GFP-ICP0融合蛋白在巨噬细胞中的表达与定位

目的 构建GFP—ICP0融合蛋白真核表达载体pEGFP／ICP0，并在巨噬细胞中表达，为研究ICP0对巨噬细胞分泌活性的影响提供实验依据。方法 将ICP0片段亚克隆入载体pEGFP—Cl，构建GFP-ICP0融合蛋白真核表达载体。将质粒pEGFP／ICP0转染巨噬细胞，Western blot鉴定表达产物，荧光显微镜观察GFP—ICP0融合蛋白在细胞内的表达与定位。结果 成功构建了GFP—ICP0融合蛋白真核表达载体pEGFP／ICP0，GFP-ICP0融合蛋白在巨噬细胞中表达并定位于细胞核。结论 pEGFP／ICP0在巨噬细胞中即时高表达GFP-ICP0融合蛋白并定位于细胞核。     

hDaxx及其删除突变体在真核细胞中的表达与鉴定

目的：构建N端融合有Ga14DBD的hDaxx及6种删除突变体（ΔhDaxx）真核细胞表达质粒，并在HT1080细胞中表达。方法：将hDaxxcDNA酶切片段连接到载体pM1或pM2相应位点，构建真核细胞表达质粒pM/hDaxx或pM/ΔhDaxx。用SuperFect^TM脂转染试剂将质粒转染HT1080细胞，细胞裂解液经SDS-PAGE及转硝酸纤维素膜后袋子作Western blot。结果：构建的pM/hDaxx及6种pM/ΔhDaxx能在HT1080细胞中高度表达hDaxx或ΔhDaxx。结论：N端融合有Ga14DBD的hDaxx及6种ΔhDaxx在真核细胞中成功表达。     

hDaxx融合蛋白高表达降低活化巨噬细胞分泌IL-1β

目的　研究GFP -hDaxx融合蛋白 (GFP -hDaxx)即时高表达对激活巨噬细胞分泌IL - 1 β的影响。方法　将GFP -hDaxx真核细胞表达载体pEGFP/hDaxx转染巨噬细胞 ,利用Westernblotting检测表达产物。通过hDaxx在巨噬细胞内的即时高表达 ,测定LPS刺激巨噬细胞后 0 .5h、4h、1 2h时 ,活化巨噬细胞分泌细胞因子IL - 1 β的含量。结果　pEGFP/hDaxx在巨噬细胞内成功表达GFP -hDaxx融合蛋白。GFP -hDaxx在巨噬细胞内的高表达 ,使LPS诱导活化的巨噬细胞分泌IL - 1 β量明显降低 (在4h及 1 2h时与对照组差异有显著性 ,P <0 .0 0 1 )。结论　hDaxx即时高表达降低活化的巨噬细胞分泌IL - 1 β。     

pEGFP-C2-GATA4真核表达载体的构建及在P19细胞中的表达

目的：构建小鼠GATA4基因融合绿色荧光蛋白真核表达载体pEGFP—C2-GATA4,并检验其在P19细胞中的瞬时表达．方法：以真核表达质粒pEFSA—GATA4为模板,PCR扩增得到小鼠GATA4基因片段,将目的片段亚克隆到pEG—FP—C2载体,卡那霉素筛选阳性克隆,经菌落PCR、酶切鉴定和测序鉴定．将重组质粒pEGFP—C2-GATA4以脂质体法瞬时转染P19细胞,用免疫细胞化学、共聚焦扫描显微镜、PCR、免疫印记法检测GATA4在P19细胞中的表达．结果：酶切、测序结果表明将基因片段GATA4正确插入pEGFP—C2载体,并可在P19细胞中检测到GATA4基因和GATA4-EGFP融合蛋白表达．结论：成功构建真核表达质粒pEGFP—C2-GATA4,并在P19细胞瞬时表达成功,为进一步研究GATA4在心脏发育中的作用奠定了基础．     

hDaxx及其删除突变体在原核细胞中的表达与鉴定

目的：将人Daxx(human Daxx,hDaxx)及其6种删除突变体（△hDaxx）在原核细胞大肠杆菌BL21（E.coli）中表达,以便在体外探索hDaxx的生物学活性。方法：用PCR方法从Hela细胞cDNAs文库中扩增全序列hDaxx cDNA,利用载体pQE3x构建了hDaxx及其△hDaxx质粒,通过异丙基－β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导E.coli表达相应蛋白质,并将其纯化。结果：IPTG能诱导hDaxx及其△hDaxx在E.coli中表达,表达产物纯化率达85％以上。结论：hDaxx及其6种△hDaxx能在E.coli中表达。     

幽门螺旋杆菌细胞毒素相关蛋白A真核表达载体的构建与表达

目的构建幽门螺旋杆菌（Helieobaeterpylori,Hp）细胞毒素相关蛋白A（cytotoxin—associatedprotein,CagA）基因表达载体并表达其编码蛋白。方法从胃黏膜活检标本中分离Hp,提取核酸,采用RT—PCR技术扩增CagA基因,将其克隆至pEGFP真核表达载体中,构建HpCagA基因真核表达载体并转染293-T细胞表达其编码蛋白。结果通过PCR、双酶切、测序鉴定证实CagA基因的真核表达载体构建成功,免疫印迹法证实CagA蛋白的表达。结论成功构建了HpCagA基因真核表达载体并表达其编码蛋白,为后期功能研究提供了材料和基础。     

hLMO1编码基因重组质粒的构建及蛋白的表达和定位

目的 构建hLMO1真核表达载体并证实融合蛋白在细胞内的表达及定位.方法 以人胎脑文库cDNA为模板,PCR扩增hLMO1基因cDNA全长,亚克隆至pEGFP表达载体中.将构建的重组质粒进行酶切测序鉴定,并转染到人上皮细胞---HEK293细胞中,提取细胞蛋白进行Western blot检测.利用激光扫描共聚焦显微镜观察pEGFP-hLMO1在HEK293细胞内的定位.结果 hLMO1基因cDNA全长克隆到了真核表达载体pEGFP中,酶切鉴定片段为471 bp.Western blot检测到了融合蛋白表达,分子量约为45 kDa.pEGFR-LMO1在人HEK293细胞核与细胞质均有表达.结论 成功构建了hLMO1基因cDNA全长的真核表达载体,pEGFP-LMO1蛋白定位于HEK293细胞的细胞质和细胞核内.     

F10基因与绿色荧光蛋白融合载体的构建及亚细胞定位

目的：构建F10基因与绿色荧光蛋白的融合蛋白表达载体，进而观察F10基因编码蛋白在细胞内的定位情况。方法：运用RT—PCR技术从葡萄胎组织中分离F10基因的完整ORF，构建pEGFP-N2／F10和pEGFP—C2／F10的融合表达载体，以1Apofect AMINE2000为介导剂，将重组载体转染入人乳腺癌细胞MCF-7，并在荧光显微镜和共聚焦显微镜下观察表达的融合蛋白。结果：显微镜下观察到，GFP／F10融合蛋白呈不规则的颗粒状、环状分布于细胞核，或细胞浆，或者在核浆中均有分布，而且在细胞浆中主要分布在细胞器中。而对照的pEGFP蛋白均匀分布在整个细胞浆和细胞核。结论：F10蛋白在细胞的不同周期分布不同，或在细胞核，或在细胞胞浆中，或者在核浆中均有分布。     

葡萄糖苷酶Ⅰ特异性siRNA-EGFP真核表达载体的构建及表达

目的:构建葡萄糖苷酶Ⅰ(glucosidaseⅠ, GluⅠ)特异性siRNA真核表达载体。方法:根据 siRNA靶序列选取原则,设计并合成针对鼠葡萄糖苷酶ⅠcDNA的寡聚DNA,退火并连接至载体 pSilencer1.0 U6,再将 U6 启动子及下游插入片断一起切下,克隆至真核表达载体 pEGFP C1,通过限制性酶切和测序对重组表达载体进行鉴定,最后将该质粒转染至HeLa细胞,共聚焦荧光显微镜观察其表达。结果:①限制性酶切和测序结果表明成功构建了带有EGFP基因的鼠GluⅠ特异性的siRNA真核表达载体 pC 1U6glu; ②共聚焦荧光显微镜观察结果表明p C1U6glu成功转染至HeLa细胞。结论:pC 1U6glu的成功构建及表达为进一步利用 siRNA研究葡萄糖苷酶Ⅰ的功能和治疗肿瘤奠定基础。     

新基因PRR11的克隆、真核表达载体的构建及鉴定

目的：克隆新基因PRR11的开放阅读框区,构建其真核表达载体,并进行表达检测及鉴定。方法：以HeLa细胞cDNA为模板,半定量RT-PCR扩增PRR11基因,克隆入真核表达载体pcDNA3.1中,酶切、测序鉴定确认获得PRR11基因的重组真核表达载体pcDNA3.1-PRR11。然后将pcDNA3.1-PRR11重组载体转染入HeLa细胞中,收集细胞,制备总RNA和细胞裂解液,采用半定量RT-PCR和蛋白质免疫印迹法检测目的基因表达情况。结果：成功扩增了PRR11基因,双酶切、测序鉴定证实目的基因成功克隆到真核表达载体pcDNA3.1中,测序结果表明序列完全正确,pcDNA3.1-PRR11真核重组表达载体构建成功。半定量RT-PCR和蛋白质免疫印迹法证实了转染入HeLa细胞中的目的基因表达成功。结论：成功构建了PRR11基因的真核表达载体,并可在HeLa细胞中成功表达,为进一步研究PRR11基因的功能奠定了基础。     

GFP-HPV16 E5融合蛋白在HeLa细胞内的表达与定位

目的 研究GFP-HPV16 E5融合蛋白在HeLa细胞内的表达与定位.方法 PCR扩增HPV16E5基因片段,将其连接到真核表达截体pEGFP-C1,双酶切及测序鉴定,构建表达截体pEGFP-C1/HPV16 E5;将质粒pEGFP-C1/HPV16 E5和pEGFP-C1分别转染HeLa细胞,在倒置荧光显微镜下现察GFP-HPV16 E5融合蛋白在HeLa细胞内的表达与定位.结果 GFP 荧光均匀分布在细胞浆和细胞核;GFP-HPV16 E5融合蛋白组荧光分布在细胞浆.结论 GFP-HPV16 E5融合蛋白能在HeLa细胞内表达且定位于细胞浆.     

人巨细胞病毒IE1真核表达载体的构建与表达

目的构建人巨细胞病毒（HCMV）IEl真核表达载体，观察其在真核细胞内的表达，为HC—MVIEl核酸疫苗的相关研究奠定基础。方法将质粒pNEBl93-IEl用Sal I、BamH I双酶切与载体pEGFP—C1连接构建重组载体pEGFP—C1-IEl；双酶切鉴定后，取重组载体pEGFP—C1-IEl用EcoR I 、Hind Ⅲ／双酶切与载体pcDNA3．1（-）连接构建重组质粒pcDNA3．I（-）-IEl，双酶切和测序鉴定；将重组质粒pcDNA3．1（-）-IEl转染HeLa细胞，RT—PCR检测IElmRNA的表达。结果重组载体pEGFP—C1-IEl和pcDNA3．1（-）-IEl双酶切后均可切出约1476bp目的片段；重组载体pcDNA3．1（-）-IEI测序结果登录C,enBank，作BLAST分析，含有1476bp目的基因片段，无碱基错配和移码突变，与读码框完全-致；转染重组载体pcDNA3．1（-）-IEl的细胞中可扩增出约1476bp的目的条带。结论成功地构建了真核表达载体pcDNA3．1（-）-IEl，且其能在真核细胞内袁达。     

SET-EGFP重组表达质粒的构建及表达

目的构建癌蛋白SET与增强型绿色荧光表达载体（EGFP）的融合表达质粒pEGFP—N2-SET并获得表达。方法根据人SET基因序列。设计了一对含有Kozak序列、终止密码子、HindⅢ和KpnI酶切位点的引物。从人L-02肝细胞提取总RNA，以逆转录后cDNA为模板，PCR扩增获得SET基因片段，经双酶切后回收得到有以上两个酶切位点的SET基因片段，将此基因片段克隆至相同酶切回收后的pEGFP—N2载体中，获得重组质粒pEGFP—N2-SET。以Lipofectamine^TM2000为载体，将构建好的真核表达质粒转染到L-02肝细胞中进行瞬时表达。结果。经DNA测序鉴定证实，pEGFP—N2-SET重组质粒构建成功，经荧光倒置显微镜观察，证实能在细胞内进行蛋白表达。结论SET表达质粒的成功构建及表达为其进一步结构和功能研究奠定了基础。     

鼠bcl-XL基因在CHO细胞中的表达

目的：构建携带鼠bcl-XL基因的真核表达载体，并将其在CHO细胞中表达。方法：用反转录PCR获取鼠bcl-XL全长cDNA序列，将其克隆进pEGFP重组融合表达质粒，脂质体法转染CHO细胞，荧光检测目的蛋白表达。结果：成功获得了鼠bcl-XL cDNA，构建了编码鼠bcl-XL的真核融合表达载体pEGFP-bcl-XL，转染CHO细胞后观察到融合蛋白表达。结论：鼠bcl-XL基因的克隆及融合表达，为进一步在高密度、大规模细胞培养中利用bcl-XL具有重要意义。     

人巨细胞病毒IE1-GFP融合蛋白真核表达载体的构建与鉴定

目的 构建增强型绿色荧光蛋白(GFP)与人巨细胞病毒(HCMV)IE1融合蛋白真核细胞表达载体,为IE1基因的表达和功能研究提供基础.方法 将质粒pNEB193-IE1和载体pEGFP-C1分别进行双酶切获得目的基因IE1片段和空载体,回收纯化后用T4连接酶将两者连接并转化E.coli JM109,用salⅠ、BamHⅠ双酶切后琼脂糖电泳鉴定阳性克隆.结果 双酶切pEGFP-C1-IE1后,琼脂糖电泳可见到大小约1476 bp的片段,与IE1预期片段大小一致,即IE1亚克隆入pEGFP-C1.结论 成功地构建了HCMV IE1-GFP融合蛋白真核表达载体pEGFP-C1-IE1.     

p38调节活化蛋白激酶绿色荧光蛋白融合载体的构建及表达

目的 构建在哺乳动物细胞中表达的PRAK绿色荧光蛋白融合表达载体。方法 将克隆在pET-14b上的PRAK亚克隆到绿色荧光蛋白载体pEGFP-C2上,随后转染Hela细胞,并在荧光显微镜下观察。结果 重组质粒经酶切、PCR和测序鉴定正确无误,并在Hela细胞中得到高量表达。融合蛋白发出的绿色荧光表明EGFP-PRAK主要分布在细胞核中。结论 成功构建了PRAK绿色荧光蛋白融合载体,该载体能在哺乳动物细胞中进行表达,为研究PRAK的细胞内定位和移位提供了一个重要的工具。     

p38调节活化蛋白激酶绿色荧光蛋白融合载体的构建及表达

目的构建在哺乳动物细胞中表达的PRAK绿色荧光蛋白融合表达载体.方法将克隆在pET-14b上的PRAK亚克隆到绿色荧光蛋白载体DEGFP-C2上,随后转染Hela细胞,并在荧光显微镜下观察.结果重组质粒经酶切、PCR和测序鉴定正确无误,并在Hela细胞中得到高量表达.融合蛋白发出的绿色荧光表明EGFP-PRAK主要分布在细胞核中.结论成功构建了PRAK绿色荧光蛋白融合载体,该载体能在哺乳动物细胞中进行表达,为研究PRAK的细胞内定位和移位提供了一个重要的工具.     

p38MAPK红色荧光蛋白融合载体的构建及表达

目的 构建在哺乳动物细胞中的表达的p38丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）红色荧光蛋白（RFP）融合表达载体。方法 将克隆在pcDNA3上的FLAG标记的p38MAPK亚克隆到红色荧光蛋白载体pDsRed1-N1上，随后转染HeLa细胞。在荧光显微镜下观察。结果 结果 重组质粒经酶切，PCR和测序证明正确无误，并在HeLa细胞中得到高量表达，融合蛋白发出的红色荧光表明p38MAPK弥散分布于细胞质中，细胞核中也有一定的分布。结论 成功构建了p38MAPK红色荧光蛋白融合载体。该载体能在哺乳动物细胞中进行表达，为研究p38MAPK的细胞内定位提供了一个重要的工具。     

构建及在血管内皮细胞中的表达

目的:构建人血管内皮细胞生长因子165(VEGF165)及绿色荧光蛋白报告基因的融合蛋白真核表达质粒,并检测其在血管内皮细胞中的表达.方法:采用PCR扩增VEGF165基因全长,并将其定向克隆入pEGFP-N1的多克隆位点,构建pEGFP/VEGF165重组质粒,经酶切、PCR及序列分析鉴定,脂质体介导转染体外培养的血管内皮细胞,荧光显微镜、RT-PCR及Western免疫印迹等方法检测EGFP/VEGF融合蛋白的表达.结果:PCR、酶切及测序证实目的基因VEGF165正确连接至pEGFP-N1的多克隆位点,pEGFP/VEGF165重组质粒转染血管内皮细胞后,荧光显微镜、RT-PCR及Western免疫印迹检测均显示EGFP/VEGF蛋白在血管内皮细胞中表达.结论:成功构建了携带人VEGF165及EGFP报告基因的融合蛋白真核表达质粒,pEGFP/VEGF165可在血管内皮细胞中表达,此为进一步研究VEGF基因治疗缺血性血管疾病奠定了实验基础.