体外构建的HSP70—肝癌抗原肽诱导抗原肽特异性免疫反应

目的：研究体外构建的HSP70-肝癌抗原肽复合物诱导针对肝癌的特异性免疫反应能力,为该复合物的临床应用奠定基础。方法：在体外构建HSP70-肝癌抗原肽复合物,联合应用粒/巨细胞集落刺激因子（GM-CSF）及白介素-4-（IL-4）直接从志愿者外周血中培养出DC;以HSP70、HSP70-肝癌抗原肽、抗原肽分别刺激DC,DC激活同源的T淋巴细胞产生细胞毒性T淋巴细胞（CTL）,检测其杀伤72细胞和肝癌细胞系的能力。结果：HSP70-肝癌抗、抗原肽均可诱导CD8^ 的抗原肽特异性CTL,而前者的诱导效果更强。结论：体外构建的HSP70-抗原肽复合物具有免疫原性,HSP70可以增强抗原肽诱导特异性免疫反应的能力,HSP70-抗原肽复合物有可能作为肽疫苗用于临床肿瘤免疫治疗。     

体外构建的HSP70-肝癌抗原肽诱导抗原肽特异性免疫反应1

目的研究体外构建的HSP70-肝癌抗原肽复合物诱导针对肝癌的特异性免疫反应能力,为该复合物的临床应用奠定基础.方法在体外构建HSP70-肝癌抗原肽复合物,联合应用粒/巨细胞集落刺激因子(GM-CSF)及白介素-4(IL-4)直接从志愿者外周血中培养出DC;以HSP70、HSP70-肝癌抗原肽、抗原肽分别刺激DC,DC激活同源的T淋巴细胞产生细胞毒性T淋巴细胞(CTL),检测其杀伤T2细胞和肝癌细胞系的能力.结果HSP70-抗原肽、抗原肽均可诱导CD8+的抗原肽特异性CTL,而前者的诱导效果更强.结论体外构建的HSP70-抗原肽复合物具有免疫原性,HSP70可以增强抗原肽诱导特异性免疫反应的能力,HSP70-抗原肽复合物有可能作为肽疫苗用于临床肿瘤免疫治疗.     

可溶性PD-1协同HSP70-肽复合物抑制荷瘤小鼠肝癌的研究

目的 :研究基因转染和表达的可溶性PD 1(solubleprogrammeddeath 1,sPD 1)对HSP70 肽疫苗抗肿瘤效果的影响及协同机制。方法 :以HSP70 肽疫苗免疫BALB/c小鼠后 ,用半定量RT PCR技术检测和分析HSP70 肽疫苗对小鼠脾细胞上PD 1及其配体基因表达的影响。体内转染表达sPD 1,用MTT比色法检测HSP70 肽疫苗免疫小鼠对肿瘤生长的抑制作用以及脾淋巴细胞的细胞毒活性。结果 :单独的sPD 1就有抗肿瘤效应。HSP70 肽疫苗不仅能预先在动物体内诱导肿瘤特异性的CTL ,而且可使脾细胞上抑制性共刺激受体PD 1及其配体的表达显著升高。用sPD 1与HSP70 肽疫苗联合治疗荷瘤小鼠 ,能提高脾CTL的杀伤效率并延长HSP70 肽疫苗的免疫效果。结论 :sPD 1可通过阻断PD 1与其配体的结合作用 ,及减弱PD 1的负反馈抑制作用 ,而增强HSP70 肽疫苗的抗肿瘤效应     

TLR4在HSP70_(EC-TCV)冲激的DC成熟过程中的作用

观察TLR4在Hca-F榄香烯复合瘤苗来源的HSP70(HSP70EC-TCV)冲激处理的小鼠骨髓来源的DC成熟过程中的作用。用rmGM-CSF和rmIL-4诱导小鼠骨髓来源的DC,以HSP70EC-TCV或加入抗TLR4抗体30 min后再用HSP70EC-TCV冲激处理DC,流式细胞仪检测DC的CD40和CD86表达,ELISA法检测DC上清中IL-12和T细胞上清中IL-2浓度,MTT法检测T细胞对Hca-F细胞的杀伤率。结果表明,抗TLR4抗体对DC的CD40和CD86表达无明显影响,但对HSP70EC-TCV诱导DC分泌IL-12和进而致敏的T细胞分泌IL-2及产生杀瘤功能有明显的抑制作用。TLR4信号通路参与HSP70EC-TCV诱导DC成熟过程。     

纳米微粒偶联抗OX40/抗AFP抗体在细胞毒性T细胞抗肝癌中的作用

目的探讨乳酸-羧基乙酸共聚物(PLGA)制备的纳米微粒偶联抗OX40及抗AFP抗体(抗OX40/抗AFP-NP)对甲胎蛋白AFP158-166抗原肽特异性细胞毒性T细胞(CTL/AFP158-166)体外杀伤肝癌细胞的影响。方法用溶剂蒸发法制备纳米微粒(NP),并与抗OX40和抗AFP共价偶联。用扫描电镜观察所制得PLGA-NP纳米颗粒的形态;ZetaPlusTM粒度测定仪检测纳米微粒的粒径及电荷;用BCA蛋白定量方法检测纳米微粒偶联抗体的效率;用人外周血单核细胞诱导形成树突状细胞(DC),用AFP158-166抗原肽负载DC诱导AFP特异性的CTL/AFP158-166;分别用2-(4-碘苯)-3-(4硝基苯)-5-(2,4-磺苯基四氮唑)-2H-四唑单钠盐-1法(WST-1)法、ELISA及乳酸脱氢酶(LDH)法分别检测抗OX40/抗AFP-NP对CTL/AFP158-166细胞增殖能力、分泌IL-2和IFN-γ及杀瘤活性的影响。结果所制得的PLGA-NP为圆形,大小较均一,粒径约为(300±42)nm,带负电荷,约为-(25.12±5.34)mV。蛋白定量显示每mg的PLGA-NP偶联约100μg抗体,偶联效率为25%;增殖和活化实验显示偶联有抗OX40的纳米微粒能显著刺激CTL的增殖、IL-2和IFN-γ的分泌;杀伤实验显示,抗OX40/抗AFP-NP能显著增强AFP特异性CTL/AFP158-166细胞对HepG2细胞特异性杀伤作用,而对SMMC-7721杀伤作用无明显效果。结论抗OX40/抗AFP-NP能刺激CTL/AFP158-166细胞的增殖、细胞因子的分泌并增强CTL/AFP158-166细胞对AFP阳性肝癌细胞的特异性杀伤作用。     

两种HCV不同结构基因重组质粒DNA诱导免疫应答的比较研究

目的：探讨丙型肝炎病毒（HCV）包膜基因E1E2,对核心基因CDNA疫苗诱生的免疫应答有无增强作用。方法：构建包含HCVC或CE1E2基因片段的真有达载体pHCV-C和pHCV-CE1E2,分别接种于Balb/c小鼠股四头肌（以空载体pcDNA3作为对照）,每间隔2wk l次,用ELISA法检测免疫小鼠血清中抗HCVC特异性抗体的产生。以pHCV-C转染并表达HCcAg r S p2/0细胞为靶细胞,采用^51Cr翻译放试验检测特异性CTL的杀伤作用。结果,两个实验免疫的20只小鼠均产生抗HCV C特异性抗体,当前／靶细胞比例为100：1时,CTL的杀伤率均明显高于对照组（P＜0．01）;pHCV-CE1E2与pHCV-C组之间,无论是抗HCV C抗体的滴度还是CTL的杀伤率均无显著性差异（P＞0．05）。结论E1E2基因的加入,并没有增加HCV C基因DNA疫苗诱导的抗HCcAg特异性抗体的滴度和CTL的杀伤作用。     

HBV感染者血清抗TRP-1抗体与HSP70检测及相关性分析

目的 检测HBV感染者血清抗TRP-1抗体及HSP70,并对二者的相关性进行分析.方法 选取HBV感染组血清标本88例,其中大三阳组28例,小三阳组60例;抗体阳性组标本64例,其中既往感染组32例,疫苗接种组32例;全阴性对照组64例.用ELISA法检测所有标本抗TRP-1抗体及HSP70表达水平,对各组检测结果进行统计并分析两者的相关性.结果 大三阳组、小三阳组、既往感染组、疫苗接种组、全阴性对照组血清标本中抗TRP-1抗体的OD值依次为2.071±0.574、1.855±0.873、0.166±0.068、0.220±0.048和0.260±0.034,抗TRP-1抗体阳性率分别为92.86％(26/28)、83.33％(50/60)、0％(0/32)、0％ (0/32)和0％ (0/64).HSP70检测的OD值分别为2.135±0.456、1.816±0.874、0.165±0.073、0.166±0.042和0.206±0.033,高水平的HSP70占有率分别为100％(28/28)、83.33％(50/60)、0％(0/32)、0％(0/32)和0％ (0/64).经比较HBV感染组抗TRP-1抗体与HSP70表达水平显著高于抗体组及全阴性对照组(P＜0.01).高水平的抗TRP-1抗体与HSP70表达水平呈正相关(r=0.926,P＜0.01).抗体组与全阴性对照组之间比较,差异无统计学意义(P＞0.05).结论 大部分HBV感染者体内同时存在高水平抗TRP-1抗体及HSP70,两者呈正相关,可能是该类患者黑素细胞遭受破坏的早期标志,也是继发白癜风的重要原因.     

HSP70多肽复合物修饰树突细胞抗胰腺癌研究

目的：研究肿瘤热休克蛋白70（HSP70）多肽复合物修饰树突状细胞激活淋巴细胞治疗胰腺癌的策略和方法。方法：采用低渗裂解，ConA—Sepharose亲和层析柱及ADP—Agarose亲和层析柱，从小鼠胰腺癌（MPC83）瘤块中纯化HSP70多肽复合物；纯化出的70KD蛋白修饰小鼠骨髓来源诱导树突细胞（DC）并制备树突细胞HSP70多肽肿瘤疫苗，MTT法检测修饰后DC增殖活性；用修饰后DC激活小鼠脾淋巴细胞，MTT法检测激活淋巴细胞在不同效靶比下对MPC83的体外杀伤活性。结果：获得较高纯度分子量为70kD左右的蛋白质；50～100ng HSP70多肽复合物可修饰10^4树突细胞，每克瘤块能获取HSP70多肽复合物约100μg；来自MPC83细胞瘤块HSP70多肽复合物激活的淋巴细胞能特异性杀伤MPC83细胞。结论：采用低压亲和层析柱可从胰腺癌瘤块中获得较高纯度HSP70多肽复合物，HSP多肽复合物DC疫苗用于胰腺癌细胞免疫治疗能获得体外杀伤效果，为临床胰腺癌生物免疫治疗奠定基础。     

TLR4介导HSP70BCG诱导的小鼠骨髓树突状细胞分泌IL-12

目的观察TLR4（Toll—likereceptor4）在卡介苗来源的热休克蛋白70（heat shock protein 70,HSP70DCG）冲激的小鼠骨髓来源树突状细胞（dendritic cells,DCs）的IL-12分泌的作用。方法用rmGM—CSF和rmIL-4诱导小鼠骨髓来源的DCs,在HSP70BCG冲激前加入抗TLR4抗体,用流式细胞仪检测DCs的CIM0和CD86表达;用ELISA法检测DCs上清液中的IL-12和脾T细胞上清液中的IL-2浓度。结果抗TLR4抗体对CIMO和CD86的表达无明显影响,但明显抑制DCs分泌IL-12并进而抑制DCs致敏的脾细胞分泌IL-2。结论HSP70BCG可通过TLR4途径诱导DCs分泌IL-12。     

HSP70-TKD 诱导的NK 细胞向肿瘤细胞迁移的实验研究

目的:研究HSP70-TKD 诱导的自然杀伤细胞(NK)体外对细胞表面HSP70 表达不同的胰腺癌细胞和结肠癌细胞的迁移作用差异。方法:用干细胞培养基富集人外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell,PBMC)至第10 天加入2 g/ ml TKD,4 d 后用流式细胞仪检测NK 细胞表面杀伤性受体CD94/ NKG2C 的表达情况;应用流式分选将胰腺癌细胞系Colo357 和结肠癌细胞系CW2 分为HSP70 高表达细胞亚系Colo+ 、CW2+和HSP70 低表达细胞亚系Colo- 、CW2- ;Transwell 小室实验检测HSP70-TKD 诱导的NK 细胞对这4 种细胞的迁移能力,MTT 法检测HSP70-TKD 诱导的NK 细胞对这4 种细胞的杀伤活性。结果:流式结果显示NK 细胞在干细胞培养基中培养14 天可大量增殖,细胞纯度最高达(92.50 依1.25)%; 经HSP70-TKD 诱导后,NK 细胞表面杀伤性受体CD94/ NKG2C 的表达明显增加;经流式分选后,Colo+ 、Colo- 细胞表面HSP70 的表达分别为(78.2±2.2)%和(27.3±1.2)%,而CW2+ 、CW2- 细胞表面HSP70 的表达分别为(91.1±2.5)% 和(18.2±1.0)%;HSP70-TKD 诱导的NK 细胞对Colo+迁移率为(68.6±2.8)%,明显高于对Colo- 的迁移率(22.8±1.5)%,NK 细胞对CW+ 迁移率为(73.5±2.7)%,明显高于对CW2-的迁移率(18.2±1.3)%;HSP70-TKD 诱导的NK 细胞对Colo+ 、Colo- 的杀伤活性有显著性差异,当效靶比为20 ：1时,杀伤活性分别为(61.2±3.0)%、(24.5 ±1.5)%, NK 对CW2+ 、CW2- 的杀伤活性有显著性差异,当效靶比为20 ：1时,杀伤活性分别为(63.8±3.2)%、(22.4±1.8)%。结论:HSP70-TKD 诱导的NK 细胞是一种新型、高效的免疫活性细胞,在体外易向HSP70 表达阳性的肿瘤细胞迁移。     

丙型肝炎病毒核心基因疫苗诱导小鼠细胞及体液免疫应答

为了探索丙型肝炎病毒核心区基因疫苗对小白鼠细胞及体液免疫功能的影响。本文将ＨＣＶ核心区基因定向克隆于质粒ｐｃＤＮＡ３巨细胞病毒启动子下游,构建了能在真核细胞内表达的重组基因疫苗ｐｃＤＮＡ３－ＨＣＶ,将此疫苗通过多点肌肉注射免疫ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠。结果发现接种了该疫苗的小鼠出现抗－ＨＣＶＩｇＧ阳性,其抗体水平明显高于对照组,同时Ｔｈ１免疫应答相关的细胞因子ＩＬ－２及γ干扰素水平也明显高于对照组,其结果     

The role of perforin in infections and tumour surveillance

Cytotoxic T lymphocytes (CTLs) and natural killer (NK) cells are able to lyse suitable target cells. CTLs recognize a specific peptide epitope presented by major histocompatibility complex (MHC) class I molecules on the target cells, whereas NK cells lyse targets that express no or low MHC class I molecules. Using perforin-deficient mice, we provide evidence that both NK cells and CTLs exclusively use perforin-dependent cytolysis as an effector mechanism in vitro, as well as in vivo. This review summarizes the most important role of perforin-dependent cytolysis in a wide variety of bacterial and viral infections, in tumour surveillance, in immunopathology and in autoimmunity.     

汉坦病毒诱导人脐静脉内皮细胞HSP70的表达及意义

目的: 研究人脐静脉内皮细胞 (HUVEC)感染汉坦病毒(Hantavirus, HTV)后应激反应的规律及意义。方法: 采用免疫细胞化学染色法和核酸分子原位杂交, 检测热休克蛋白 70(HSP70)的表达; 用RT --PCR观察HSP70mRNA水平变化的规律。结果: HTV感染HUVEC后, 免疫细胞化学染色法可检出HSP70呈高表达, 原位杂交发现细胞质内有HSP7mRNA的阳性信号。感染后不同时间点RT- PCR的结果表明与对照组相比较, HSP70mRNA的水平在感染后迅速升高并持续高表达 (P<0. 05 )。结论: HTV可诱导HUVEC高表达HSP70。HSP70可能具有抑制病毒复制和保护内皮细胞的作用。     

The serology of hepatitis C virus (HCV) infection: antibody crossreaction in the hypervariable region 1

Summary We determined the NS1/E2 N-terminal sequence including the hypervariable region 1 (HVR1) from five individuals chronically infected with HCV: two from the Czech Republic and three from Germany. From each sequence, six 12-mer overlapping peptides were synthesized and used in a peptide scan to evaluate seroreactivity of each of those patients, as well as three anti-HCV positive blood donors to the different isolates. We could show the general presence of antibodies to multiple HVR1 specific sequences reflecting the existence of multiple variants in infected persons. Finally, we observed the persistance of HCV infections in all individuals despite an active humoral response directed against the virus.     

抗一HCV阳性无病毒血症患者HCV特异性免疫反应研究

目的 研究抗ＨＣＶ阳性无病毒血症患者特异的体流及细胞免疫状态。方法 对１５例抗ＨＣＶ阳性无病毒血症患者,１５例慢性ＨＣＶ持续感染者及１５例正常对照者进行研究。通过ＭＴＴ、ＬＤＨ释放法、酶联免疫等方法观察患者外周Ｔ细胞反应、自然杀伤（ＮＫ）细胞活性、细胞因子分泌及特异性体液免疫反应。结果 无病毒血症者Ｔ细胞增殖反应明显大于持续感染者及对照组,并且Ｔ细胞对核心区抗原增殖最大,ＮＳ３次之,对ＮＳ５则无明     

Interaction between HSP70 homolog and filamentous virions of the Beet yellows virus

An HSP70 homolog (HSP70h), encoded by the Closterovirus Beet yellows virus (BYV), functions in viral movement from cell to cell. A previous study revealed that in infected cells, HSP70h colocalizes with the masses of BYV filamentous virions. Here we demonstrate that HSP70h forms a physical complex with BYV virions. This conclusion is based on both the comigration of HSP70h with BYV virions in sucrose density gradients and the coimmunoprecipitation of the HSP70h and BYV capsid protein using anti-HSP70h serum. The HSP70h-virion complex is stable at high concentrations of sodium chloride; its dissociation using sodium dodecyl sulfate, lithium chloride, or alkaline pH was accompanied by virion disassembly. However, the complex formation does not involve covalent bonds between HSP70h and virion components. Each BYV virion contains approximately 10 molecules of HSP70h. The possible role of HSP70h interaction with the virions in cell-to-cell movement of BYV is discussed.     

榄香烯复合瘤苗的HSP70表达及其主动免疫预防效应

为进一步阐明本室专利榄香烯复合瘤苗(EC-TCV)的主动免疫效应与其HSP70-肿瘤肽之间的关系,本文以42℃热休克(H)为对照,首先检测了榄香烯(E)、丝裂霉素C(MMC)、戊二醛(G)单独或复合处理时对小鼠HCa-F肝癌、L615白血病细胞膜HSP(HSP70、HSP90)表达的影响,发现只有膜HSP70的表达在两种榄香烯复合瘤苗中均升高,随后以E-MMC复合处理的HCa-F细胞中提纯的HSP70-肿瘤肽(HHSP70)为免疫原,以小鼠HCa-F肝癌细胞为模型,研究了HHSP70的主动免疫预防效应及其特异性。结果表明,E、MMC、G同H相似,也具有应激原作用,能诱导应激蛋白HSP70的表达;而且HSP70在HCa-F和L615两种肿瘤细胞均以E-MMC-G三者复合处理时为最高;HHSP70能诱发机体产生主动抗瘤效应,且这种效应有一定的肿瘤特异性。     

Hepatitis C virus infection and diabetes mellitus in end-stage renal disease: evidence of a negative association

Epidemiological studies have implicated hepatitis C virus (HCV) infection in the pathogenesis of diabetes mellitus (DM) both in the population as a whole and after solid organ transplantation. Whether this association exists in patients with end-stage renal disease (ESRD) undergoing dialysis is unclear. The aim of this study is to investigate the relationship between HCV and DM in a large group (n=742) of patients with ESRD from Europe and North America. The presence of diabetes was ascertained by using American Diabetes Association guidelines based on fasting glucose measurement and medication history. Presence of HCV infection was assessed by serum testing for anti-HCV antibodies. The prevalence of anti-HCV antibody positive patients was 15% (112/742); the frequency of DM was higher among anti-HCV positive than -HCV negative patients but the difference did not approach statistical significance, 32% (36/112) vs 29.5% (186/630). The frequency of patients with diabetic nephropathy was not higher in anti-HCV positive than -negative patients; 21.4% (24/112) vs 23.3% (147/630), NS. Logistic regression model showed an independent and significant link between anti-HCV seropositive status and raised GPT (P=0.032), male gender (P = 0.0462), positive history of prior renal transplant (P=0.0006), and longer time on dialysis (P=0.00001). In summary, no link between anti-HCV antibody and DM occurred in this ESRD population; there was no association between rate of anti-HCV antibody and diabetic nephropathy.