HBV DNA疫苗诱导健康及HBV转基因小鼠细胞免疫应答

采用HBVCTL表位多肽体外刺激或冲击免疫效 (E)、靶(T)细胞 ,以观察DNA疫苗诱导健康及HBV转基因 (Tg)小鼠细胞免疫效果。结果发现 ,DNA疫苗能有效诱导健康BALB/c小鼠CTL活性 ,活性强弱与E/T比值及其上清液中IFN γ分泌水平有一定关系。HBsAg表位多肽(pp2 0 )体外刺激DNA疫苗免疫组效应细胞 ,培养上清IL 1 2释放水平 (2 1 1 3± 39 8pg/ml)明显较对照组 (86 7±2 7 1 pg/ml)高(P <0 0 5 ,t=4 4 82 )。DNA疫苗免疫HBVTg小鼠诱导CTL活性 (1 2 7%± 6 7% )较蛋白疫苗免疫对照组(1 7%±3 2 % )高(P <0 0 1 ,t=3 6 2 9) ;其效应细胞体外受 pp2 0刺激后分泌IL 1 2水平 (4 0 0± 30 1pg/ml)明显高于同期空载体免疫对照组 (3 8±3 0 pg/ml,P <0 0 5 ,t=2 376 )。采用在体电脉冲法DNA疫苗接种的 5只HBVTg小鼠中 ,于 4周时有 2只血清HBsAg阴转 ,并于 8周时出现抗 HBs阳性 ,而对照组中无一例血清HBsAg发生变化。表明HBVDNA疫苗能有效诱导健康及HBVTg小鼠细胞免疫应答 ,提示其通过增强细胞免疫功能作为抗HBV免疫治疗的可行性     

电脉冲肌注法增强治疗型HBV DNA疫苗免疫效果的实验研究

为提高细胞内质粒DNA的导入率并增强DNA疫苗诱导的免疫效果 ,采用在体电脉冲肌注法接种治疗型HBVDNA疫苗。结果接受电脉冲(2 0 0V/cm)肌注的 8只BALB/c小鼠局部肌肉组织荧光素酶活性为 1 6 1 70± 1 2 5 33RLU ,未加电脉冲对照组为 8 0 2±8 0 0RLU ,相差 4个数量级 ,差异具非常显著性 (P <0 0 0 5 ,t=3 6 74 )。新西兰兔电脉冲肌注法接种后第 2、4周 ,双质粒 (pS2 ·S pFP)大剂量组 (5 0 5 0 μg/只 )血清抗 HBs阳性动物数明显较同期未加电脉冲对照组 (大剂量 :1 0 0 0 1 0 0 0 μg/只 )高 ,差异具显著性意义 (P <0 0 5 ) ;第 1 3周时 ,电脉冲免疫大 (5 0 5 0 μg/只 )、中 (2 5 2 5 μg/只 )、小 (5 5 μg/只 )剂量组均有血清抗 HBs阳性鼠出现 ,分别为 5、4和 4 只 ,组间阳性动物数并无显著性差异 (P >0 0 5 ) ,但均较同期的对照组高 ,并具有显著性意义 (P <0 0 5 )。恒河猴电脉冲肌注法接种后 8周血清抗 HBs阳性动物数为大剂量 (1 0 0 0 1 0 0 0 μg/只)组 3/ 3只 ,中剂量 (5 0 0 5 0 0 μg/只 )组 2 / 3只 ,小剂量 (1 0 0 1 0 0 μg/只 )组 0 / 3只 ,大剂量组与小剂量组及非电脉冲对照组之间比较差异具有显著性意义 (P <0 0 5 ) ;至免疫第 1 3周时 ,电脉冲免疫的大、中、小 3个剂量组     

1.3拷贝C基因型HBV转基因小鼠的制备及检测

目的制备1.3拷贝C基因型HBV转基因小鼠,为乙肝的防治提供较好的动物模型。方法采用受精卵显微注射法,制备1.3拷贝C基因型HBV转基因小鼠;采用PCR、ELISA、荧光定量PCR和免疫组化方法检测HBV基因在转基因小鼠体内的整合、复制和表达情况。结果共注射受精卵2282枚,成活2024枚,注射成活率88.7%。共移植假孕雌鼠72只,59只怀孕,假孕雌鼠妊娠率81.9%。共产下F0代小鼠185只,PCR检测共有19只整合阳性,阳性率10.3%。血清荧光定量PCR结果显示,其中6只小鼠有HBV DNA复制,拷贝数为102~103拷贝/ml;经传代产下F1代小鼠96只,PCR检测HBV DNA阳性33只,阳性率34.4%。血清荧光定量PCR结果显示,其中10只小鼠有HBV DNA复制,拷贝数为102~103拷贝/ml;F0代和F1代小鼠随机分别各取3只进行肝脏和肾脏HBsAg免疫组化检测结果均为阳性,且肾脏表达高于肝脏。结论 1.3拷贝C基因可以在上述制备成功的C型HBV转基因小鼠体内复制和表达,并且可以遗传给下一代。     

治疗型HBV DNA疫苗的研究与应用

综述治疗型乙型肝炎病毒(HBV)疫苗研究概况,重点阐述治疗型HBV DNA疫苗研究进展、治疗乙型肝炎的依据、作用机制和与传统疫苗的比较等。同时对我们自行研制的治疗型双质粒HBV DNA疫苗的特色做了较客观的评价。     

治疗型HBV DNA疫苗在小鼠组织中的分布和长期毒性研究

为研究治疗型HBV DNA疫苗使用的安全性，观察质粒在小鼠组织中的分布和其长期毒性，采取给小鼠肌注—电转染治疗型HBV DNA疫苗10μg和50μg后，用PCR法检测外源基因在小鼠组织的分布和存留时间；另用小鼠肌注—电转染治疗型HBV DNA疫苗30、60和120μg，每周2次，连续4周，共8次，于末次给药后48h，各组活杀1／2，留下1／2继续观察4周，进行血液学、血生化、病理组织学及抗核抗体检查。结果单次肌注—电转染疫苗后，质粒DNA主要分布于注射部位肌肉组织，可存留8周，其他组织也有散在低水平分布，但持续时间较短；未发现动物有异常表现，血液学、血生化和病理组织学检查未见异常；未观察到抗核抗体的产生和自身免疫病理损害。上述结果表明，治疗型HBV DNA疫苗安全性良好。     

治疗型HBV DNA疫苗肌注-电转染法免疫恒河猴的效果及安全性观察

为观察肌注—电转染法接种治疗型HBVDNA疫苗对恒河猴的免疫效果，对健康恒河猴采用肌注—电转染法接种治疗型HBV DNA疫苗，剂量分别为0．2mg／只、1mg／只和2mg／只；前3次给药时间间隔1个月，主要观察免疫效果；此后6次给药为每天1次，观察重复给药的安全性。结果显示肌注—电转染法接种疫苗后，不同剂量组均可有效诱导恒河猴产生HBsAg特异性抗体(抗—HBs)；重复给药未见明显的各系统毒副反应及血液学和血生化异常，血清抗核抗体(ANA)阴性。表明治疗型HBV DNA疫苗用肌注—电转染法免疫可显著增强恒河猴的免疫效果；多次重复接种该疫苗未见恒河猴的毒性反应，疫苗具有安全性。     

电脉冲介导的治疗性双质粒HBV DNA疫苗的临床安全性及免疫原性研究

目的 观察电脉冲(EP)介导的治疗性双质粒HBV DNA疫苗的安全性及免疫原性.方法 将30名健康志愿者随机分为低(1mg)、中(2mg)、高(4mg)三个剂量组(n=10).于0、4、12、24周肌注联合EP导入治疗性双质粒HBVDNA疫苗.每个剂量组随机再分成两组(n=5),分别使用两种不同输出电压(36V和60V)导入DNA疫苗.观察受试者HBVDNA疫苗给药前后生命体征,物理学诊断指标(心电图、胸透、B超),实验室检查指标(血、尿常规、血液生化、凝血酶原时间、甲状腺功能、肿瘤标记物),免疫学检测指标[干扰素y(IFN-γ)、抗核抗体(ANA)、抗双链DNA抗体]、HBV血清标记物(HBsAg、HBcAb、HBeAg、HBeAb、HBV DNA)及抗HBs等的变化.结果 所有志愿者接受疫苗后,耐受性良好、生命体征平稳,个别受试者出现一过性体检指标升高或轻度异常,怀疑与用药有关,但均能自行缓解或恢复;抗HBs在大剂量36V组中有升高趋势,其中1例受试者给药后达17.22mU/ml.结论 EP介导的治疗性双质粒HBVDNA疫苗在低、中、高三个剂量组中均显示较好的耐受性和安全性,且在大剂量组中具有一定的体液免疫原性.     

抗HBV治疗性疫苗治疗HBV携带者的临床实验研究

目的　进一步验证抗HBV治疗性疫苗治疗HBV携带者的临床疗效。方法　将确诊为HBV携带者的 6 0 0例患者随机分为两组 ,一组为抗HBV治疗性疫苗实验组 ,30 0例 ,用抗HBV治疗性疫苗治疗 ,每月 1次 ,皮下注射 ,同时服用维生素C 5 0 0mg/d,疗程为1 2个月 ;另一组为对照组 ,30 0例 ,用生理盐水 2ml,皮下注射 ,每月 1次 ,同时服用维生素C 5 0 0mg/d,1 2个月为 1疗程。两组在年龄、性别、病程、HBV标记物状况方面均有良好的可比性。治疗过程中第 1 2、2 4、4 8周复诊 1次。治疗前及每次复诊时检测血清HBsAg、HBeAg、HBVDNA、抗 HBe、抗 HBs及ALT。上述指标第 4 8周的检验结果作为评价疗效的依据。疗程期满停止治疗后 ,对实验组 2 0 8例与对照组 1 96例进行为期 1 2个月的随访。随访期内第 1 2个月做上述HBV标记物检测 ,以评价终止治疗 1 2个月内HBV标记物的改变。结果　抗HBV治疗性疫苗实验组的HBsAg、HBeAg、HBVDNA的阴转率及抗 HBe与抗 HBs的阳转率分别为 1 4 7%、32 0 %、37 3%、2 0 0 %和 7 1 % ;对照组分别为 2 0 %、6 0 %、6 7%、1 3%和 0 % ,两组相比差异有统计学意义 (P <0 0 5 )。实验组停止治疗后随访 1年 ,复发率为 5 9%。结论　抗HBV治疗性疫苗治疗对HBV携带者有一定的抗病毒疗效     

热应激下热休克蛋白70对细胞保护作用研究进展

热休克反应（heat shock response,HSR）是一切有生命细胞遇短暂高温、缺氧、亚砷酸盐及H2O2等应激原刺激时,所发生的一种以基因表达和调控变化为特征的细胞应激反应。HSR启动热休克基因表达,产生一组高度保守的热休克蛋白（heat shock proteins,HSPs）。而热休克蛋白（HSPs）是一类广泛存在所有原核和真核细胞内,具有高度保守性的蛋白家族。当生物细胞受到应激刺激（如热、缺血、缺氧、病毒感染等）和其损伤因素作用而发生应激反应时,就会自动启动HSPs合成基因,促使HSPs的合成,以对细胞起一定的保护作用。有人根据其分子量、等电点将HSPs分成5大类（或家族）,分别为低分子量HSPs家族、中等分子量HSPs家族、HSP70家族、HSP90家族和HSP110家族。几乎所有的细胞均能合成HSPs,其中HSP70家族含量最多亦是最重要的HSPs。目前认为HSP70具有多种功能,是一种非特异性细胞保护蛋白,因此是最受关注、研究最多的一种HSPs。     

532nm KTP脉冲激光照射后小鼠皮肤组织热休克蛋白70的表达

目的探讨不同能量密度的激光照射后小鼠皮肤组织热休克蛋白HSP70的表达。方法以能量密度分别为0、3、6、9和12 J/cm2,脉宽为30 ms的单脉冲532 nm KTP激光照射小鼠背部皮肤,用免疫组织化学方法检测照射后3 h小鼠皮肤组织中HSP70的表达。结果激光照射后小鼠皮肤中HSP70表达增加;HSP70表达主要位于皮下75～150μm处。能量密度为6～9J/cm2的KTP激光照射时真皮层中HSP70表达增加最多。结论皮肤中热休克蛋白HSP70的表达可反映不同曝光剂量的单脉冲激光照射皮肤组织后的热损伤情况,本实验热休克蛋白表达为532 nm KTP脉冲激光治疗的能量密度参数提供依据。     

白细胞介素2提高HBV-S DNA疫苗的免疫效应

目的观察IL-2真核表达载体对HBV-SDNA疫苗诱导BALB/c小鼠的特异性免疫应答的影响.方法肌肉注射基因疫苗及IL-2真核表达载体,ELISA法检测小鼠血清抗HBs,4h51Cr释放法检测小鼠脾细胞CTL活性.结果免疫8周后,单纯注射pCR3.1-S及共注射IL-2真核表达载体的小鼠血清450nmA值分别为1.24±0.10及1.98±0.17.CTL细胞杀伤活性分别为(50.5±6.4)%及(61.9±7.1)%,两组均有明显差异(P＜0.01).结论IL-2的真核表达载体能够提高小鼠对DNA疫苗的免疫应答.基因疫苗可能用于预防及治疗HBV感染.     

增强子Ⅰ对乙型肝炎病毒DNA疫苗免疫应答的影响

目的 研究乙型肝炎病毒（HBV）自身增强子I（enhancerI，ENHI）对HBV DNA疫苗免疫应答的影响。方法 采用PCR法以HBVadr亚型全基因DNA序列为模板分别扩增表面抗原（HBsAg）和HBsA-ENHI基因片段，重组到载体VR1012中，构建两种HBV DNA疫苗，转染CADS-7细胞及HepG2细胞并免疫BALB／c小鼠。采用蛋白印迹、ELISA、ELISPOT等方法检测其在COS-7和HepG2细胞内的表达及小鼠的体液及细胞免疫应答效果。结果 转染的HepG2和COS-7细胞均表达HBsAg;连接ENHI的HBV DNA疫苗转染HepG2细胞后HBsAg表达量明显升高，两种疫苗转染COS-7细胞表达HBsAg无明显差异；免疫小鼠后第2周产生HBsAb及HBsAg特异性细胞毒T淋巴细胞（CTL），两种疫苗免疫产生的HBsAb及HBsAg特异性CTL无明显差异。结论ENHI可使HBV DNA疫苗转染HepG2细胞表达HBsAg明显增加，对转染COS-7细胞表达HBsAg及接种BALB／C小鼠引起的免疫应答无明显影响。     

乙肝核酸疫苗在BALB/c小鼠体内的生物分布情况

目的：了解DNA疫苗在BALB／c小鼠体内的生物分布情况，建立DNA疫苗体内生物分布情况研究方法。方法：乙肝核酸疫苗(HBV DNA)经^32P标记、分离、纯化、鉴定后，胫前肌注射给药，结合三氯乙酸(TCA)沉淀，研究肌注乙肝核酸疫苗后BALB／c小鼠体内的生物分布情况。结果：质粒DNA疫苗除注射局部肌肉分布较多外，其他一些重要组织也有分布，其中腺体组织(肾上腺、胰腺、胸腺)中的浓度最高，其次为排泄物(尿、肠内粪)，脑组织中浓度最低。各组织中可沉淀放射性按血浆浓度时间曲线下面积(AUC)从高到低排列依次为胸腺、肾上腺、膀胱、生殖腺、脂肪、肠内粪、胰腺、颌下腺、脾、小肠、眼球、肝、肠内容、肾、甲状腺、肺、淋巴结、对侧肌肉、心脏和脑。结论：^32P标记DNA疫苗后各组织β计数结合三氦乙酸沉淀法研究核酸疫苗生物分布情况，方法灵敏、可靠，易于分析。     

胃癌MG7-Ag模拟表位与HSP70融合基因疫苗的构建及其诱导小鼠免疫反应的研究

目的　以热休克蛋白 70 (HSP70 )为载体 ,构建胃癌MG7 Ag模拟表位与HSP70融合基因的DNA疫苗 ,并观察该疫苗诱导C5 7BL/ 6小鼠产生MG7 Ag特异性免疫反应的作用。方法　将胃癌MG7 Ag模拟表位 (九肽 )的编码序列设计在HSP70下游引物的 5′末端 ,通过PCR方法获得HSP70与模拟表位的融合基因片段。将PCR产物克隆入真核表达载体pcDNA3.1(+) ,构建融合基因疫苗。将该融合基因疫苗接种C5 7BL/ 6小鼠股四头肌 ,每隔 3周加强免疫一次 ,共接种 3次。分别在每次接种后 3周收集免疫血清 ,用细胞ELISA法检测小鼠血清中抗MG7 Ag抗体的水平。末次免疫后 3周 ,收集脾细胞 ,用51Cr释放法检测MG7 Ag特异性CTL的杀伤活性。结果　PCR扩增得到大小约 2 .0kb的片段 ,与预期大小一致。将该片段克隆入pcDNA3.1(+) ,DNA序列测定证实MG7 Ag模拟表位的编码序列已成功融合于HSP70cDNA的 3′末端。基因疫苗免疫后 ,融合基因免疫组小鼠于第 9周出现抗MG7 Ag抗体 ,而对照组小鼠无MG7 Ag抗体产生 (P <0 0 5 )。51Cr释放实验结果表明 ,融合基因免疫组小鼠脾细胞对靶细胞的杀伤率与对照组相比无显著差异 (P >0 0 5 )。结论　MG7 Ag模拟表位与HSP70融合基因疫苗构建成功 ;该融合基因疫苗能够诱导MG7 Ag特异性的体液免疫反应     

噬菌体表面展示技术筛选乙型肝炎病毒前S1蛋白结合蛋白基因

目的 以乙型肝炎病毒(HBV)前s1蛋白为靶蛋白,寻找其相应的结合蛋白。方法 应用T7 cDNA文库噬菌体展示技术克隆与前s1蛋白具有结合作用的蛋白序列,命名为前s1结合蛋白(PreS1BP)。将推断的氨基酸序列在蛋白质库中进行搜索,自GenBank中获得结合蛋白的cDNA和基因组的全长序列。结果 初步确定PreS1BP即为神经胶质瘤抑制基因区候选基因2(GLTSCR2),cDNA长为1436核苷酸,基因位于第19号染色体长臂13.3区(19q13.3),长度11445碱基对(bp),位于19号染色体10403483～10414989,PreS1BP基因含有13个外显子,具有12个内含子。结论 应用T7 cDNA文库噬菌体展示技术和生物信息学方法获得了HBV PreS1BP基因。     

急性缺氧暴露对豚鼠耳蜗热休克蛋白90表达的影响

目的:观察热休克蛋白90(heat shock protein 90,HSP 90)在急性缺氧后早期豚鼠耳蜗中的表达变化特点。方法:利用自制缺氧舱使实验动物缺氧,应用免疫组化SABC法结合图象分析技术检测正常和急性缺氧后早期豚鼠耳蜗HSP 90 的表达。结果:HSP 90在正常和缺氧损伤后豚鼠耳蜗各回均有不同程度的染色,主要阳性部位是螺旋神经节、螺旋器、血管纹和螺旋韧带。但缺氧损伤后早期HSP 90在耳蜗各阳性部位的表达均有增强,其中在螺旋神经节和螺旋器的表达增强最明显(P<0．01)。结论:HSP 90在正常和缺氧豚鼠耳蜗组织均有表达,缺氧可明显诱导HSP 90在耳蜗组织的表达增强。HSP 90可能对缺氧损害后耳蜗功能的恢复起作用。     

乙型肝炎病毒前-S1蛋白反式激活蛋白5基因的克隆化研究

目的克隆乙型肝炎病毒（HBV）前-S1蛋白反式激活新基因PS1TP5的cDNA,并应用生物信息学技术初步探讨其结构及功能。方法应用聚合酶链反应（PCR）技术以HepG2细胞的cDNA为模板扩增PSlTP5,以pGEM-T载体进行TA克隆,通过PCR、限制性酶切分析及测序进行鉴定,再将其亚克隆到真核表达载体pcDNA^TM 3．1／myc-His A,通过PCR、限制性酶切分析进行鉴定,并应用生物信息学技术初步分析其物理化学性质、蛋白质结构和功能。结果PCR成功扩增出PS1TP5基因,并将其分别克隆进pGEM-T和pcDNA^TM3．1／myc-HisA载体,经PCR、限制性酶切鉴定后测序证实。因其可以被前-S1蛋白反式激活,故命名为前-S1反式激活蛋白5（PS1TP5）,已在GenBank中注册,注册号：AY427953。生物信息学分析确定其ORF为438个核苷酸（nt）,编码产物为145个氨基酸残基（aa）。结论发现了HBV前-S1蛋白反式激活新基因PS1TP5,构建了pcDNA^TM 3．1／myc-His A真核表达载体,为进一步研究其生物学功能及慢性乙型肝炎发病机制创造了条件。     

乙型肝炎病毒X蛋白反式激活基因XTP4的克隆化研究

目的 筛选并克隆乙型肝炎病毒X蛋白(HBxAg)反式激活新型靶基因。方法 以HBxAg表达质粒pcDNA3．1(-)-X转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3．1(-)为平行对照,提取mRNA并进行抑制性消减杂交分析,应用生物信息学方法对所获基因片段序列进行分析发现,其中之一为新型基因片段,与GenBank(中注册的已知功能基因序列没有同源性。通过序列同源性搜索、比对和电子拼接,根据基因起始密码子的Kozak规则和终止密码子下游保守的多聚腺苷酸信号序列,确定新型基因序列。从转染了pcDNA3．1(-)-X的HepG2细胞提取总RNA,以逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术扩增,获得阳性克隆之后,进行鉴定并对克隆的基因及其编码产物的序列进行分析。结果 该新基因的编码序列全长为348个核苷酸(nt),编码产物由116个氨基酸残基(aa)组成,并测序证实,命名为XTP4,在Gen-Bank中注册,注册号为AF490253。结论 通过分子生物学技术与生物信息学技术的结合,发现并鉴定、克隆HBxAg反式激活作用的新型靶基因XTP4,为进一步研究HBxAg反式激活作用的分子生物学机制和探索新型治疗技术奠定基础。     

膦甲酸钠(可耐)治疗慢性乙型肝炎及其对HBV-DNA的影响

目的　观察膦甲酸钠治疗慢性乙型肝炎及其对HBV DNA的影响。方法　 46例慢性乙肝患者 ,随机分为治疗组 (给予膦甲酸钠注射液和一般护肝药物 ) 2 4例 ,对照组 (仅给一般护肝药物 ) 2 2例。疗程均为 2 8d。观察膦甲酸钠治疗慢性乙肝疗效以及对血清HBV DNA的影响。结果　治疗组有 10例 (4 1.7% )HBV DNA转阴 ,9例 (3 7.5 % )HBeAg转阴 ;治疗组治疗后HBeAg ,HBV DNA定量转阴率均显著高于对照组(P <0 .0 1) ,而且治疗组治疗后ALT ,HBV DNA定量与对照组治疗后结果比较差异有显著性 (P <0 .0 1)。结论　膦甲酸钠具有较好的抑制乙肝病毒复制的效果 ,其有可能成为治疗慢性乙肝感染安全而有效的药物。     

应用微阵列技术筛选HBV前-S1蛋白的反式调节基因谱

目的 阐明前-S1蛋白的表达对乙型肝炎病毒(HBV)感染肝细胞基因表达谱的影响。方法 以含有HBV全基因组的质粒G376-7(GenBank号：AF384371)作为模板,应用PCR扩增前-S1蛋白编码基因片段,以常规的分子生物学技术构建表达载体pcDNA3．1(-)-preS1,以脂质体转染肝母细胞瘤细胞系HepG2,提取总mRNA,逆转录为cDNA,与转染空白表达载体pcDNA3．1(-)的HepG2细胞进行DNA芯片分析并比较。结果 在1152个基因表达谱的筛选中,发现有30个基因表达水平显著上调,38个基因表达水平显著下调。结论 前-S1基因的表达对于肝细胞基因表达谱有显著影响。DNA芯片技术是分析反式调节靶基因的有效技术途径。