bcl-xs增加鼻咽癌细胞对喜树碱诱导凋亡敏感性的实验研究

目的研究bcl-x     

bcl—Xs增加鼻咽癌细胞对喜树碱诱导凋亡敏感性的实验研究

目的：研究bcl-Xs基因对喜树碱（CPT）诱导鼻咽癌CNE－2Z细胞凋亡的影响,。方法：利用脂质体LipofectAmine将含有人bcl-Xs基因的重组真核表达质粒pcDNA3x,导入入鼻咽癌低分化上皮细胞株CNE－2Z,G418筛选培养后,经Western blot检测bcl-Xs的表达,以不含有bcl0Xs基因的pcDNA3质粒转染CNE－2Z作为对照,喜树碱处理两种细胞一定时间后,通过激光流式细胞仪检测凋亡细胞百分比,结果：Western blot检测证实获得稳定表达bcl-Xs的细胞,经过0．5umol/L,1.0umol/L CPT处理24小时后,激光流式细胞仪检测的凋亡峰值均高于对照细胞,结论：bcl-Xs能显著增加鼻咽癌CNE－2Z细胞对喜树碱诱导凋亡的敏感性。     

鼻咽癌细胞凋亡与患者预后的关系

近来研究表明 ,细胞凋亡与肿瘤的发生、发展、治疗及预后关系密切。为探讨鼻咽癌 ( NPC)细胞凋亡与患者预后的关系 ,我们采用原位末端标记技术( TUNEL )对经甲醛固定、石蜡包埋的 NPC组织标本进行研究 ,报告如下1　材料与方法1 .1 　 临床资料73例 NPC患者的石蜡标本 ,男 54例 ,女 1 9例 ,年龄 1 7～ 73岁 ,平均 4 2岁。本组病例经随访 3～ 3 .5年 ,其中 1 9例因复发或转移死亡 ,5例失访。另取 2 0例鼻咽粘膜慢性炎症患者的组织作为对照。1 .2 　 染色采用 TUNEL法检测 NPC及鼻咽粘膜慢性炎症组织中细胞凋亡情况 ,试剂为德国宝灵曼…     

介入化疗对鼻咽癌细胞凋亡和增殖的影响

目的：观察介入化疗对鼻咽癌细胞凋亡（ＡＰＯ）和细胞增殖的影响,并评价其疗效。方法：对１０例鼻咽癌患者经颞浅动脉逆行颈外动脉插管,选择肿瘤供血血管灌注化疗药物５－氟嘧啶、顺铂、平阳霉素及烟酰胺。分别;于化疗前、化疗后７ｄ取肿瘤组织,检测调亡细胞和增殖细胞抗原（ＰＣＮＡ）结果：介入化疗后临床缓解率为６３％。化疗后７ｄ细胞凋亡指数（ＡＩ）１．２４％,高于治疗前的０．５２％。细胞增殖指数化疗前为４２．４％     

bcl-xs增加鼻咽癌细胞对喜树碱诱导凋亡敏感性的实验研究

目的 :研究 bcl- xs 基因对喜树碱 (CPT)诱导鼻咽癌 CNE- 2 Z细胞凋亡的影响。方法 :利用脂质体L ipofect Amine将含有人 bcl- xs基因的重组真核表达质粒 pc DNA3xs导入人鼻咽癌低分化上皮细胞株 CNE- 2 Z,G418筛选培养后 ,经 Western blot检测 bcl- xs的表达。以不含有 bcl- xs基因的 pc DNA3质粒转染 CNE- 2 Z作为对照细胞。喜树碱处理两种细胞一定时间后 ,通过激光流式细胞仪检测凋亡细胞百分比。结果 :Western blot检测证实获得稳定表达 bcl-xs的细胞 ,经过 0 .5μmol/L ,1.0μmol/L CPT处理 2 4小时后 ,激光流式细胞仪检测的凋亡峰值均高于对照细胞。结论 :bcl- xs能显著增加鼻咽癌 CNE- 2 Z细胞对喜树碱诱导凋亡的敏感性     

hTR反义寡核苷酸诱导鼻咽癌细胞凋亡的研究

目的：探讨人端粒酶反义寡核苷酸对鼻咽癌细胞凋亡的作用。方法：脂质体介导反义寡核苷酸转染鼻咽癌ＨＮＥ１细胞株,采用吖啶橙荧光染色计数,透射电镜观察ＨＮＥ１细胞凋亡改变。结果：反义寡核苷酸转染ＨＮＥ１细胞４８小时后,ＨＮＥ１细胞形态出现改变,细胞娄减少。吖啶橙荧光染色计数及透射电镜分别发现,反义寡核苷酸组较对照组有更多的调亡细胞及更高的调亡指数。结论：针对端粒酶ＲＮＡ的反义寡核苷酸能有效地通过抑制端粒     

Skp2 siRNA表达载体构建及其对喉鳞状细胞癌细胞Skp2基因表达的抑制作用

目的:应用RNA干扰技术,构建针对Skp2的siRNA表达载体,抑制喉鳞状细胞癌细胞Skp2基因的表达。方法:根据设计siRNA的原则,针对人Skp2的mRNA序列,设计并合成编码siRNA的2条寡核苷酸序列,经退火成互补双链,再克隆到真核表达载体pGPU6/Neo中构建重组体pGPU6Skp2,转化DH5α菌株,提取质粒进行酶切鉴定后,进行序列测定。然后转染重组质粒至Hep2细胞中,应用流式细胞术检测Skp2基因的表达。结果:将合成的DNA序列退火后克隆到载体上,经酶切和测序鉴定确实为所需序列。pGPU6Skp2转染细胞后,Skp2基因在蛋白水平的表达量受到明显抑制。结论:成功构建了针对人Skp2的siRNA表达载体,通过转染Hep2细胞,可有效抑制细胞Skp2的表达,为后续基因治疗研究奠定了实验基础。     

RNA同时干扰四个不同基因对鼻咽癌细胞CNE-2Z生长增殖的实验研究

目的 应用RNA干扰技术构建一个载体同时编码四个基因,即血管内皮生长因子(VEGF)、致癌基因蛋白(c-myc)、存活素(survivin)和端粒酶反转录酶的短发夹重组质粒,并与单基因质粒做对比,通过体内外实验,研究其对鼻咽癌细胞CNE-2Z生长增殖的影响.方法 构建同时表达VEGF、c-myc、survivin和端粒酶反转录酶并含荧光素标记的短发夹RNA质粒命名为P-1,并构建单独表达VEGF、c-myc、survivin和端粒酶反转录酶的质粒,分别命名为P-2、P-3、P-4和P-5,分别将其将转染人鼻咽癌CNE-2Z细胞株及荷瘤裸鼠瘤体内.以激光共聚焦显微镜观察质粒在CNE-2Z细胞及瘤体内的转染及表达情况.四甲基偶氮噻唑蓝法检测细胞增殖活性,实时PCR在mRNA水平上检测对目的基因表达的抑制作用,免疫印迹法在蛋白水平上检测对目的基因的封闭效果,Trans well侵袭小室模型观察导入CNE-2Z细胞对其恶性生物学行为的改变,流式细胞仪观察各组凋亡率,体内裸鼠成瘤实验观察质粒对肿瘤的抑制效果.结果 多基因干扰质粒转染鼻咽癌细胞后,CNE-2Z细胞增殖受到明显抑制,体外侵袭能力显著下降(P值均＜0.05).实时PCR证实多基因组4个不同基因mRNA表达均降低,免疫印迹技术验证目的基因蛋白同时表达下调.流式细胞仪结果证明多基因凋亡率明显高于单基因组(P值均＜0.05).体内抑瘤实验表明,与阴性组和空白组相比,P-1组移植瘤生长明显受到抑制(P＜0.05),并且多基因质粒抑制肿瘤细胞增长的作用要强于单基因干扰质粒(户值均＜0.05).结论 同时干扰多个基因能有效抑制鼻咽癌细胞增殖并诱导其凋亡,为鼻咽癌基因治疗奠定了良好的实验基础.     

转导bax基因治疗实验性鼻咽癌的研究

目的探讨转导bax基因对鼻咽癌细胞株HNE-1和种植瘤的影响.方法采用Dosper脂质体介导bax基因转导鼻咽癌细胞株后,免疫荧光检测转导效果,并分别用四甲基偶氮唑盐(thiazilyl blue,MTT)比色法和流式细胞仪检测转导组和对照组细胞株的凋亡情况,并用局部注射的方法观察bax基因对鼻咽癌裸鼠种植瘤的作用.结果鼻咽癌细胞株HNE-1转导bax基因后48 h内,免疫荧光法证实肿瘤细胞内有瞬时表达;转导前、后HNE1细胞株凋亡指数分别为10.7%、69.4%,MTT检测显示转导后36和48 h细胞吸光度为2.004和1.902.注射bax基因后实验组4只裸鼠和注射生理盐水的对照组3只裸鼠种植瘤的直径(     

鼻咽癌细胞株C666-1细胞中酪氨酸激酶受体B的表达与抗失巢凋亡的关系

目的 探讨酪氨酸激酶受体B(tyrosine kinase receptor B,TrkB)对鼻咽癌细胞系C666-1失巢凋亡特性的影响和调控.方法 用反转录聚合酶链反应(PT-PCR)以及蛋白质印迹法检测培养的C666-1细胞中TrkB以及其配体脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)的表达.采用TrkB的抑制剂K252a以及其配体BDNF分别作用于C666-1细胞,采用软琼脂集落形成实验观察细胞的集落形成能力以及悬浮培养后用活细胞计数kit-8(cell counting kit-8,CCK-8)法和膜联蛋白V碘化丙啶(annexin V-propidium iodinate,Annexin V-PI)双染色法检测对细胞的增殖和凋亡的影响.通过蛋白质印迹法观察TrkB、BDNF、磷酸化的丝氨酸苏氨酸激酶(serine threonine kinase,Akt)等蛋白在实验前后的表达变化的情况.结果 培养的C666-1细胞表达TrkB及BDNF.C666-1细胞受K252a作用后在软琼脂中集落细胞数减少,而在BDNF作用下集落细胞数增加.在悬浮培养状态,K252a对C666-1细胞的增殖具有抑制作用,经K252a作用后C666-1细胞的TrkB表达下调,并同时下调磷酸化的Akt蛋白(p-Akt);而BDNF作用后,内源性BDNF表达增强,且TrkB和p-Akt的表达上调.结论 TrkB具有抑制鼻咽癌细胞C666-1失巢凋亡的作用,K252a能够抑制TrkB的表达从而诱导凋亡,是具有潜力的酪氨酸激酶抑制剂.     

塞来昔布抑制人鼻咽癌细胞株HNE-1细胞增殖与血管内皮生长因子的表达

目的 研究环氧化酶2抑制剂塞来昔布对鼻咽癌细胞株HNE-1细胞增殖作用及对血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）表达的影响。方法 采用噻唑蓝法[3-（4，5-dimethylthiazol-2-yl）-2，5-diphenyl tetrazolium bromide，MTT]观察塞来昔布对人鼻咽癌细胞增殖的影响，流式细胞仪分析细胞周期分布，免疫细胞化学检测VEGF蛋白表达。结果 塞来昔布50μmol／L作用48h后使HNE-1细胞G0／G1期细胞显著增多（由62．13％上升至91．35％），而G2／M期和S期细胞显著减少（分别由21．59％降至3．56％和16．28％降至5．01％），细胞生长停滞于G1／S期，细胞VEGF蛋白表达明显减弱。结论 塞来昔布对体外培养的鼻咽癌细胞具有明显抑制作用，使细胞生长停滞于G1／S期，且能抑制VEGF蛋白表达。     

抑癌基因PTEN在鼻咽癌组织中的表达及意义

目的 :检测抑癌基因PTEN在鼻咽癌组织的表达缺失情况 ,探讨PTEN与鼻咽癌发生发展之间的关系。方法 :采用免疫组织化学SABC染色法观察鼻咽癌旁正常组织和鼻咽癌组织中PTEN蛋白的表达 ,并分析其与病理组织类型、病理分级和临床分期的关系。结果 :PTEN在鼻咽癌旁正常组织的表达缺失率 (13.3% )低于鼻咽癌组织的表达缺失率 (47.8% ) ,其差异有统计学意义 (P <0 .0 5 ) ;鼻咽鳞状细胞癌PTEN的表达缺失率(5 8.1% )高于分化型和非分化型非角化癌 (30 .8% ) ;高、中、低分化的鼻咽鳞状细胞癌中 ,PTEN的表达缺失率依次递增 (分别为 2 5 .0 %、6 3.2 %、83.3% ) ;鼻咽癌临床Ⅲ～Ⅳ期的PTEN的表达缺失率 (78.1% )高于临床Ⅰ～Ⅱ期 (2 1.6 % )。结论 :PTEN在鼻咽癌的发生及发展过程中有表达缺失 ,且与病理类型、病理分级、临床分期有关。     

RNA干涉鼻咽癌细胞Raf-1基因表达的实验研究

目的 研究应用载体介导的RNA干涉技术特异性干扰Raf-1基因在鼻咽癌细胞株HNE1中的表达以及对其生物学行为的影响。方法 构建利用U6启动子转录功能的shRNA的载体，在U6启动子下游分别插入含针对Raf-1基因不同位点的特异性RNA干扰序列-67bp寡核苷酸片段，并编号命名为：pshuttle-Raf-1-a（225），pshattle-Raf-1-b（358）和pshuttle—Raf-1-c（474）。将构建的质粒通过脂质体转染人鼻咽癌细胞株HNE1，用RT—PCR分析Raf-1基因的mRNA的表达，流式细胞仪检测转染后HNE1细胞的凋亡率。结果 3种含有针对Raf-1基因不同特异性序列的质粒转染后均能干扰该基因在HNE1细胞中的表达，其中以pSIREN shuttle-Raf-1-b（358）作用最为明显。RT-PCR检测Raf-1基因mRNA表达量下降，流式细胞仪检测细胞凋亡率增加，达到65％。结论 应用载体介导的RNAi技术可特异性干扰Raf-1基因在鼻咽癌细胞HNE1中的表达，使该细胞凋亡率增加，Raf-1基因相对应的mRNA表达下降。