人FOXP3 cDNA的克隆及在原核细胞中的表达

目的:克隆人FOXP3cDNA,构建其原核表达载体,在大肠杆菌中表达。方法:从新生儿脐带血获得FOXP3mRNA,用巢式RT-PCR技术扩增FOXP3cDNA,产物纯化后T-A克隆连接至pMD18-T载体,构建其原核表达载体pRSET-A-FOXP3,转化大肠杆菌BL-21(DE3)pLysS,IPTG诱导,表达产物经SDS-PAGE及Western blot检测和鉴定。结果:获得FOXP3mRNA,并对其编码区cDNA序列进行扩增。PCR产物连接至原核表达载体pRSET,经DNA测序,证实与Gen-Bank中的人FOXP3编码序列一致。经SDS-PAGE及Western blot显示在相对分子质量(Mr)约为52000处出现融合表达条带,表达量约占菌体蛋白总量的20%。结论:成功地克隆人FOXP3cDNA,构建了其原核表达载体,并在大肠杆菌中得到有效表达。     

重组人脑髓鞘碱性蛋白及其抗体的研究

将EcoR1和SalⅠ酶切的人脑髓鞘碱性蛋白（MBP）基因cDNA克隆片段与表达载体pGEX-5T重组后转化大肠杆菌，经筛选，增殖和IPTG诱导，阳性克隆SDS－PAGE结果证实表达一条特异42KDa区带，Western印记杂交证实该区带具MBP抗原特异性，免疫斑点杂交和ELISA检测表达产量占菌体可溶性蛋白含量6％，达到414.6mg/L菌液，将含可溶性MBP蛋白的菌液后SDS－PAGE分离纯化得重组MBP抗原，对新西兰兔进行背部皮下多点注射，5次免疫后以琼脂板免疫双扩法检测抗效价达1：16，并通过免疫斑点杂交和Western印亦杂交证实证抗体具抗MBP特异性。     

人破骨细胞生成抑制因子在真核细胞中的表达

目的 克隆人破骨细胞生成抑制因子（OPG／PCIF）编码区基因并在真核细胞中表达，为进一步研究OPG／OCIF的生理功能及探讨骨质疏松症等疾病的治疗奠定基础。方法 以人骨肉瘤细胞系MG63的mRNA为模板，采用RT－PCR法得到人OPG／OCIF的编码区cDNA，构建真核表达载体并转染成肌细胞，应用核酸杂交及western blot法证实OPG／OCIF在真核细胞中表达。结果 获得人破骨细胞生成抑制因子（OPG／OCIF）编码区全长cDNA，经序列测定证实与文献报道的OPG／OCIF编码区基因的核苷酸序列完全一致。成功构建OPG／OCIF真核表达载体pcDNA3-OPG。重组质粒转染小鼠成肌细胞C2C12，建立稳定转染OPG／OCIF编码区cDNA的细胞系，经核酸杂交及western blot法证实OPG／OCIF在真核细胞中表达。结论 获得人破骨细胞生成抑制因子（OPG／OCIF）编码区全长cDNA并证实在真垓细胞中表达，为OPG／OCIF进一步的功能研究奠定了基础。     

谷胱甘肽转硫酶-血小板因子4融合蛋白表达载体的构建、鉴定与表达

目的 构建谷胱甘肽转硫酶－血小板因子4（GST－PF4）融合蛋白表达载体，并研究其编码的蛋白质在大肠杆菌中的表达。方法 通过RT－PCR方法，从HL－60细胞中克隆PF4cDNA，然后克隆至载体pUC19中，序列测定后把PF4基因重组入谷胱甘肽转硫酶融合基因表达载体pGEC-4T-3中，并用IPTG诱导其在大肠杆菌中表达。结果 获得了PF4 cDNA。序列分析表明，该序列与GenBank数据库中的序列一致。重组质粒酶切鉴定表明，PF4基因已正确插入到pGEX-4T-3中。重组融合蛋白表达载体GST－PF4经IPTG诱导表达，在SDS－PAGE后得到1条蛋白表达带，相对分子质量（Mr)约为36000。结论 成功地构融合蛋白表达载体GST－PF4，并大肠杆菌中获得有效表达，为进一步研究打下良好的基础。     

人酪氨酸激酶6原核表达载体的构建、表达、纯化与鉴定

目的构建人络氨酸激酶6(PTK6)与His融合蛋白重组表达载体,在大肠杆菌中诱导表达,并对重组蛋白进行纯化。方法通过PCR在编码PTK6的cDNA序列两端添加EcoR I和BamH I酶切位点,双酶切后将编码PTK6的cDNA序列亚克隆至原核表达载体PHUE构建重组蛋白表达载体PHUE/PTK。重组载体经鉴定后转化大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)感受态细胞。IPTG诱导重组蛋白表达。收集菌体裂解后,用尿素洗涤和溶解包涵体。溶解上清经Ni-NTA亲和层析柱纯化,并用SDS-PAGE和Western blotting检测纯化产物。结果成功构建人PTK6重组蛋白原核表达载体,重组蛋白以包涵体形式表达,其相对分子质量为55 000,与预期一致。亲和层析纯化产物的SDS-PAGE和Western blotting鉴定表明获得纯度大于80%的目的重组蛋白。结论人PTK6 His融合蛋白的纯化为多克隆及单克隆抗体的制备以及结构和功能的研究奠定了基础。     

肿瘤睾丸抗原OY-TES-1氨基端截短蛋白及其多克隆抗体的制备

目的获得原核表达的OY-TES-1氨基端截短蛋白(OY-TES-1-N),并制备其多克隆抗体。方法扩增编码OY-TES-1-N 268个氨基酸(A6-R273)的cDNA序列;将PCR产物插入原核表达载体pMAL-C2,构建重组质粒,并转化DH5α菌;通过蓝白斑筛选、DNA测序筛出阳性菌;在优化条件下用IPTG对阳性菌进行诱导表达MBP/OY-TES-1-N融合蛋白;上Amyloseresin亲和层析柱纯化,行Western blot鉴定。以融合蛋白作为抗原免疫新西兰白兔制备抗血清,经活化琼脂糖微球纯化后,采用ELISA法及Western blot法分别检测抗血清的效价和多克隆抗体的特异性。结果成功诱导表达出MBP/OY-TES-1-N融合蛋白。以该蛋白免疫新西兰兔制备抗血清,抗体效价为1∶1 000,Western blot检测证实该抗体能与目的蛋白发生特异性结合。结论成功地表达并纯化了MBP/OY-TES-1-N融合蛋白,并制备了特异性多克隆抗体。     

人神经生长因子β亚基cDNA的克隆及在大肠杆菌中的表达

目的:从海马组织提取中国人神经生长因子基因(NGFβ),分析中国人NGFβ序列,再克隆成熟肽部分,使NGFβ在大肠杆菌中表达。方法:提取组织总RNA进行逆转录,克隆到PCRⅡ载体,得650bpDNA片段,以PCRⅡ/NGFβ载体为模板,扩增C端成熟肽部分,并克隆到PG5中,转化大肠杆菌BL21用异丙基-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导培养。表达产物提纯、复性后,进行活性测定。结果:NGFβ cDNA全序列为1 047 bp,所克隆的蛋白编码部分为636 bp,由212个氨基酸组成,序列分析结果与Genebank完全一致,成熟肽部分表达后,经SDS-PAGE电泳在14kD左右有1条明显的新增蛋白带,与预期的分子量相符,并Western印迹证实,rNGF约占菌体蛋白10%左右。结论:通过序列分析证实,重组NGFβ在大肠杆菌中获得较高水平的表达,并有免疫活性。     

小鼠脂多糖应答蛋白LRP的大肠杆菌表达及其兔抗血清抗体的制备

目的：原核表达小鼠脂多糖应答蛋白并制备兔抗mLRP抗血清.方法：参考GenBank中已登录的人lrp-cDNA序列,对小鼠的同源表达序列标签（EST）序列进行拼接,预测mlrp cDNA序列.用设计的引物,进行RT-PCR,从脂多糖刺激的NIH3T3细胞中扩增mlrp的cDNA序列,克隆入pTAT载体中,构建mlrp的原核表达载体.以其转化在大肠杆菌中诱导表达后,将获得的His-TAT-mLRP融合蛋白免疫家兔,用丙酮沉淀全菌蛋白吸附法制备纯化的抗mLRP血清,用Western blot鉴定抗体的特异性.结果：预测的mlrp cDNA的长度为1 905 bp.将克隆获得的1 554 bp大小的mlrp-cDNA编码区序列插入pTAT质粒中,在大肠杆菌中表达出His-TAT-mLRP融合蛋白.以其免疫家兔,制备了特异性兔抗mLRP的血清.结论：mlrp的原核表达及特异性兔抗mLRP血清的制备,为进一步研究mLRP的功能奠定了基础.     

点带石斑鱼抗菌肽hepcidin基因克隆及其成熟肽的原核融合表达

目的克隆点带石斑鱼hepcidin前体cDNA序列,构建其成熟肽pET-32a融合表达载体。结论根据已报道的硬骨鱼类hepcidin cDNA序列设计简并引物,以点带石斑鱼（Epinephelelus malabaricus）肝脏为材料,通过RT-PCR扩增hepcidin cDNA序列,用比对推导的氨基酸序列预测其成熟肽段。再将成熟肽cDNA序列亚克隆至pET-32a构建原核表达并进行原核融合表达。结果获得点带石斑鱼hepcidin-like抗菌肽前体cDNA序列1条,GenBank登录号为HM474788。DNA序列的Blast分析以及推导氨基酸序列NJ进化树分析表明,HM474788是点带石斑鱼第1条报道的抗菌肽hepcidin cDNA序列。成功构建了该序列的成熟肽原核融合表达载体pET-32a-hepcidin（EM1）,并成功在大肠杆菌origami（DE3）中表达。结论成功克隆点带石斑鱼hepcidin-like抗菌肽前体cDNA序列,成熟肽成功在大肠杆菌中融合表达,为后续有关石斑鱼hepcidin的功能研究与实践应用奠定重要基础。     

全长人穿孔素cDNA的克隆与3′端部分表达

目的 克隆人穿孔素（perforin,PFP)基因并选择性地体外表达抗原特异性C端肽段。方法 利用RT－PCR技术,从人肝总RNA中克隆全长PFP cDNA并进行序列测定分析。将编码PFPC端（hPFP-C)125个氨基酸的cDNA片段亚克隆,并插入载体pGEX-2T中用IPTG诱导融合蛋白表达。目的肽段采用谷胱基肽琼脂糖亲和层析和凝血酶酶切纯化,并用血法测定其生物学活性。结果 克隆的全长人PFP cDNA与已发表的PFP基因序列相比较,有4个碱基不同,导致3个氨基酸残基改变。重组基因在大肠杆菌BL21（DE3）中诱导表达的融合蛋白的相对分子质量（Mr)为４００００,纯化后的hPFP-C肽段Mr为14000。重组hPFP-C肽段与兔红细胞共育,呈现钙依赖的血活性。结论 人PFP基因可能存在多态性,其C端肽段亦有溶解兔红细胞的活性。     

人热休克蛋白70基因的原核表达

目的 表达人热休克蛋白70（HSP70）并进行鉴定。方法 用PCR方法扩增人HSP70基因片段，经T-A克隆法克隆到载体pUCm-T中，并进行DNA测序，将人HSP70基因片段从载体pUCm-T中酶切后，构建重组表达载体pGEX-4T-1-HSP70，并转化大肠杆菌JM109，用IPTG诱导，收集细菌，菌体裂解后进行SDS-PAGE及Western blot检测。结果 人HSP70基因的PCR产物约为1.9kb。序列测定结果证实，所获目的序列与文献[3]报道的相一致，经EcoRⅠ和XhoⅠ酶切鉴定证实。人HSP70基因已成功地克隆到表达载体pGEX-4T-1中，构建的表达载体pGEX-4T-1-HSP70，能很好地在大肠杆菌中表达相对分子质量（Mr)为96000并具有抗原特性的融合蛋白，结论 成功地克隆并表达了HSP70基因，为研究HSP70的结构。功能与临床应用提供了必要条件。     

人可溶性TRAIL基因的克隆及表达

为了利用大肠杆菌表达人可溶性肿瘤坏死因子相关性凋亡诱导配体 (TRAIL )蛋白 ,应用RT PCR技术从激活的人外周血淋巴细胞总RNA中扩增人可溶性TRAIL蛋白cDNA ,克隆入PCR2 1 载体 ,测序验证后用基因重组法分别构建了人可溶性TRAIL蛋白的真核与原核表达质粒载体。将重组质粒分别转入COS 7和大肠杆菌M1 5中表达。用流式细胞仪检测人可溶性TRAIL蛋白在COS 7细胞中的瞬时表达 ,用SDS PAGE电泳和Westernblot鉴定大肠杆菌中的表达产物。所表达融合蛋白为人可溶性TRAIL蛋白分子 ,相对分子质量为 2 1 0 0 0 ,表达量约为 2mg/ml。所表达的人可溶性TRAIL蛋白具有诱导HL 60细胞凋亡的作用。上述结果提示大肠杆菌可良好表达具有生物活性的人可溶性TRAIL蛋白 ,为深入研究TRAIL分子在肿瘤与自身免疫性疾病中的可能应用提供了材料。     

抗胶质瘤单链抗体—人肿瘤坏死因子α融合基因的构建及表达

目的 制备单链抗体-人肿瘤坏死因子α（hTNF-α)融合蛋白。方法 将hTNF-α的成熟肽cDNA以重组PCR技术融合于胶质瘤单链抗体基因的3′端,构建39ScFv-hTNF-α融合基因,克隆入大肠杆菌分泌型表达pET-20b( ),并诱导表达,结果 融合蛋白的表达量占菌体总蛋白的20%,还原SDS-PAGE和Western blot显示,其相对分子质量（Mr)为44000,具有识别胶质瘤相关抗原的活发表主TNF-α的抑瘤活性。结论 完成了39ScFv-hTNF-α融合基因的构建,并于大肠杆菌中表达了双功能融合蛋白,为胶质瘤的临床治疗提供了新的高效免疫导向药物。     

肝癌抗原肽(EPVTKAEML)与人HSP70融合基因的构建及原核表达

目的:构建及原核表达肝癌抗原肽(EPVTKAEML)与人热休克蛋白70(HSP70)的融合基因.方法:采用加端PCR方法,将EPVTKAEML的基因序列融合到人HSP70基因的3′端;将融合基因克隆入原核表达载体pET-28a( )中,构建重组质粒pET-28a( )/EPVTKAEML-HSP70.经限制性内切酶BamH I、Xho I双酶切鉴定及序列测定后,转化E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导表达融合蛋白,SDS-PAGE检测表达结果.结果:应用加端PCR方法扩增出约2.0 kb的目的片段,序列测定结果证实,EPVTKAEML的基因序列成功地融合到人HSP70基因的3′端.经BamH I、Xho I酶切鉴定证实,融合基因成功地克隆到原核表达载体pET-28a( )上;转入重组质粒的E.coli BL21(DE3)经IPTG诱导后,SDS-PAGE分析发现在相对分子质量(Mr)约72 000处有表达量明显增多的蛋白条带.结论:成功地构建并表达了肝癌抗原肽(EPVTKAEML)与人HSP70的融合基因.     

人脑源性神经生长因子基因克隆及其在大肠杆菌中的表达

用聚合酶链反应（ＰＣＲ）以人脑ＤＮＡ为模板,扩增了人脑源性神经营养因子（ＢＤＮＦ）成熟序列的ＤＮＡ 片断并将此ＤＮＡ 片段克隆到载体ＰＢＶ２２０中。对重组质粒进行ＰＣＲ鉴定、限制性酶切分析和序列测定后,确定其为含ＢＤＮＦＤＮＡ 的重组质粒。将该质粒转染到大肠杆菌（ＤＨ５ α）中,通过温度诱导其表达,其表达量占菌体总蛋白的１５％ 。用兔抗人ＢＤＮＦ进行蛋白质印迹分析（Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ）后,在表达产物位置（１４Ｋｄ）出现特异性条带,证实该产物为ＢＤＮＦ     

睾丸肿瘤抗原MAGE-E1基因片段的克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的：克隆及表达人胶质瘤特异性抗原MAGE-E1基因片段。方法：从人胶质瘤细胞系BT-325提取总RNA，用RT—PCR从中扩增出MAGE-E1基因片段。将MAGE—E1基因片段插入载体pGEM—Teasy中，经全自动序列分析仪测序正确后，再克隆至表达载体pGEX—4T—2中，构建重组表达载体pGEX—4T—2—MAGE—E1，并转化大肠杆菌进行表达。结果：用1mmoL／L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导5h，MAGE—E1蛋白的表达即达高峰。SDS—PAGE及凝胶密度扫描分析表明，表达出MT约41000大小的蛋白，占菌体总蛋白35％。结论：该基因片段的高效表达为进一步制备其抗体，以及制备肿瘤疫苗奠定了基础。     

单纯疱疹病毒I和Ⅱ型共同抗原gD在大肠埃希菌中的重组表达

目的 克隆人单纯疱疹病毒I、Ⅱ（HSV－I、Ⅱ）型共同性抗原gD基因，构建重组表达载体pMAL-c2/gD,诱导融合蛋白MBP－gD的表达。方法 提取病毒DNA，PCR扩增出gD基因，克隆于原核表达载体pMAL-c2并转化大肠埃希菌DH5α。PCR、双酶切及测序证实插入的gD基因序列正确后，IPTG诱导表达融合蛋白MBP－gD，并进行免疫学鉴定。结果 构建的重组表达质粒pMAL-c2/gD在大肠埃希菌中能高效表达。经SDS－PAGE分析，表达产物约占菌体总蛋白35．5％，其中39％以可溶蛋白形式存在于胞质中，61％以包涵体形式存在。结论 构建了pMAL-c^2/gD表达质粒，Western blot证实，HSV－I gD单克隆抗体DL6可特异识别表达的gD蛋白，该蛋白具有天然gD的抗原性。     

人源性神经营养素-6成熟肽基因融合表达载体的构建及表达产物的纯化

为了得到人源性神经营养素-6(N eurotroph in-6,NT-6)成熟肽片段,本研究以经测序鉴定的人源性NT-6 cDNA为模板,通过聚合酶链式反应(Po lym erase cha in reaction,PCR)扩增得到NT-6蛋白成熟肽编码区基因片段;将该基因克隆到融合表达载体pGEX 1-λT,构建重组原核融合表达质粒pGEX-NT-6;在异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(Isopropy l-βD-th ioga lactos ide,IPTG)诱导的条件下,观察融合蛋白在大肠杆菌JM 109中的表达情况;利用蛋白回收试剂盒对表达产物进行纯化。结果表明经PCR扩增后,得到一分子量为460 bp左右的片段;含有该片段的重组质粒经电泳及双酶切鉴定表明,所得到的重组质粒即为含有目的片段的pGEX 1-NT-6;与带有pGEX 1-λT质粒的细菌相对照,pGEX 1-NT-6质粒转化的大肠杆菌JM 109,在IPTG诱导下表达了特异性的融合蛋白,该蛋白分子量为41 KD。获得的融合蛋白经凝血酶酶切后,得到了分子量大约为15 KD的NT-6成熟肽。本研究成功构建了人源性NT-6成熟肽编码区基因融合表达载体,并纯化了其表达产物,为研究人源性NT-6的生物学功能奠定了基础。     

HER-2/neu胞外配体结合区基因的克隆及原核表达

目的 克隆HER—2／neu配体结合区基因，并在大肠杆菌中获得高效表达。方法 用PCR技术扩增HER—2／neu脑外配体结合区的cDNA片段，并将该片段插入pET-28a(t)原核表达载体中，实现插入基因的融合表达；用SDS—PAGE和蛋白免疫印迹法分别测定表达产物的相对分子质量及特异性。结果 构建的重组质粒在大肠杆菌中获得高效稳定的表达，表达产物的相对分子质量与预期值一致，且所表达蛋白可被抗HER—2/neu的特异性抗体识别。结论 获得了HER—2／neu脑外配体结合区基因在原核系统中的表达，为HER—2／neu高表达肿瘤的疫苗研究奠定了基础。