性成纤维细胞生长因子的无血清培养基进行体外培养,取培养3d的神经球接种于多聚赖氨酸包被的培养瓶,用含血清的培养基诱导分化。②免疫细胞化学检测细胞表面抗原。③四甲基偶氮唑盐法绘制生长曲线。④流式细胞术检测细胞周期。⑤反转录-聚合酶链反应和免疫细胞化学技术对神经干细胞进行鉴定。结果:①胚胎神经干细胞及其分化细胞的抗原表达:血清诱导8h,分化细胞中(8.9±5.6)%细胞呈Tubulin阳性,(87.5±7.4)%细胞胞浆呈胶质纤维酸性蛋白阳性表达。未诱导细胞近100%呈巢蛋白阳性,仅有极少数细胞Tubulin阳性或胶质纤维酸性蛋白阳性。②胚胎神经干细胞的细胞周期:从小鼠胚胎大脑获取的神经干细胞3d左右进入指数生长期;原代培养细胞83.8%处于静止期/DNA合成前期。③原代与传代细胞均表达巢蛋白mRNA,聚集形成的神经球巢蛋白阳性。血清诱导4h胚胎神经干细胞开始转录神经元相关基因Tau和胶质细胞相关基因胶质纤维酸性蛋白。结论:从小鼠胚胎大脑可成功分离获得大量胚胎神经干细胞,并在含碱性成纤维细胞生长因子的条件培养基中迅速增殖,血清诱导下分化生成神经元和星型胶质细胞。     

小鼠胚胎神经干细胞的体外培养及增强型绿色荧光蛋白基因转染研究

目的：探索小鼠胚胎神经干细胞（neural stem cells．NSCs）的体外培养，探讨NSCs作为基因靶细胞．以及增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein，EGFP）标记NSCs的可行性。方法：胚胎小鼠脑组织分离神经干细胞，无血清细胞培养，免疫细胞荧光染色技术鉴定。NucleofectorTM转染仪将增强型绿色荧光蛋白基因转导入NSCs，用G418筛选，在荧光显微镜下观察并挑选EGFP表达最强的克隆．并做免疫荧光鉴定及诱导分化细胞的鉴定。结果：从胚胎小鼠脑组织分离的细胞具有连续克隆能力。表达神经上皮干细胞蛋白，诱导分化后的细胞表达神经细胞和星形胶质细胞特异性的蛋白。增强型绿色荧光蛋白报告基因转染神经干细胞后能高效表达，且不影响其增殖、分化能力。结论：小鼠胚胎神经干细胞能够在体外适宜的条件下进行长期培养；神经干细胞可直接作为基因靶细胞；转染EGFP的神经干细胞表达稳定且对NSCs的增殖和分化无明显影响。     

大鼠羊膜上皮细胞体外诱导可分化为类神经干细胞

背景：以往研究发现修复神经损伤的细胞来源主要有许旺细胞、嗅鞘细胞、神经干细胞、激活的巨噬细胞等,但这些细胞存在着来源困难、有成瘤性、异体排斥等缺点.而羊膜上皮细胞不存在以上缺陷,且具有多向分化潜能,经诱导后可向心肌样细胞、神经干细胞、肝细胞、成骨和软骨细胞等分化.目的：体外培养大鼠羊膜上皮细胞,并诱导其向类神经干细胞方向分化.方法：取妊娠晚期大鼠,采用胰酶消化法获得羊膜上皮细胞,用无血清的神经干细胞条件培养基对细胞进行诱导分化,并用免疫细胞化学法和RT-PCR对诱导前后的细胞相关标志物进行鉴定.结果与结论：形态学观察结果显示,条件培养基诱导后的羊膜上皮细胞胞体回缩,胞核部分折光性增强,出现类似于树突及轴突样结构,这些突起可交织成网状,细胞贴壁牢靠.免疫细胞化学检测结果显示,与诱导前相比,条件培养基诱导后的羊膜上皮细胞中巢蛋白、胶质纤维酸性蛋白荧光强度较强,而特异性胚胎抗原4、波形蛋白荧光强度较弱.RT-PCR检测显示,与诱导前相比,条件培养基诱导后的羊膜上皮细胞的巢蛋白、胶质纤维酸性蛋白、微管相关蛋白 mRNA 的表达增强,而平滑肌22α、Sox-2及Nanog mRNA的表达减弱.说明体外诱导的大鼠羊膜上皮细胞可成功分化为类神经干细胞.     

胶质细胞系源性神经营养因子修饰脂肪间质干细胞与共培养多巴胺能神经元的存活

背景:目前尚未见脂肪间质干细胞体外诱导分化成多巴胺能神经元的报道,且有关脂肪间质干细胞维持多巴胺能神经元存活的机制也缺乏实验证据.目的:观察腺病毒介导胶质细胞系源性神经营养因子基因修饰的脂肪间质干细胞对共培养条件下多巴胺能神经元存活的影响.设计、时间及地点:细胞学体外对比观察,于2007-03/12在吉林省耳鼻咽喉研究所和教育部吉林大学人兽共患病重点实验室完成.材料:3周龄Wistar大鼠、孕14dWistar大鼠由吉林大学白求恩医学院实验动物中心提供.方法:采用pAdTrackCV和pAdEasy-1系统构建重组胶质细胞系源性神经营养因子腺病毒.取孕14 d大鼠,采用酶消化法培养中脑多巴胺能神经元.取Wistar大鼠腹股沟处脂肪,酶消化法分离培养脂肪间质干细胞,体外培养至第3代当细胞生长至60%融合时,以病毒滴度为1 ×109vp/mL的胶质细胞系源性神经营养因子重组腺病毒作用细胞1 h后,转移到生长培养基继续培养,通过ELISA法检测培养上清胶质细胞系源性神经营养因子水平.设立3组:Ad-GDNF转染共培养组、Ad-GFP转染共培养组分别在脂肪间质干细胞经相应病毒转染24 h后加入分离的多巴胺能神经元,继续培养7 d;单纯多巴胺能神经元培养组不加入脂肪间质干细胞.主要观察指标:采用免疫荧光技术检测共培养环境对多巴胺能神经元存活的影响,共培养环境对胶质细胞系源性神经营养因子修饰脂肪间质干细胞分化的影响.结果:脂肪间质干细胞在pAd.GDNF转染24 h后细胞上清中出现胶质细胞系源性神经营养因子蛋白,72 h达高峰,pAd-GDNF对脂肪间质干细胞的转染效率约为80%.酪氨酸羟化酶免疫荧光染色结果发现,Ad-GDNF转染共培养组多巴胺能神经元存活率明显高于单纯多巴胺能神经元培养组、Ad-GFP转染共培养组(55%,15%,25%,P<0.01).对共培养7 d的细胞进行酪氨酸羟化酶免疫荧光染色,分别以波长为488 nm和563 nm进行单通道扫描,未发现同时表达绿色荧光蛋白和酪氨酸羟化酶的细胞,表明此共培养环境可能不具备诱导脂肪间质干细胞分化为多巴胺能神经元的条件.结论:胶质细胞系源性神经营养因子基因修饰的脂肪间质干细胞与胚胎中脑分离出的多巴胺能神经元共培养,能够维持和促进多巴胺能神经元的存活,但可能不具备诱导脂肪间质干细胞分化为多巴胺能神经元的作用.