反义myb寡核苷酸对内皮素诱导动脉平滑肌细胞增殖抑制…

合成反义在正义ｃ－ｍｙｂ１８ｍｅｒ，分别导入培养的ＷＫＹ主动脉平滑肌细胞（ＳＭＣｓ），同时用内皮素诱导ＳＭＣｓ增殖。反义ｃ－ｍｙｂ寡核苷酸（ＯＤＮｓ）对内皮素诱导ＳＭＣｓ的抗细胞增殖抑制作用随浓度（６０μｍｏｌ．Ｌ＾－１－１２０μｍｏｌ．Ｌ＾－１）的增加而增加。用１２０μｍｏｌ．Ｌ＾－１反义ＯＤＮ抗细胞增殖能力随时间延长而下降。免疫组化显示受掏细胞ｍｙｂ水平较同期对照组或正义ＯＤＮ组低。以上为反     

过表达泛素偶联酶E2C对293T细胞增殖的影响

目的:构建稳定过表达人类泛素偶联酶E2C(UBE2C)的293T人胚肾细胞株,初步探讨其对293T细胞增殖的影响。方法:采用脂质体法将已成功构建的pcDNA3.1(-)/UBE2C真核表达质粒转入293T人胚肾细胞株中,随后经G418筛选4周,得到阳性克隆细胞株;用Western blot技术检测并鉴定UBE2C基因在293T细胞中的表达情况;用MTT法检测UBE2C对293T细胞增殖的影响。结果:Western blot检测显示,转pcDNA3.1(-)/UBE2C组293T细胞的UBE2C蛋白表达水平明显高于转pcDNA3.1(-)组(P<0.01)。MTT法检测结果显示转pcDNA3.1(-)/UBE2C组293T细胞的增殖速度明显快于转pcDNA3.1(-)组(P<0.01)。结论:成功建立稳定过表达UBE2C的293T细胞株,过表达UBE2C可促进293T细胞的增殖。     

构建PSMA shRNA慢病毒载体转染293T细胞后PSMA mRNA和蛋白的表达变化

目的：利用基因工程技术筛选获得阻断前列腺癌细胞株LNCaP中前列腺癌特异性膜抗原 (PSMA) 表达的shRNA序列，并构建慢病毒载体。观察转染前列腺癌细胞后对PSMA mRNA和蛋白表达的影响。方法：〖HTSS〗根据PSMA基因信息，设计siRNA1、siRNA2、siRNA3三条针对PSMA基因cds区的siRNA序列，组建shRNA对应的4对互补的单链DNA，包括siRNA的正义链和反义链；正义链序列按5向3顺序依次为：酶切位点（BamHⅠ）、干扰序列（19 bp）、loop环（TTCAAGAGA）、干扰序列的反向互补序列（19 bp）、终止信号（TTTTT）、酶切位点（EcoRⅠ）。将合成的序列插入空载体pSIH1-H1-copGFP shRNA vector中，转染前列腺癌细胞后，通过real-time PCR检测对PSMA mRNA表达，通过Western blotting检测PSMA蛋白的表达。结果：〖HTSS〗设计的3条针对PSMA的序列中第2条的抑制效果最好，目的序列位于PSMA（NM_004476）的1207到1226，茎环序列为5-GATCC GTCTCAAAGTGCCCTACAA TTCAAGAGA TTGTAGGGCACTTTGAGAC TTTTT G-3。其对前列腺癌细胞株中PSMA mRNA表达的抑制率为60%，对PSMA蛋白表达的抑制率为86%。转染细胞后，细胞可以稳定低表达PSMA。结论：〖HTSS〗成功获得阻断前列腺癌细胞株LNCaP PSMA表达的shRNA序列，并构建慢病毒载体，pSIH-PSMA-siRNA2转染前列腺癌细胞后对PSMA mRNA 表达的抑制率为60%，对PSMA蛋白表达的抑制率达86%。为后期研究PSMA在前列腺癌发病中的作用机制以及免疫导向治疗等提供了实验基础。     

Survivin反义核酸对SMMC-7721细胞增殖和凋亡的影响

Survivin是凋亡抑制蛋白（IAP）家族的一个成员，具有强大的抗细胞凋亡功能，在几乎所有肿瘤组织中特异性表达，而在正常成年终末分化组织中低表达甚至不表达。本研究针对Survivin mRNA序列设计了反义寡核甘酸，RT—PCR检测表明，该序列反义寡核苷酸可明显降低细胞中survivin基因的mRNA含量；Western印迹显示Survivin蛋白水平也被降低。MTT比色实验法检测结果说明人Survivin反义寡核苷酸抑制SMMC-7721细胞增殖，抑制率为43％，远高于无义寡核苷酸组和空白对照组。反义寡核苷酸还显著增强SMMC-7721细胞对于抗肿瘤药高三尖杉酯碱的敏感性，TUNEL法检测结果显示，在较低高三尖杉酯碱浓度下，反义寡核苷酸转染细胞的凋亡率明显高于其它对照组。本研究结果提示，survivin表达的靶向抑制有望应用于肿瘤的辅助治疗之中。     

胆固醇缺乏抑制Jurkat T淋巴细胞增殖及分子机制研究

人蛋白酪氨酸激酶信号传递系统及细胞周期调控这一角度来探讨胆固醇缺乏抑制Ｊｕｒｋａｔ细胞增殖的分子机制。方法采用接免疫荧光染色，流式细胞久仰分析技术及免疫细胞化学染色等方法做相关分析。结果经去脂血清培养基培养的Ｊｕｒｋａｔ细胞加ｌｏｖａｓｔａｔｉｎ处理３ｄ后，＾３Ｈ－ＴｄＲ掺入率明显下降，细胞增殖受抑细胞受阻于Ｇ０／Ｇ１期，ＰＴＫ活性及细胞ｃｙｃｌｉｎＤ１、ＣＤＫ４蛋白的表达明显降低，加入ＬＤＬ可以     

稳定表达细胞毒性T淋巴细胞相关抗原CTLA-4的293T细胞株的建立

目的：构建稳定表达细胞毒性 T 淋巴细胞相关抗原-4（cytotoxic T lymphocyte antigen-4, CTLA-4）的293T 细胞株。方法首先从人外周血获取 PBMC 加以 T 细胞活化; PCR 扩增 CTLA-4转录本,连接pUCm-T 质粒引入 HindⅢ和 EcoRⅠ双酶切位点后转入真核细胞表达质粒 pcDNA3．1;重组质粒 pcDNA3．1-CTLA-4经脂质体转染293T 细胞,以抗生素 G418筛选表达 CTLA-4的293T 细胞;定量 PCR、免疫荧光分别检测293T 细胞 CTLA-4表达与细胞定位。结果血样来源 T 细胞经活化后表达 CTLA-4转录本。 HindⅢ和EcoRⅠ双酶切证实重组质粒内 CTLA-4插入序列正确; RT-PCR 及免疫荧光检测证实293T 细胞能够稳定表达目的蛋白 CTLA-4,并定位于细胞膜表面。结论成功构建的 pcDNA3．1-CTLA-4重组真核表达载体,在293T 细胞膜表面实现了稳定表达,为进行相关生物学理论与应用研究打下基础。     

小鼠Prohibitin真核表达质粒的构建及在293T细胞中的表达

目的构建小鼠Prohibitin基因真核表达质粒,在293T细胞中进行表达鉴定,为研究小鼠Prohibitin基因功能奠定基础。方法以小鼠Prohibitin基因cDNA序列为模板,设计特定引物,应用PCR的方法扩增其编码序列全长,并将其克隆到真核表达载体pEFP-C2中,将获得的重组表达质粒转染293T细胞,应用RTPCR、Western blot方法检测其表达。结果成功构建了pEGFP-Prohibitin真核表达质粒,将其成功转染293T细胞,pEGFP-Prohibitin转染组Prohibitin蛋白和mRNA在293T细胞的表达量比转染空载转染组明显增加。结论成功构建了真核表达质粒pEGFP-Prohibitin,并在真核细胞表达良好,为研究小鼠Prohibitin的基因功能奠定了基础。     

CTLA4Ig抑制T细胞增殖的体外研究

目的 观察CTLA4Ig在人外周血T细胞增殖反应中的作用。方法 植物血凝素（PHA）、脂多糖（LPS）、金葡菌肠毒素B（SEB）刺激T细胞增殖,在加入或未加入CTLA4Ig情况下,观察细胞形态并检测^3H-TdR掺入量。结果ＣＴＬＡ４Ｉg对ＰＨＡ、ＬＰＳ的抑制作用呈剂量依赖关系。而CTLA4Ig浓度只高于5ug/mL时,对SEB才有抑制作用。且可完全抑帛。结论CTLA4Ig对PHA、LPS、SEB刺激下的T细胞增殖反应有明显的抑制作用。但反应模式不一致。     

STAT3反义表达载体的构建、稳定表达及对M1白血病细胞表型的影响

目的 探讨JAK／STATs通路在IL－6信号转导中的功能。方法 将含起始密码子在内的约1．2kbSTAT3cDNA反向插入到真核细胞表达载体pcDNA3中,采用电穿孔法重组质粒导入到M1小鼠急性髓系白血病细胞中,进行G418筛选。结果 G418筛选出抗性克隆后,基因组DNAPCR扩增表明STAT3反义基因片段已导入M1细胞中并在基因组中整合。STAT3反义RNA不影响M1细胞的生长动力学特征,但可显著拮抗IL－6诱导的STAT3激活,并拮抗IL－6对M1细胞的生长抑制效应。结论 STAT3反义RNA能够在M1细胞中稳定表达,成为进一步研究JAK／STATs途径功能的新模型。     

反义RNA抑制肝癌细胞株端粒酶活性与p16、p21表达的关系

目的：观察反义端粒酶ＲＮＡ对ＳＭＭＣ７２２１细胞的作用,并检测ｐ１６、ｐ２１的表达情况,探讨端粒酶在肝癌发生过程中的可能作用及反义端粒酶ＲＮＡ在肝癌治疗中的意义。方法：经脂质体介导的方法将ｐＢＢＳ２１２－ｈＴＲ（反义端粒酶ＲＮＡ真核表达载体）导入ＳＭＭＣ７７２１细胞中,细胞克隆转移扩大培养后,采用流式细胞仪、ＴＲＡＰ－ＰＣＲ－ＥＬＩＳＡ、电镜、免疫组化技术结合图像分析,在检测ＳＭＭＣ７７２１／ｐＢ     

反义RNA体外抑制丙型肝炎病毒基因表达的研究

目的 研究丙型肝炎病毒(HCV)基因调控方式及反义RNA对HCV基因表达的体外抑制作用。方法 采用业已建立的HCV基因调控细胞模型，以重组质粒共转染策略，将反义RNA重组质粒与HCV5′非翻译区(5′UTR)调控的报道基因——虫荧光素酶(luc)重组质粒共同转染人肝癌细胞系(HepG2)，并以不表达反义RNA的原核重组质粒和不含有HCV5′UTR的luc重组质粒做为对照。转染细胞经短期培养后制备细胞提取液，荧光检测法检测luc基因的表达。结果 针对HCV5′uTR的反义RNA可以在体外有效抑制由HCV5′UTR调控的luc基因的表达，并具有剂量依赖效应。对照重组质粒转染实验证明，上述抑制作用呈序列特异性。结论 HCV5′UTR具有调控下游目的基因表达的重要功能，反义RNA可以在体外有效抑制由HCV5′UTR介导的病毒基因的表达。     

反义CD40RNA对EB病毒转化的B细胞CD40分子表达和增殖能力的影响

目的 :探讨瞬时表达的反义CD4 0RNA ,对EB病毒转化的健康人B细胞膜表面CD4 0分子表达和增殖能力的影响。方法 :应用T A克隆技术和亚克隆技术 ,构建人反义CD4 0RNA的真核表达载体pcDNA3/CD4 0 ,并以其转染本室建立的EB病毒转化的健康人B细胞。应用流式细胞仪 (FACS) ,检测B细胞膜上CD4 0分子表达的变化。应用MTT比色法检测反义CD4 0RNA对B细胞增殖能力的影响。结果 :与转染空载体pcDNA3组相比 ,转染pcDNA3/CD4 0细胞上CD4 0分子的表达降低 (P<0 .0 1) ,其增殖能力明显降低 (P <0 .0 1)。结论 :反义CD4 0RNA技术 ,可作为有效的免疫调控手段。CD4 0基因本身在细胞的生长代谢中也起着重要作用     

Aging affects initiation and continuation of T cell proliferation

Aging is associated with a decline in immune responses, particularly within the T cell compartment. While the expansion of specific T cells in response to virus infections is consistently decreased in aged mice, the differences in T cell activation between young and aged mice as demonstrated in each round of proliferation remain poorly defined. In the present study, we utilized the T cell mitogen, ConA, to explore if fewer T cells of aged mice initiate proliferation upon mitogen stimulation or if similar numbers of T cells of aged mice begin proliferation but undergo fewer rounds of division. We also examined whether these age-associated changes in proliferation are reflected by differences in T cell activation by comparing activation markers (CD25, CD69, CD44, and CD62L) on T cells of young and aged mice at each round of proliferation. Not only was the kinetics of the expression of these markers greatly different between young and aged mice on the entire CD8 T cell population, but also at each round of proliferation. Our results demonstrate that a larger percentage of CD8 T cells of aged mice do not proliferate at all upon stimulation. Of the CD8 T cells of aged mice that do proliferate, a larger percentage start later and stop sooner. These results suggest that multiple levels of alteration may need to be considered when trying to maximize the immune response of aged individuals.     

反义封闭PKARⅠβ基因表达对双龙接骨丸含药血清体外促成骨细胞增殖作用的影响

目的:进一步明确cAMP依赖的磷酸激酶Ⅰ型调节亚基β(PKARⅠβ)在双龙接骨丸含药血清促进体外培养成骨细胞增殖过程中的作用。方法:构建表达 PKARⅠβ基因反义序列的重组子pcDNA-antiPKARⅠβ,脂质体法转导成骨细胞HFOB1.19,MTT法检测其增殖状况。结果:高剂量含药血清处理的反义基因封闭组中,HFOB1.19的增殖能力与空白血清对照组无显著差异(P>0.05)。结论:双龙接骨丸含药血清的体外促成骨细胞增殖作用与PKARⅠβ基因的表达密切相关。     

反义阻断CROC-1基因表达导致细胞生长变慢

目的:建立CROC- 1 基因表达被阻断的FL-CROC- 1 ^-细胞系,研究CROC- 1 基因在细胞生长中的作用。方法: 运用反义技术将新近发现的人泛素缀合酶样蛋白基因CROC- 1 的适当长度cDNA片断克隆到本室改建的真核细胞表达载体pMAMneo-amp^-中,经限制性内切酶图谱分析筛选出反向插入的表达CROC- 1 反义RNA的重组质粒。将此反义表达重组质粒(pMAM-antiCROC- 1 )用改良的磷酸钙法转染人羊膜FL细胞并用含G418的培养基筛选,测定G418抗性的FL-CROC- 1 ^- 细胞系的生长速度。 结果:建立的FL-CROC- 1 ^- 细胞系在地塞米松诱导下CROC- 1 基因表达被反义抑制后,其生长速度较对照FL细胞及转染了载体pMAMneo-amp^- 的FL细胞(FL-MAMneo)的明显要慢(P＜0.05)。结论: 本研究成功地建立了CROC- 1 基因表达被阻断的FL-CROC- 1 ^- 细胞系,并提示CROC- 1 基因编码的泛素缀合酶样蛋白在细胞生长中起正调控作用。     

人CD23基因的扩增及其在HEK 293T细胞的高效表达

目的建立一个有效表达CD23的系统。方法采用RT-PCR方法,从外周血淋巴细胞中扩增人的CD23cDNA基因,并将其克隆到真核表达载体pcDNA3·1B上,构建成pcDNA3·1/CD23质粒表达载体;将pcDNA3·1/CD23质粒转染HEK293T细胞,通过流式细胞仪和Westernblot检测CD23在细胞中的表达情况。结果扩增的CD23cDNA序列与文献报道的一致;通过构建表达载体和转染细胞实现了CD23cDNA在293T细胞膜上的表达。转染效率达80%以上,并获得了较高水平的表达。结论扩增CD23cDNA基因,经过转染HEK293T细胞,实现了CD23在HEK293T细胞的高效表达。     

小鼠微小RNA miR-21真核表达载体构建及其在293细胞的活性表达

目的构建小鼠微小RNA miR-21的真核表达载体,在人胚肾293细胞中验证其活性表达,为进一步以此载体研究miR-21的功能打下基础。方法根据小鼠miR-21的成熟序列及其上下游约170 bp的序列设计引物,利用PCR技术从小鼠基因组DNA扩增含有miR-21前体的片段382 bp,克隆到质粒pRc/CMV,对重组质粒经双酶切及测序分析,鉴定完全正确后转染人胚肾293细胞,G418(1 000 mg/L)筛选后获得miR-21稳定表达细胞系,Northern blot验证其在293细胞的过表达;同时构建pmiR-21-Luc reporter荧光素酶报告质粒,与miR-21重组质粒共转染293细胞进行荧光素酶活性分析,验证其调控活性。结果成功构建小鼠miR-21的真核表达载体,其可以在293细胞中稳定高效表达,荧光素酶活性实验证实其有生物活性。结论成功构建小鼠miR-21的真核表达载体,为进一步探讨miR-21的生物学功能奠定了实验基础。     

AR-GFP融合基因真核表达载体的构建及在HEK293细胞中的表达

目的：构建由绿色荧光蛋白（GFP）标记的人醛糖还原酶（AR）融合基因真核表达载体并在HEK293细胞中表达。 方法:应用DNA重组技术构建AR与GFP的融合基因（AR-GFP），将AR-GFP插入pcDNA3.1/myc-HisA真核表达载体中，通过磷酸钙共沉淀转染HEK293细胞，倒置荧光显微镜评价转染效率，Western blotting 技术检测AR基因在转染细胞中的整合及表达，分光光度法（UV法）测定AR表达活性，用公认的AR抑制剂（ARI）反证活性AR的存在。结果:荧光显微镜对转染细胞的观察及Western blotting 结果证实AR-GFP融合蛋白在HEK293细胞中表达，UV法测活、ARI抑制试验均未证实其生物学活性。 结论:转染的HEK293细胞可成功地表达AR-GFP融合蛋白，但不能成为ARI真核细胞筛选模型。     

hREV3基因表达被反义阻断的人胚肾细胞系的建立及其某些生物学特性观察

目的:建立hREV3基因表达反义阻断的细胞系并观察其生长特性与对烷化剂N-甲基-N’-硝基-N-亚硝胍(N-methyl-N’-nitro-N-nitrosoguanidine, MNNG)敏感性的改变。方法:利用改良磷酸钙-DNA共沉淀法分别将本室构建的持续和诱导表达反义hREV3 RNA的真核细胞重组表达质粒pBK-RSV-hREV3和pMAMneo-amp^--hREV3^-转染人胚胎肾细胞(HEK-293细胞),经G418筛选,建立相应的细胞系293-B-hREV3^-和293-M-hREV3^-。通过细胞计数方法观察这些细胞系的生长速率和不同浓度MNNG对细胞的细胞毒作用。 结果:持续或诱导阻断hREV3基因的表达对细胞生长速率均无影响;反义阻断细胞系对MNNG的细胞毒作用比母本293细胞较为敏感。结论:hREV3基因的编码产物并非细胞生长所必需而可能在细胞的DNA损伤修复中起作用。