促肝细胞再生磷酸酶1基因对舌癌细胞侵袭的影响

目的：探讨促肝细胞再生磷酸酶1（phosphatase of regenerating liver cell-1,PRL-1）对舌癌细胞侵袭能力的影响及其可能的机制。方法：应用 siRNA-PRL-1慢病毒载体转染处理舌癌 TCA8113细胞株后,分别采用荧光定量PCR和蛋白质印迹检测PRL-1基因和基质金属蛋白酶-2（matrix metalloproteinase-2,MMP-2）、基质金属蛋白酶-9（matrix metalloproteinase-9,MMP-9） mRNA和蛋白水平;采用 Transwell小室模型实验检测癌细胞的侵袭能力。结果：siRNA-PRL-1慢病毒转染组癌细胞PRL-1在RNA（0.425 0±0.010 0）和蛋白（2.720 0±0.110 0）水平明显下调（P=0.000,P=0.000）,同时MMP-2及MMP-9在RNA（0.562 2±0.180 0,0.617 1±0.100 0）及蛋白（0.592 4±0.010 0,0.476 2±0.020 0）表达水平降低（P=0.024,P=0.010,P=0.000,P=0.000）;Transwell实验siRNA-PRL-1慢病毒转染组细胞通过数（64.33±4.04）明显减少（P=0.000）。结论：siRNA-PRL-1转染可抑制舌癌细胞侵袭,其机制可能与PRL-1基因下调MMP-2及MMP-9的表达有关。     

特异性siRNA沉默TDGF-1基因表达对乳腺癌细胞迁移侵袭的影响

目的 探讨RNA干扰（RNA interference,RNAi）沉默TDGF-1基因表达对乳腺癌细胞侵袭的影响.方法 根据TDGF-1基因序列特点设计3个小干扰RNA（small interfering RNA,siRNA）后,转染人乳腺癌MDA-MB-468细胞,用荧光实时定量RT-PCR筛选出效果最好的siRNA.以该siRNA转染处理乳腺癌MDA-MB-468细胞后,分别采用实时定量RT-PCR和western blot检测TDGF-1基因mRNA和蛋白水平,以划痕试验方法评测癌细胞迁移能力;用Boyden模型观察癌细胞侵袭能力.结果 根据TDGF-1基因序列特点设计的3个siRNA均能抑制TDGF-1基因mRNA水平,以S1效果最好.S1 siRNA转染组TDGF-1 mRNA和蛋白水平明显下调,且呈浓度和时间依赖性（P＜0.001,P＜0.001）.体外试验发现,TDGF-1 siRNA转染可有效抑制乳腺癌细胞集落生长、侵袭和迁移能力,且与浓度相关（P＜0.005,P＜0.005,P＜0.005）.结论 TDGF-1在乳腺癌细胞迁移、侵袭中起着重要的作用;采用TDGF-1 siRNA转染可抑制乳腺癌细胞侵袭.     

下调FoxM1基因表达对宫颈癌细胞侵袭能力的影响

目的:研究靶向FoxM1基因的小分子干扰RNA(siRNA)下调宫颈癌Hela、C33A及Siha等细胞系FoxM1基因表达后细胞侵袭和迁移能力的改变,寻找新的宫颈癌治疗靶点。方法:设计靶向FoxM1基因小分子干扰RNA(siFoxM1)并分别转染宫颈癌细胞系Hela、C33A和Siha,实时定量RT-PCR和Western blot技术分别检测siFoxM1对细胞内源性FoxM1表达的影响;采用Transwell小室试验检测细胞迁移和侵袭能力改变。结果:1转染siFoxM1可特异高效地下调宫颈癌细胞FoxM1mRNA水平和蛋白表达水平,Hela、C33A和Siha细胞FoxMl mRNA分别下降92.29%,87.65%和95.82%;2细胞迁移试验显示3株细胞的平均OD值较对照组分别降低40.61%,49.65%和50.87%(P<0.05)。细胞侵袭试验显示3株细胞的平均穿膜细胞数较对照组分别降低86.67%,71.77%和72.48%(P<0.01)。结论:FoxM1基因表达下调可显著降低多株宫颈癌细胞侵袭和迁移能力,有可能成为有效的宫颈癌治疗靶点。     

RNAi沉默Polo-like kinase-1基因表达对大肠癌细胞端粒酶活性的影响

 目的 探讨polo-like kinase-1（PLK1）基因对大肠癌细胞增殖和端粒酶活性的影响。 方法根据PLK1基因序列特点,设计并用化学方法合成小干扰核糖核酸分子（small interfering RNA,siRNA）,转染人大肠癌SW480细胞后,分别采用实时定量PCR和Western blot检测PLK1基因mRNA和蛋白表达水平。分别采用MTT法和TRAP-ELISA方法检测PLK1基因转染对大肠癌细胞增殖和端粒酶活性的影响。 结果 所设计的5个siRNA均能明显抑制大肠癌SW480细胞PLK1 mRNA水平,以P4效果最好。以P4转染处理大肠癌细胞后,PLK1 mRNA水平和蛋白水平明显下调,且呈浓度和时间依赖性。MTT和TRAP-ELISA方法检测发现,P4siRNA转染组细胞增殖和端粒酶活性明显受到抑制,且呈浓度和时间依赖性（P＜0.05,P＜0.05）。 结论 PLK1基因对大肠癌细胞增殖具有重要的调控作用,以PLK1 siRNA转染处理大肠癌细胞,可明显抑制大肠癌细胞的恶性增殖,其机制可能与抑制端粒酶活性有关。     

促肝细胞再生磷酸酶-3基因对大肠癌细胞侵袭和失巢凋亡的调控

目的 探讨促肝细胞再生磷酸酶(phosphatase of regenerating liver cell-3,PRL-3)基因对大肠癌细胞侵袭的影响及可能机制.方法 应用PRL-3基因小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)转染处理人大肠癌HCT116细胞后,分别采用荧光实时定量RT-PCR和Western blot检测PRL-3 mRNA和蛋白水平,分别采用软琼脂集落培养试验和Boyden小室模型试验检测癌细胞的锚着不依赖性增殖和侵袭能力,采用琼脂糖凝胶电泳和TUNEL检测癌细胞失巢凋亡情况.结果 转染组癌细胞PRL-3 mRNA和蛋白水平明显被抑制,且与时间和浓度相关.与对照组比较,转染组细胞所形成的软琼脂集落数和穿膜细胞数明显减少,且呈时间和浓度依赖性.琼脂糖凝胶电泳和TUNEL结果显示,转染组细胞出现明显的凋亡现象:凋亡指数增加,出现明显的DNA条带.结论 PRL-3基因siRNA转染可明显抑制大肠癌细胞的锚着不依赖性增殖和恶性侵袭,其机制可能与诱导失巢凋亡有关.     

siRNA沉默Wip1基因对人肺腺癌细胞的影响

目的向肺腺癌A549细胞中导入靶向Wip1的siRNA,研究其对肺腺癌细胞生物学活性的影响。方法设计并合成Wip1基因特异性的siRNA,通过脂质体介导将siRNA瞬时转染肺腺癌A549细胞,用荧光定量PCR检测转染后细胞内Wip1基因的表达水平,流式细胞学检测A549细胞凋亡、增殖以及用划痕实验和Transwell实验检测细胞迁徙的情况。结果特异转染组中Wip1 mRNA表达明显降低,并且处于G1期细胞比例增加,S期细胞比例降低,侵袭细胞数及迁移率均明显低于非特异转染组,细胞凋亡未见差异性改变。结论靶向Wip1基因的siRNA能有效降低目的基因mRNA的表达水平,抑制A549细胞的生长并引起细胞侵袭力及迁移力下降。     

RNAi沉默ERCC1基因对肺腺癌细胞顺铂敏感性的影响

目的 目的用包含切除修复交叉互补(ERCC1)基因特异RNA序列的慢病毒,将其转染入宣威肺腺癌细胞XWCL05中,沉默ERCC1基因表达,初步探讨其基因沉默效果及对顺铂敏感性的影响,为顺铂耐药逆转提供思路和依据.方法 经293T细胞包装后构建ERCC1基因RNAi的慢病毒载体及阴性对照,分别使用XWCL05空白组(空白对照)、XWCL05-neg组(转染空载体)、XWCL05-RNAi组(转染ERCC1-RNAi慢病毒).Western blot法检测转染前后XWCL05细胞中ERCC1蛋白的表达.12.5 μg/mL顺铂作用48 h后,用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测顺铂对各组XWCL05细胞增殖抑制率的影响;流式细胞术检测各组中XWCL05细胞的凋亡率.结果 (1) Western blot结果显示,XWCL05-RNAi组中ERCC1蛋白表达水平显著低于XWCL05-neg组(P＜0.05),而XWCL05-neg和XWCL05空白组差异无统计学意义(P＞0.05).(2)MTT法检测显杀相同浓度顺铂作用下,XWCL05-RNAi组的增殖抑制率显著高于XWCL05-neg组和XWCL05空白组(P＜0.05),而XWCL05-neg组.(3)流式细胞术检测结果显示,XWCL05-RNAi组凋亡率显著高于XWCL05-neg组和XWCL05空白组(P＜0.05).而顺铂作用后,各组凋亡率较前均显著升高(P＜0.05),且XWCL05-RNAi组凋亡率显著高于其余两组.结论 ERCC1基因RNAi的慢病毒能够有效地沉默宣威肺腺癌细胞XWCL05中ERCC1基因的表达,并增强XWCL05对顺铂的敏感性.     

细胞黏附分子L1基因沉默对胰腺癌细胞Capan-2神经侵袭能力的影响

目的 观察沉默细胞黏附分子L1基因(L1CAM)表达后对胰腺癌Capan-2细胞体外神经侵袭能力的影响.方法 应用慢病毒介导的L1CAM-shRNA干扰载体转染胰腺癌Capan-2细胞,以L1CAM-NC转染细胞为对照.分别将L1CAM-shRNA组及L1CAM-NC组细胞与大鼠背根神经节(DRG)、基质胶(matrigel)一起构成共培养神经侵袭模型,倒置显微镜下观察神经突及细胞生长情况并拍照,利用Image pro plus图像分析软件对照片进行分析.结果 共培养模型中,L1CAM-NC对照组细胞向DRG方向不断迁移增殖,包绕神经突起并沿之向DRG爬行,而L1CAM-shRNA组中并未观察到该现象.共培养第3天和第5天时,L1CAM-NC对照组细胞集落面积显著高于L1CAM-shRNA组(P＜0.01),但两组的神经突生长差异无统计学意义.结论 干扰L1CAM的表达可能通过抑制细胞集落形成及迁移爬行的方式抑制胰腺癌Capan-2细胞的神经侵袭作用.     

慢病毒介导shRNA特异性沉默促肝细胞再生磷酸酶1基因表达抑制舌癌细胞迁移侵袭能力

目的：探讨特异性沉默促肝细胞再生磷酸酶1（phosphatase of regenerating liver cell-1,PRL-1）基因表达对舌癌细胞迁移、侵袭能力的影响。方法：设计、合成5条针对PRL-1基因的短发夹RNA（short hairpin RNA,shRNA）干扰序列,构建于慢病毒载体质粒中,PCR电泳及基因测序验证。转染293T细胞,Western blot筛选最佳干扰序列,包装产生慢病毒。转染TCA8113细胞,筛选、建立稳定转染细胞株;real-time PCR检测PRL-1基因沉默效率;划痕实验和Transwell实验分别比较慢病毒转染细胞（KD组）、空病毒转染细胞（NC组）及TCA8113细胞（CON组）迁移、侵袭能力变化。结果：PCR电泳及基因测序证实5条shRNA序列定向插入慢病毒载体质粒中。Western blot筛选出PRL-1-shRNA-1基因沉默效率最高,包装获得慢病毒滴度为 7×108 TU/ml。通过转染、筛选,建立了TCA8113细胞稳定转染细胞株;real-time PCR测得PRL-1基因mRNA表达明显下降（F=809.120,P=0.000）;PRL-1基因沉默后细胞迁移能力降低,穿过人工基底膜的细胞数KD组（25.5±0.4）明显少于NC组（81.5±2.0）和CON组（88.5±2.3）（F=1 092.970,P=0.000）。结论：沉默PRL-1基因表达能有效抑制舌癌细胞迁移、侵袭能力。     

Wnt5a表达沉默抑制肺鳞癌细胞SK-MES-1迁移及侵袭

目的:探讨抑制肺鳞癌细胞中Wnt5a表达对细胞增殖、迁移和侵袭等生物学特性的影响.方法:构建表达针对Wnt5a的siRNA的重组质粒pH1-siRNAWnt5a-,转染肺鳞癌细胞SK-MES-1后筛选建立稳定表达细胞株.通过MTT、细胞周期以及Transwell检测.观察抑制Wnt5a表达对癌细胞增殖、迁移和侵袭能力的变化.结果:Western印迹测定表明肺鳞癌细胞SK-MES-1Wnt5a-低表达Wnt5a蛋白(13.6%).转基因细胞增殖指数略低于对照细胞株[(283±3.8)%V5(30.5±5.2)%].转基因细胞的相对迁移率和侵袭率分别为对照组的(47.3±9.2)%和(39.7±11.7)%.结论:Wnt5a低表达显著抑制肺鳞癌细胞SK-MES-1的迁移和侵袭能力.Wnt5a可能是肺鳞癌基因治疗的潜在靶标.     

RNA干扰假基因Cripto-3表达对大肠癌细胞增殖和侵袭的影响

目的：探讨RNA干扰下调假基因Cripto-3（Cr-3）对人大肠癌细胞SW480增殖和侵袭的影响。方法：将大肠癌细胞随机分为5组：空白对照组,空载对照组,siRNA转染组（5 nmol/L组、10 nmol/L和20 nmol/L组）。将Cr-3小干扰RNA（small interfering RNA,siRNA）转染人大肠癌SW480细胞后,采用实时荧光定量PCR检测Cr-3表达水平;分别采用平板克隆形成实验和Transwell法检测大肠癌细胞的增殖和侵袭能力。结果：与空白对照组和空载对照组比较,siRNA转染组Cr-3表达水平均明显下降,且呈浓度依赖性（P〈0.05）,癌细胞克隆形成和穿过滤膜的细胞均明显减少,且与浓度相关（P〈0.05）。结论：假基因Cr-3在大肠癌细胞增殖侵袭中起着重要的作用,可能是大肠癌诊疗中的一个重要靶点。     

沉默Yes相关蛋白1对人非小细胞肺癌细胞增殖和侵袭的影响

目的 研究Yes相关蛋白1(YAP1)在非小细胞肺癌细胞增殖、细胞周期、迁移、侵袭中的作用.方法 通过慢病毒介导的小干扰RNA靶向抑制人非小细胞肺癌细胞株A549中YAP1基因的表达,采用CCK-8法、流式细胞术分别检测沉默YAP1对A549细胞增殖及凋亡周期的影响,Transwell实验观察沉默YAP1对A549细胞迁移、侵袭能力的影响.结果 沉默YAP1后,A549细胞YAP1 mRNA和蛋白表达均下调(P＜0.01),CCK-8实验结果显示沉默YAP1抑制A549的增殖、增加G0/G期的细胞比例(P＜0.01),Transwell实验结果示沉默YAP1抑制A549细胞的迁移、侵袭(P＜0.01).结论 沉默YAP1基因对非小细胞肺癌细胞的恶性生物学特征具有抑制作用,YAP1可能成为肺癌治疗的潜在靶标.     

靶向cripto siRNA转染对裸鼠实验性大肠癌细胞肝转移的影响

 目的 研究cripto基因对人大肠癌细胞迁移、侵袭和肝转移的影响。方法 以cripto基因mRNA小干扰RNA（small interfering RNA,siRNA）转染人大肠癌SW480细胞后,分别采用荧光实时定量RT-PCR和Western blot检测cripto基因mRNA和蛋白水平,以划痕试验方法评测癌细胞迁移能力;用Boyden模型观察癌细胞侵袭能力。以脾切除法建立裸鼠大肠癌肝转移模型,以cripto siRNA转染48 h后的癌细胞接种裸鼠,观察对大肠癌细胞体内肝转移的影响。结果 siRNA转染组cripto基因mRNA水平明显降低,且呈浓度和时间依赖性（P<0.001,P<0.001）。体外实验发现,cripto siRNA转染组癌细胞迁移距离和穿膜细胞数目明显低于对照组,且呈浓度依赖性（P<0.05）。体内实验发现,cripto基因siRNA转染组SW480细胞转移率和肿瘤结节数均明显低于对照组（P<0.05,P<0.05）。结论 cripto基因在大肠癌肝转移中起着重要的作用;以siRNA下调cripto基因表达,可抑制大肠癌细胞肝转移。     

RNAi沉默中期因子基因表达对胃癌细胞黏附和侵袭力的影响

目的:探讨中期因子(midkine,MK)基因小干扰RNA对胃癌细胞生物学行为的影响.方法:培养人胃癌BGC-823、HGC-27、MGC-803及SGC-7901细胞株,以荧光实时定量PCR方法检测中期因子基因mRNA表达;筛选出中期因子表达最高者.采用中期因子基因小干扰RNA转染胃癌细胞株,分别以荧光实时定量PCR和免疫荧光方法观察中期因子基因mRNA和蛋白水平,然后以四唑蓝(MTT)比色法检测细胞黏附性,以Boyden方法检测癌细胞侵袭力.结果:4株胃癌细胞中,中期因子均有不同程度的表达,以胃癌BGC-823细胞最高;以MK siRNA转染胃癌BGC-823细胞后,癌细胞中期因子基因mRNA和蛋白水平明显下降,且呈浓度依赖性;转染组细胞黏附数量明显下降,细胞侵袭力明显下降.结论:中期因子基因在胃癌细胞黏附和侵袭中发挥着重要作用;以siRNA转染胃癌细胞,可抑制胃癌细胞黏附和侵袭能力.     

Phosphatases of regenerating liver: a novel target in human solid tumors

Protein tyrosine phosphorylation is a major posttranslational modification used by cells to regulate signal transduction and essentially participate in every aspect of cellular physiologic and pathogenic processes. The protein tyrosine phosphatase （PTP） super family of enzymes coordinately function with protein tyrosine kinases in signaling pathways that underlie a broad spectrum of fundamental physiological processes. Abnormal regulation of tyrosine phosphorylation or deregulation of phosphorylation is known to result in neoplastic or non-neoplastic diseases. Having evolved into separate families that are structurally and mechanistically distinct, PTPs have been implicated in a variety of diseases and efforts have been made to seek therapeutic clues from them. The phosphatases of regenerating liver （PRL） PRL-1, PRL-2, PRL-3 （also known as PTP4A1, PTP4A2, and PTP4A3, respectively） constitute a subfamily of the protein tyrosine phosphatases that have been suggested to play a key role in oncogenic and metastatic phenotypes.5 Here we review what is known about this novel class of small, prenylated phosphatases and its value in diagnosis and therapy of solid tumors.     

Vav3 在小细胞肺癌组织中的表达及 对细胞迁移和侵袭能力的影响

目的 探讨Vav3 在小细胞肺癌（SCLC）组织中的表达及对细胞迁移和侵袭能力的影响。方法 选 取SCLC 患者87 例及同期因肺外伤行手术治疗的正常肺组织50 例作为对照组,免疫组织化学（免疫组化）检 测SCLC 和对照组组织中Vav3 蛋白的表达,培养人小细胞肺癌H446 细胞并分为siRNA-Vav3 组、siRNA- 对 照序列组和空白组,实时荧光定量PCR 技术检测各组细胞中Vav 3 基因表达,划痕实验检测各组细胞迁移能 力,Transwell 法检测各组细胞迁移和侵袭能力。结果 SCLC 组织中Vav3 蛋白阳性表达率为81.6%,高于对照 组的14.0%（χ2=17.739,P =0.000）;SCLC 组织中Vav3 蛋白表达与临床分期、远处转移和生存状态有关（P = 0.024、0.016 和0.014）;Vav3 蛋白阳性表达组患者平均生存时间23.14 个月,而阴性表达组则为44.89 个月,差 异有统计学意义（χ2=6.280,P =0.012）;siRNA-Vav3 组细胞中Vav3 mRNA 相对表达量低于siRNA- 对照序列 组和空白组（P=0.000）;siRNA-Vav3 组细胞24 h 后划痕愈合率低于siRNA- 对照序列组和空白组,siRNAVav3 组迁移细胞数低于siRNA- 对照序列组和空白组（P =0.000）;siRNA-Vav3 组侵袭细胞数低于siRNA- 对 照序列组和空白组（P =0.000）。结论 Vav3 蛋白在SCLC 组织中呈高表达,且与患者预后相关,特异性沉默 SCLC 细胞中Vav3 基因可抑制细胞迁移和侵袭能力。     

小干扰RNA抑制HMGB1表达对子宫内膜癌细胞侵袭与迁移的影响

目的：探讨靶向HMGB1的shRNA对HMGB1表达改变的影响及其与子宫内膜癌细胞侵袭与迁移力改变的关系。方法：运用RNA干扰技术,构建HMGB1短发夹RNA(pshRNA-1 /HMGB1,pshRNA-2 /HMGB1,pshRNA-3/HMGB1),同时设置转染非特异性质粒的阴性对照组 (HMGB1/p-NC) 和脂质体转染组 (Lipo组) ,用脂质体法转染人子宫内膜癌细胞(HEC-1A),利用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和Western印迹法检测转染后48 h各组细胞HMGB1在 mRNA和蛋白水平的表达,Transwell小室法观察转染HMGB1 shRNA后HEC-1A细胞的侵袭情况,细胞划痕实验观察转染HMGB1 shRNA后HEC-1A细胞的迁移情况。结果：RT-PCR显示：3组重组质粒HMGB1-pshRNAs转染后,HMGB1 mRNA相对表达水平分别是0.192±0.006,0.055±0.002和0.123±0.086,较Lipo组(0.268±0.008)和HMGB1/p-NC组(0.270±0.004)明显减少(P<0.05),最大抑制率分别达28.4%,79.5%和54.1%。Western印迹显示：HMGB1蛋白相对表达水平分别是0.259±0.129,0.032±0.002和0.104±0.007,较Lipo组(0.347±0.007)和HMGB1/p-NC组(0.349±0.007)明显减少(P<0.05),最大抑制率分别达25.4%,90.8%和70.0%。实验组在接种后48 h,穿过Transwell小室膜的细胞数显著少于HMGB1/p-NC组和Lipo组(P<0.05)。划痕愈合实验亦显示实验组划痕愈合率明显低于HMGB1/p-NC组和Lipo组(P<0.05)。结论：靶向干扰HMGB1的shRNA可以抑制HMGB1的表达,转染后的子宫内膜癌细胞侵袭与迁移能力明显
下降。