当归水煎液对人脐静脉内皮细胞增殖、凋亡及胶原合成的影响

目的:探讨当归水煎液对人脐静脉内皮细胞增殖、凋亡和胶原合成的影响。方法:体外培养人脐静脉内皮细胞,用噻唑蓝比色法检测细胞增殖活性,用流式细胞术分析细胞周期及凋亡,用放射免疫法测定胶原合成。结果:当归水煎液能促进人脐静脉内皮细胞的增殖,且随浓度增大促增殖作用愈大。当归水煎液使S期和G2/M期细胞增多,G0/G1期细胞减少(P<0.05),凋亡率逐渐减小(P<0.05)。当归水煎液呈剂量和时间依赖性抑制人脐静脉内皮细胞合成胶原(P<0.05)。结论:当归水煎液呈剂量依赖性促进人脐静脉内皮细胞的增殖,抑制其凋亡,减少胶原合成。     

当归挥发油对增生性瘢痕成纤维细胞增殖、凋亡及胶原合成的影响

目的:探讨当归挥发油对增生性瘢痕成纤维细胞增殖、凋亡和胶原合成的影响。方法:体外培养人增生性瘢痕成纤维细胞,用噻唑蓝比色法检测细胞增殖活性,用流式细胞术分析细胞周期及凋亡,用放射免疫法测定胶原合成。结果:1mg/L、4mg/L和16mg/L当归挥发油组与对照组相比G0/G1期细胞、G2/M期减少,显著增加了S期细胞(P<0.05)。凋亡率随当归挥发油浓度增大逐渐增大(P<0.05)。当归挥发油呈剂量和时间依赖性抑制细胞合成胶原(P<0.05或0.01)。结论:当归挥发油抑制成纤维细胞的增殖和胶原合成。     

当归挥发油对增生性瘢痕成纤维细胞增殖、凋亡及胶原合成的影响

目的:探讨当归挥发油对增生性瘢痕成纤维细胞增殖、凋亡和胶原合成的影响。方法:体外培养人增生性瘢痕成纤维细胞,用噻唑蓝比色法检测细胞增殖活性,用流式细胞术分析细胞周期及凋亡,用放射免疫法测定胶原合成。结果:1mg/L、4mg/L和16mg/L当归挥发油组与对照组相比G0/G1期细胞、G2/M期减少,显著增加了S期细胞(P<0.05)。凋亡率随当归挥发油浓度增大逐渐增大(P<0.05)。当归挥发油呈剂量和时间依赖性抑制细胞合成胶原(P<0.05或0.01)。结论:当归挥发油抑制成纤维细胞的增殖和胶原合成。     

晚期糖基化终末产物对人血管内皮细胞增殖及凋亡的影响

目的研究晚期糖基化终末产物(AGEs)对人血管内皮细胞增殖及凋亡的影响,探讨糖尿病难愈创面新生血管化障碍或延迟的机理.方法不同作用时间及浓度AGE修饰的人血清白蛋白(AGE-HSA)与人血管内皮细胞(ECV304)在体外共同培养,用四唑盐(MTT)比色试验和细胞计数检测AGE-HSA对血管内皮细胞的增殖抑制作用,并用台盼蓝排斥试验检测细胞活力.采用FITC Annexin-V及碘化丙碇(PI)染色,用流式细胞仪检测凋亡细胞百分率,同时应用荧光共聚焦显微镜观察凋亡或死亡细胞FITC Annexin-V和PI的荧光染色,并用透射电镜和光镜观察凋亡细胞特异性的形态学改变.结果内皮细胞在12.5、25和50μg/ml AGE-HSA培养条件下,第2天细胞增殖数量与对照组比较无明显差异性,第4天和第6天则显著低于对照组(P＜0.01);而内皮细胞经100或200μg/ml AGE-HSA干预6h,MTT法测其OD值与对照组比较有明显差异(P＜0.01),同时内皮细胞出现特异性的凋亡形态学变化以及FITC Annexin-V阳性和/或PI阳性的细胞逐渐增多,且凋亡或死亡细胞数量随AGE-HSA作用时间及浓度的增加而增多.结论AGE-HSA能抑制内皮细胞增殖,并可以诱导其凋亡,而且与作用时间及浓度相关.提示AGEs可能是引起糖尿病难愈创面中新生血管化障碍或者延迟的机制之一.     

釉基质蛋白对人皮肤成纤维细胞黏附、增殖及Ⅰ型胶原前mRNA合成影响的体外研究

目的 观察釉基质蛋白(enamel matrix proteins,EMPs)对体外培养的人正常皮肤成纤维细胞黏附、增殖及Ⅰ型胶原前mRNA合成的影响.方法 取自愿捐赠包皮环切术后包皮组织,采用组织块法培养人皮肤成纤维细胞,取第3～6代细胞进行实验.以终浓度为50、100、150、200 μg/mL的EMPs工作液预铺培养板.①细胞黏附实验:取细胞以1 × 106个/mL置于预铺EMPs的96孔培养板,每孔0.2 mL,作为实验组(A、B、C、D组).培养1.5、3.0和4.5 h后MTT比色法测定黏附细胞量.②细胞增殖实验:取细胞以5 × 104个/mL置于预铺EMPs的培养板,每孔0.2 mL,作为实验组(A1、B1、C1、D1组).于第2、4、6、8天以MTT比色法测定增殖细胞量.③细胞Ⅰ型胶原前mRNA合成实验:取细胞以1×106个/mL置于预铺EMPs培养板,每孔2 mL,作为实验组(A2、B2、C2、D2组).于培养第5天RT-PCR法测定Ⅰ型胶原前mRNA合成的量.以上实验均以相同浓度细胞悬液加入未预铺EMPs的板孔作为对照组,每组均3个复孔.结果 ①细胞黏附实验中,各时间点B、C、D组与A组及对照组比较,差异均有统计学意义(P＜0.05);A组与对照组间及B、C、D组间比较差异均无统计学意义(P＞005).②细胞增殖实验中,第2天各组间差异均无统计学意义(P＞0.05):第4、6天,B1、C1、D1组吸光度(A)值分别为0.598±0.020、0.582±0017、0.574±0.021及0.639±0.016、0.641±0.020、0.635±0.021,均高于对照组的0.548±0.021及0.605±0.019(P＜0.05);A1组A值分别为0.545±0.023及0.603±0.016,与对照组差异无统计学意义(P＞0.05).第8天,B1、C1组A值分别为0.629±0.012、0.631±0.014,高于对照组的0.606±0.031(P＜0.05),A1、D1组与对照组比较,差异无统计学意义(P＞005).③细胞Ⅰ型胶原前mRNA合成实验中,B2、C2、D2组Ⅰ型胶原前mRNA合成量高于对照组.结论 EMPs促进人正常皮肤成纤维细胞黏附、增殖及Ⅰ型胶原前mRNA合成,且EMPs在100μg/mL浓度时可发挥最大促进作用.     

缺氧对人脐静脉内皮细胞株增殖与活力的影响

目的了解缺氧对人脐静脉内皮细胞增殖与活力的影响。方法将体外培养的人脐静脉内皮细胞株 EA.hy926分为常氧组和缺氧组。常氧组常规培养,缺氧组细胞充入混合气体(含体积分数94%N_2、5%CO_2、1%O_2)后置于37℃缺氧培养1、3、6、12 h。提取两组细胞总蛋白,用蛋白质印迹法检测血管内皮生长因子(VEGF)和增殖细胞核抗原(PCNA)的表达水平;以噻唑蓝法检测细胞活力,并用流式细胞仪检测细胞周期。结果与常氧组比较,缺氧组细胞培养1 h VEGF 表达增高,6 h 达高峰,12 h 降低但仍明显高于常氧组;培养3 h 时细胞 PCNA 蛋白表达开始升高,6 h 达峰值并持续至12 h。培养1、3 h,缺氧组细胞活力较常氧组明显增高(P<0.05),6 h 开始下降,至12 h 时低于常氧组但差异无统计学意义(P>0.05)。缺氧组细胞培养1、3、6 h,G_0/G_1期细胞均较常氧组少,S 期和 G_2/M 期细胞增多,增殖指数(PI)各为(43±9)%、(39±11)%、(40±11)%,均高于常氧组(32±9)%,其中3、6 h 时差异有统计学意义(P<0.05);12 h 时 PI 为(27±4)%,降至常氧组水平以下(P<0.05)。结论缺氧早期可促进人脐静脉内皮细胞增殖,但随着缺氧时间的延长细胞增殖将受抑制。     

黄芪多糖对人脐静脉内皮细胞的增殖及表达 VEGF 的影响

目的：研究黄芪多糖（astragaluspolysacharin,APS）对人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells,HUVEC）周期及血管内皮细胞生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）表达的影响。方法：用不同浓度黄芪多糖对 HUVEC 进行干预培养,流式细胞仪检测细胞周期以及细胞凋亡;荧光倒置显微镜检测细胞表达 VEGF 的免疫荧光。结果：MTT 法表明,APS 在一定的范围内（0.1~100 μg/mL）能以剂量依赖方式促进 HUVEC 细胞周期从 G0/G1 期向 G2/M 期和 S 期转变,流式细胞凋亡检测显示 APS 并未增加 HUVEC 凋亡率。细胞免疫荧光染色实验结果表明,APS 促进 VEGF 表达。结论：APS 在一定的浓度范围内（0.1~100 μg/mL）促进 HUVEC 细胞分裂增殖。APS 还能上调 HUVEC 细胞 VEGF 的表达水平,为进一步血管化提供有效的促血管化因子,为治疗缺血性疾病提供新思路。     

血管紧张素Ⅱ对人主动脉瓣间质细胞增殖及胶原合成的影响

我们采用3Ｈ 胸腺嘧啶核苷 (3Ｈ ＴｄＲ)和3Ｈ 脯氨酸 (3Ｈ ｐｒｏｌｉｎｅ)掺入方法观察血管紧张素Ⅱ (ＡｎｇⅡ )对人主动脉瓣间质细胞 (ＩＣｓ)增殖及胶原蛋白合成的影响 ,探讨ＡｎｇⅡ在心脏瓣膜形态改建过程中的作用。一、材料和方法1 .组织来源 :人主动脉瓣组织取自脑死亡、无心血管病变及结缔组织疾病的健康成年男性患者。将主动脉瓣沿瓣叶交界切开 ,瓣叶游离部位心室面和主动脉面用刀片轻轻刮除 ,以消除瓣叶内皮细胞。所切除瓣叶用不含血清的最低基础培养液 (ＤＭＥＭ ,Ｇｉｂｃｏ公司 )洗涤后 ,剪成 0 .5～ 1 .0ｍｍ3的碎组织块。2…     

NF-κB信号通路对高糖诱导的人脐静脉内皮细胞凋亡的作用

目的 研究高糖尤其是波动性高糖对人脐静脉内皮细胞（HUVEC）凋亡的影响,以及NF-κB信号通路在高糖诱导HUVEC凋亡中的作用。 方法 构建针对NF-κBp65 mRNA序列1566位点的重组RNAi腺病毒表达载体,并利用RNAi腺病毒抑制HUVEC p65表达。应用流式细胞术及脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（TUNEL）研究NF-κB信号通路在高糖诱导HUVEC凋亡的作用。 结果 高糖（20.5 mmol/L或30.5 mmol/L）可以促进HUVEC凋亡。NF-κBp65 特异腺病毒感染HUVEC后,可以明显抑制高糖刺激的NF-κBp65核蛋白转录,使核内p65蛋白表达处于基础水平。TUNEL结果示高糖作用后5 d,高糖组细胞凋亡率显著高于正常葡萄糖组（25.81％±1.77％比8.20％±0.63％,P < 0.05）,Ad-DEST＋高糖组（26.10％±0.98％）与单独高糖组的细胞凋亡率差异无统计学意义（P > 0.05）。Ad-1566＋高糖组的细胞凋亡率（11.49％±0.92％）比Ad-DEST＋高糖组显著下降（P < 0.01）。TUNEL法及流式细胞术检测结果均显示NF-κBp65 特异腺病毒可以降低高糖诱导的HUVEC凋亡。结论 高糖可以促进HUVEC凋亡。腺病毒感染HUVEC可以明显抑制高糖刺激的NF-κBp65核转录,从而保护高糖作用的HUVEC凋亡。     

血竭素对瘢痕成纤维细胞胶原合成的影响

目的:研究天然药物血竭素高氯酸盐(dracorhodinperchlorate,Dp)对瘢痕成纤维细胞合成胶原的影响,为开发新的治疗增生性瘢痕的有效药物提供实验依据。方法:以四甲基偶氮唑(MTT)法、吸光度检测法及逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法分别测定血竭素对成纤维细胞增殖、培养基中的胶原含量以及Ⅰ、Ⅲ型前胶原mRNA表达的影响。结果:MTT法显示血竭素对成纤维细胞的抑制率增高,且呈现浓度和时间依赖性(P<0.05),还能显著降低培养基中可溶性胶原的含量(P<0.05)。RT-PCR法对Ⅰ、Ⅲ型前胶原的mRNA检测显示随着药物浓度增高其表达量降低(P<0.05)。结论:血竭素对瘢痕成纤维细胞的增殖和胶原合成具有显著的抑制作用。     

右美托咪定对脂多糖诱导脐静脉内皮细胞凋亡的影响

目的 评价右美托咪定对脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的血管内皮细胞凋亡的影响.方法 参照随机数字表法将人脐静脉内皮细胞HUVEC-12随机分为4组(每组20孔):正常对照组(C组)、右美托咪定组(D组)、LPS组(L 组)、LPS+右美托咪定组(L+D组),培养24 h后:四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法(MTT法)和流式细胞术分别检测细胞活力和细胞凋亡率,黄嘌呤氧化酶法和硫代巴比妥酸法(thiobarbituric acid,TBA)测定各组细胞超氧化物歧化酶(superoxidedismutase,SOD)的活性和丙二醛(malonaldehyde,MDA)的含量,Western blot法检测细胞多聚腺苷酸二磷酸-1(Poly-ADP Ribosy polymerase-1,PARP-1)蛋白裂解片段的表达.结果 L组和L+D组细胞活力分别是0.95±0.08和1.08±0.10(P＜0.05),与C组比较,分别降低36％和27％;L组和L+D组细胞凋亡率分别是(14.7±1.8)％和(8.8±1.1)％(P＜0.05),分别是C组的2.6倍和1.1倍;L组和L+D组细胞SOD活性分别是(99±6) U/mg和(182±9) U/mg(P＜0.05),与C组比较,分别降低53％和14％;L组和L+D组细胞MDA含量分别是(29.9±1.8) nmol/mg和(19.3±2.1) nmol/mg(P＜0.05),分别是C组的1.6倍和79％;L组和L+D组细胞内PARP-1片段(相对分子质量89×103)表达分别是1.152±0.095和0.564±0.045 (P＜0.05),分别是C组的4.8倍和1.8倍;D组上述指标的差异无统计学意义(P＞0.05).结论 右美托咪定可有效减少LPS诱导下脐静脉内皮细胞的凋亡,其机制可能与抑制氧化应激、下调PARP-1裂解片段的表达有关.     

Effects of propranolol on the proliferation and apoptosis of hemangioma-derived endothelial cells

Background/Purpose

Propranolol, a non-selective beta-blocker, has recently been introduced as a novel treatment modality for proliferating hemangiomas. However, the mechanism of action of this therapy is unknown. In this study, we investigated propranolol in the etiology of hemangiomas that are associated with the proliferation and apoptosis of hemangioma-derived endothelial cells (HemECs).

Methods

HemECs were isolated from freshly resected hemangioma specimens. We studied propranolol-treated HemECs in vitro. We measured the effect of propranolol on HemEC viability using the Cell Counting Kit-8 (CCK-8) assay and proliferation and apoptosis using a BrdU labeling assay, annexin-V-fluorescein isothiocyanate/propidium iodide flow cytometry, and Hoechst 33342 fluorescent staining. We explored the potential mechanisms of propranolol-induced HemEC dysfunction using western blot analysis, a caspase assay kit, and real-time quantitative PCR.

Results

We observed that propranolol had inhibitory effects on the viability and proliferation of HemECs. HemEC apoptosis significantly increased with 100 μM propranolol treatment. Vascular endothelial growth factor (VEGF) expression was down-regulated by propranolol in a dose-dependent manner. We also demonstrated activation of the caspase cascade, including caspase-9 and caspase-3 of the intrinsic pathway, and an increased p53 gene expression and Bax/Bcl-xL ratio in HemECs treated with 100 μM propranolol.

Conclusions

We obtained novel data that suggests propranolol could inhibit HemEC proliferation and induce apoptosis. The effects were likely mediated through the suppression of VEGF expression, activation of caspase-9 and caspase-3, up-regulation of the pro-apoptotic genes p53 and Bax and down-regulation of the anti-apoptotic gene Bcl-xL.     

羧甲基壳多糖对瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖和胶原合成的影响

目的 观察羧甲基壳多糖（carboxymethyl-chitosan，CM-CH）对体外培养的瘢痕疙瘩成纤维细胞（keloid fibroblasts，KFB）增殖和胶原合成的作用，探讨其治疗瘢痕疙瘩的机制。方法 采用四噻唑蓝（methylthiazoletrazolium，MTT）测定法和羟脯氨酸比色法（hydroxyproline，HP）测定不同浓度CM-CH作用KFB后对其增殖和上清液中胶原合成的影响。结果 CM-CH在10、50、100、200μg／ml作用KFB48、72h后，对KFB增殖有明显抑制作用（P〈0．05）。200μg／ml作用24、48、72h后，对KFB增殖抑制作用与曲安萘德组比较差异无统计学意义（P〉0．05）。CM-CH在10、50、100、200μg／ml对KFB作用48h后，能显著抑制该细胞胶原的合成（P〈0．01）。100、200μg／ml CM-CH抑制作用与曲安萘德组比较差异无统计学意义（P〉0．05）。结论 CM-CH对体外培养的KFB增殖和胶原合成有明显抑制作用，从而提示该物质治疗瘢痕疙瘩具有潜在前景。     

降钙素基因相关肽对血管内皮细胞体外血管生成的作用及机制研究

 目的 观察降钙素基因相关肽(calcitonin-gene-related peptide,CGRP)对人脐静脉血管内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)的成血管作用,初步探讨其在骨组织工程中的应用价值。方法 体外分离获取HUVECs,采用细胞免疫荧光检测其CGRP受体1的表达。体外成管实验检测CGRP的成血管作用,ELISA法检测CGRP直接作用于HUVECs时血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)的分泌水平。Q-PCR检测CGRP刺激HUVECs不同时间点VEGF、VEGF受体1(FLT1)、VEGF 受体2(KDR)及CGRP受体1 mRNA的表达,Western blot检测HUVECs不同时间点FLT1、KDR的蛋白表达。结果 细胞免疫荧光显示HUVECs表达CGRP受体1,体外成管实验显示CGRP有明显的成血管作用。ELISA显示CGRP能明显促进HUVEC分泌VEGF。Q-PCR结果显示不同浓度组CGRP受体1 mRNA的表达较对照组增高,且在第10天最为明显;Q-PCR及Western blot结果显示不同浓度组FLT1、KDR mRNA和蛋白的表达在各时间点较对照组均增高。结论 CGRP能明显促进HUVECs的体外生成血管,可能与其促进VEGF分泌,增强HUVECs的FLT1与KDR表达有关;同时,CGRP受体表达也增加,可进一步增强CGRP的促血管生成作用。     

3TSR体内外诱导内皮细胞凋亡的研究

目的观察血管形成抑制剂3TSR体内外对内皮细胞的影响，并探讨与细胞凋亡蛋白酶．3（Caspase-3）的关系。方法在体外培养条件下比较对照组、不同剂量3TSR（1—3μmol／L）作用48h对人脐静脉血管内皮细胞增殖及凋亡的影响，并用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）法检测各组Caspase-3 mRNA转录水平。建立裸鼠原位胰腺癌模型，进行随机干预实验，比较对照组（每日0．2ml生理盐水腹腔注射）、3TSR1组（每日1mg／kg体重腹腔注射）、3TSR2组（每日2mg／kg体重腹腔注射）及3TSR3组（每日3mg／kg体重腹腔注射），每组6只，3周后检测胰腺癌原位肿瘤血管内皮细胞凋亡率。结果体外培养时3TSR对人脐静脉内皮细胞有显著增殖抑制及凋亡诱导作用，作用48h后其凋亡率分别为（10．3±3．2）％，（12．4±4．1）％和（20．1±5．4）％，均显著高于对照组（P〈0．05）。3TSR1组、3TSR2组和3TSR3组Caspase-3 mRNA转录水平相对强度分别（0．76±0．11），（0．79±0．21）和（0．89±0．19），均显著高于对照组（P〈0．05），且随浓度增加而增强。体内实验时3TSR能显著诱导胰腺癌血管内皮细胞凋亡，3TSR1组、3TSR2组及3TSR3组凋亡率分别为（7．8±3．0）％，（14．6±4．9）％和（15．9±3．2）％，均显著高于对照组（P〈0．05）。结论3TSR体内外均能诱导内皮细胞的凋亡，且呈一定的浓度依赖性，其作用机制可能与促进Caspase-3基因转录有关。     

洛伐他汀对人血管内皮细胞双向调节作用的实验研究

目的 探讨洛伐他汀对人血管内皮细胞的调节作用及其浓度相关性.方法 配制含不同浓度洛伐他汀的培养基(0.001、0.01、0.1、1、10μmol/L),分别于96孔板中进行人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)培养,在培养24、72、120 h后以噻唑蓝比色法(MTT)法进行细胞活性及增殖情况评估.将HUVECs接种于6孔板中,分别加入含上述不同浓度洛伐他汀的培养基,培养24 h后,消化细胞,计数,按照2×104/ml每孔接种在24孔板中,30 min后,洗掉尚未黏附的细胞,将余下的细胞每孔随机选一个视野,在200×视野中计量黏附细胞数,比较各组细胞的黏附情况. 结果培养24 h,0.01、0.1μmol/L的洛伐他汀对HUVECs存在明显的促进增殖作用;培养72 h,1μmol/L的洛伐他汀对HUVECs存在明显的促进增殖作用;培养120 h,0.001、0.01、0.1、1 μmol/L的洛伐他汀与对照组相比HUVECs增殖活性差异无统计学意义,10μmol/L的洛伐他汀表现出明显的增殖抑制作用.洛伐他汀与HUVECs作用24 h后,0.1、1μmol/L的洛伐他汀表现出明显的促进HUVECs黏附作用.结论 洛伐他汀对人血管内皮细胞存在双向调节作用,与浓度相关.体外浓度0.1、1μmol/L时可以表现出明显的促进增殖及黏附作用,浓度达10 μmol/L时则表现出抑制作用.