新疆细粒棘球蚴95基因的克隆及同源性分析

目的：分析新疆地区细粒棘球蚴95（EG95）基因结构特点。方法：从新疆地区细粒棘球蚴原头节中提取基因组DNA，以细粒棘球蚴原头节DNA为模板进行PCR扩增，获得EG95基因，将其克隆至pUCm-T载体，利用DNAman软件及GeneBank/BLAST功能测序并进行基因全序列分析。结果：测序显示新疆株EG95(EG95-XJ)基因片段为1191bp。BLAST比对分析表明EG95-XJ基因与新西兰株EG95基因家族成员同源性达86％-97％，所有的碱基差异均发生于内含子区域。结论：中国新疆地区的EG95基因为EG95基因家族成员之一，但其序列与新西兰株EG95基因之间存在一定的差异。     

新疆细粒棘球蚴95基因的克隆及同源性分析

目的　分析新疆地区细粒棘球蚴 95 (EG95 )基因结构特点。　方法　从新疆地区细粒棘球蚴原头节中提取基因组 DNA,以细粒棘球蚴原头节 DNA为模板进行 PCR扩增 ,获得 EG95基因 ,将其克隆至 p UCm- T载体 ,利用 DNAman软件及 Gene Bank/BL AST功能测序并对其进行基因全序列分析。　结果　测序显示新疆株 EG95 (EG95 - XJ)基因片段为 1191bp。 BL AST比对分析表明 EG95 - XJ基因与新西兰株 EG95基因家族成员同源性达 86 %～ 97% ,所有的碱基差异均发生于内含子区域。　结论　中国新疆地区的 EG95基因为 EG95基因家族成员之一 ,但其序列与新西兰株 EG95基因之间存在一定的差异。     

新疆株细粒棘球绦虫不同发育阶段95抗原基因克隆及序列分析

目的研究细粒棘球绦虫95抗原(Eg95)基因在新疆株细粒棘球绦虫不同发育阶段的表达及其基因序列差异。方法根据Eg95基因序列设计引物,用PCR方法分别从新疆株细粒棘球绦虫3个不同发育阶段(原头蚴、六钩蚴和成虫)所构建的cDNA文库中克隆获得Eg95目的基因,将其克隆至pUCm-T载体、测序并进行序列分析。结果从3个不同发育阶段的新疆株细粒棘球绦虫cDNA文库中均克隆出Eg95基因,其基因片段长度为402bp,同源性比对分析(BLAST)结果表明,所克隆的新疆株Eg95基因与GenBank中的Eg95基因序列一致。结论Eg95基因在新疆株细粒棘球绦虫不同发育阶段均有表达,其基因序列无差异。     

细粒棘球绦虫egG1Y162抗原基因的克隆及序列分析

根据多房棘球绦虫emY162基因序列设计引物,利用PCR以细粒棘球绦虫原头蚴和成虫的基因组DNA和cDNA为模板扩增egG1Y162基因,构建PUCm-T/egG1Y162和PUCm-T/egG1Y162 cDNA重组质粒,经PCR、酶切及测序后,进行序列分析。细粒棘球绦虫2个不同发育阶段均克隆出egG1Y162基因,从基因组DNA和cDNA克隆得到的片段长度分别为1 680 bp和459 bp,登录号分别为AB458258和AB458259。     

细粒棘球蚴egG1Y162抗原基因的克隆及蛋白质序列分析

目的克隆细粒棘球蚴egG1Y162基因序列并进行蛋白序列对比分析。方法从细粒棘球蚴原头蚴提取mRNA,mRNA反转录为cDNA。设计特异引物,以cDNA为模板扩增egG1Y162基因,构建PUCm-T/egG1Y162重组质粒,经PCR、酶切及测序鉴定后进行序列分析。结果egG1Y162 cDNA为459bp,编码153个氨基酸;同源性比较表明,egG1Y162 cDNA与emY162同源性为95%,与eg95的同源性为30.61%。结论成功克隆egG1Y162抗原基因,egG1Y162蛋白质氨基酸序列与emY162有很高的相似性,但同其他抗原蛋白质序列存在明显差异,所以egG1Y162是一种新的抗原基因。     

基于游离DNA的棘球蚴病诊断标志物的筛选和应用初探

目的筛选棘球蚴病(包虫病)潜在诊断标志物的游离DNA(cell-free DNA,cfDNA)序列,并初步探讨其诊断价值。方法从西藏自治区采集确诊细粒棘球蚴病患者外周血,分离血浆,提取cfDNA并重测序;对测序数据进行生物信息学分析,并与人参考基因组和细粒棘球绦虫基因组综合比对,筛选诊断标志物候选序列;分别以细粒棘球蚴病患者和健康人血浆cfDNA为模板,采用qPCR分析诊断标志物候选序列的特异性和敏感性。结果共采集6份细粒棘球蚴病患者血浆,提取的血浆cfDNA条带较为均一,主要集中于150～200 bp;经重测序和序列比对获得一组候选序列,qPCR分析后初步筛选出一条101碱基的序列,用其检测8例细粒棘球蚴病患者血浆cfDNA,其中5例阳性,敏感性为62.5%;检测健康人血浆的特异性为87.5%(7/8)。结论细粒棘球蚴病患者血浆中存在虫源cfDNA,该序列具有作为诊断标志物的潜在价值。     

细粒棘球蚴(Echinococcus granulosus)CO1与ND1基因序列分析

目的 为了明确内蒙古锡林郭勒盟西乌旗羊株和锡林浩特市人株细粒棘球蚴之间的基因型及其遗传变异情况。方法 利用分子生物学技术对采自两地区细粒棘球蚴的线粒体CO1基因与ND1基因进行了克隆和测序,并运用DNAStar5.0中的MegAlign工具对已测出的序列进行了分析。结果 西乌旗羊株细粒棘球蚴与锡林浩特市人株细粒棘球蚴CO1基因片段和ND1基因片段大小分别均为936 bp和895 bp。西乌旗羊株细粒棘球蚴CO1基因序列与新疆羊株细粒棘球蚴的CO1基因序列同源性为99.3%;锡林浩特市人株细粒棘球蚴CO1基因序列与新疆人株细粒棘球蚴的CO1基因序列同源性为98.6%;且西乌旗羊株和锡林浩特市人株细粒棘球蚴ND1基因与国内外已报道的G1型ND1基因序列完全相同。结论 表明内蒙古上述两地区细粒棘球蚴的同源性很高,且基因型均为G1型,这为内蒙古某些地区细粒棘球蚴流行虫株的确定提供了重要依据,同时也对当地细粒棘球蚴病的预防和控制具有重要意义。     

细粒棘球绦虫原头蚴发育调控基因Ral基因的克隆及序列分析

目的克隆和分析细粒棘球绦虫原头蚴发育调控基因Eg Ral基因。方法根据多房棘球绦虫Em Ral基因序列设计引物,用RT-PCR方法从细粒棘球绦虫原头蚴中克隆Eg Ral基因并将其克隆至pMD19-T载体,经测序后,与线虫、多房棘球绦虫、果蝇和人类等物种Ral基因进行比对分析。结果从细粒棘球绦虫原头蚴cDNA中克隆获得Eg Ral基因,长度为603 bp,编码200个氨基酸,等电点为8.85。经比对,Eg Ral与Em Ral同源性为99%,与线虫、果蝇和人等其他种类Ral基因同源性在47.89%～50.72%之间。进化树分析表明Eg Ral与Em Ral相聚集,与其他物种同源性较低。结论成功从细粒棘球绦虫原头蚴中克隆出Eg Ral基因,其序列具有较高的保守性。     

PCR与DNA杂交技术在细粒棘球蚴诊断方面的实验研究

目的探讨聚合酶链反应(PCR)技术在细粒棘球蚴检测和诊断中的应用,建立DIG标记DNA杂交诊断技术.方法根据细粒棘球蚴基因片段克隆与序列分析,设计了一对特异性引物,P1 5'-GGAATGGAGAGAAGTTAC-3' P2 5'-GCAACCTCCGGAACTTGC-3'.以棘球蚴的囊液、子囊及原头蚴为模板,经PCR扩增获得471 bp特异性区带.将扩增产物纯化后,用DIG标记DNA,将制备成的特异性核酸探针用于细粒棘球蚴检测.结果经对大肠杆菌、粪肠杆菌、结核分支杆菌、猪囊尾蚴、健康人白细胞进行PCR扩增和DIG标记DNA探针斑点杂交,只有细粒棘球蚴出现单一471 bp特异性区带. PCR的灵敏性为检出单个原头蚴及100～10 fg水平的DNA,而斑点杂交的敏感性为2 500 fg.异源性DNA即使提高点膜量,亦不出现阳性反应.结论配以DIG标记的PCR技术在细粒棘球蚴的检测中具有特异、敏感、快速、准确的特点.为包虫病的早期诊断和流行病学调查提供了科学依据.     

多房棘球蚴线粒体NADH脱氢酶1基因分析及PCR检测方法

目的 扩增多房棘球蚴线粒体NADH脱氢酶亚基1(NADH dehydrogenase subunit1,ND1)基因全序列,测序并进行同源性比较.建立检测多房棘球蚴感染的PCR方法,应用于人和动物感染多房棘球蚴的快速检测和鉴定.方法 根据多房棘球绦虫线粒体DNA全序列,设计引物扩增ND1基因并进行测序,获得多房棘球蚴ND1基因全序列.对该序列与其它常见棘球绦虫的ND1基因序列进行同源性分析.结果 多房棘球蚴线粒体ND1基因序列与国外报告的多房棘球绦虫的同源性达到98.8％,与细粒棘球绦虫的同源性为86.2％,与少节棘球绦虫的同源性为84.6％,与伏氏棘球绦虫的同源性为87.0％.结论 多房棘球蚴线粒体ND1基因与其他棘球绦虫相应基因存在显著差异.PCR方法可以用于多房棘球蚴感染的快速检测和鉴定.     

Short report: Echinococcus granulosus from Xinjiang,PR China: cDNAS encoding the EG95 vaccine antigen are expressed in different life cycle stages and are conserved in the oncosphere

The EG95-based vaccine protects sheep from infection with the dog tapeworm Echinococcus granulosus. The EG95 encoding gene is a member of a multigene family, several members of which are expressed in the oncosphere, believed to be the target of immunity induced by the vaccine. E. granulosus exhibits extensive intraspecific (strain) variation, and variability of the eg95 gene in different isolates of E. granulosus may directly impact the effectiveness of the EG95-based vaccine. We analyzed the eg95 gene from E. granulosus collected in Xinjiang, in northwest China, where hydatid disease is hyperendemic. The gene is expressed in oncospheres, protoscoleces, and immature and mature adult worms, and the eg95 gene family was shown to comprise two basic sequence types. Very limited sequence variation was evident in the EG95 protein from oncospheres. This high degree of sequence conservation predicts that the vaccine will continue to be effective in China and elsewhere.     

细粒棘球蚴线粒体CO1基因的克隆与序列分析

目的 研究细粒棘球蚴(Echinococcus granulasus)种间遗传标记特点,为该虫种的分子分类学研究提供基础。方法 在内蒙古地区从羊肝脏采集细粒棘球蚴,肝包虫病患者手术剥离囊包后,签署知情同意书,采集细粒棘球蚴。提取虫体DNA,扩增线粒体细胞色素氧化酶1(CO1)基因,将其克隆到PGM-T载体后,用PCR技术鉴定阳性菌落,并进行测序,运用DNAstar5.0 软件计算序列间的相似性,计算遗传距离,同时,应用MEGA4.0软件的最大似然法(ML-Maximum Likelihood)和邻接法(NJ-Neighbor Joining)构建系统发育树,进行聚类分析。结果 细粒棘球蚴DNA扩增出的羊株、人株CO1基因序列片段长度为936 bp。同其他亲缘关系较近的属CO1基因序列比对:羊株、人株细粒棘球蚴CO1序列与黄花棘球绦虫的同源性最高,分别为91.9%、91.2%;羊株、人株细粒棘球蚴CO1序列与黄花棘球绦虫位于同一分支,自展值(Boostrap)最高,均为100%。羊株、人株细粒棘球蚴CO1序列所属分支与原头目的Proteocephalus macrocephalus所属分支相隔较远。结论 CO1基因序列稳定保守,无宿主特异性,可作为细粒棘球蚴理想的种间遗传标记。     

细粒棘球绦虫转基因植物载体重组pBI-Eg95质粒构建及鉴定

目的 构建并鉴定细粒棘球绦虫(Eg)转基因植物载体重组pBI-Eg95质粒.方法 从细粒棘球蚴包囊中分离原头节.经超声粉碎后抽提总RNA,反转录成eDNA,设计合成引物,以eDNA为模板.通过PCR从cDNA中扩增出目的 基因Eg95,经电泳及测序鉴定后,将该基因定向克隆到植物表达载体pBI121中构建pBI-Eg95重组质粒,电穿孔转化根癌农杆菌(At)LBA4404株;从转化的At阳性株中抽提质粒进行双酶切和以抽提的质粒为模板进行PCR鉴定.结果 RT-PCR扩增出1条约471 bp的特异性条带,DNA序列分析与GenBank知的序列同源性为100%.从转化的At中抽提的质粒,双酶切及PCR测定的结果与预期相符.结论 成功构建了细粒棘球绦虫转基因植物载体重组pBI-Eg95质粒,为进一步构建细粒棘球绦虫转基因植物疫苗奠定了基础.     

细粒棘球蚴线粒体nad1基因的克隆与序列分析

目的 为完善细粒棘球蚴(Echinococcus granulasus)的分子分类学体系,提供更优化的种间和种内遗传标记基因。方法 在内蒙古地区采集患羊肝脏细粒棘球蚴和肝包虫病患者棘球蚴。采用提取虫体DNA的方法,扩增线粒体NADH脱氢酶1(nad1)基因并进行测序,运用DNAstar5.0软件构建系统发育树并采用MEGA4.0软件进行自居检验。结果 细粒棘球蚴DNA 扩增出的羊株、人株nad1基因序列片段长度为895 bp。羊株、人株细粒棘球蚴nad1序列与加拿大棘球绦虫的同源性最高,相似性为86.5%;羊株、人株细粒棘球蚴nad1序列与加拿大棘球绦虫位于同一分支,自展值(Boostrap)最高,为100%。羊株、人株细粒棘球蚴nad1序列所属分支与裂头目、裂头科Diplogonoporus balaenopterae所属分支相隔最远。结论 nad1基因有较高保守性,同时也存在种间差异,可广泛应用于研究细粒棘球绦虫的种间和种内遗传变异。     

Antigenic differences between the EG95‐related proteins from Echinococcus granulosus G1 and G6 genotypes: implications for vaccination

Cystic echinococcosis caused by Echinococcus granulosus remains an important and neglected issue in public health. The study of the likely efficacy of the currently available EG95 vaccine against other genotypes of the parasite is important to improve the vaccine as a potential tool to be used in control programmes. The recombinant vaccine EG95‐1G1 was developed based on the G1 genotype of E. granulosus. Characterization of the eg95 gene family in the G6 genotype by genomic DNA cloning previously produced the first unequivocal information about the composition of the gene family in a different genotype. The information was used in this study to predict and express two EG95‐related proteins from the G6 genotype as recombinants, for assessment of their capacity to bind antibodies raised in sheep vaccinated with the EG95‐1G1 vaccine. The proteins (EG95‐1G6 and EG95‐5G6) from the G6 genotype of E. granulosus were unable to bind all the antibodies raised by sheep vaccinated with EG95‐1G1. Differences in the amino acid sequence of EG95‐related proteins from G6 and likely the differences in the encoded FnIII domain may be responsible for changes in the conformation of these epitopes.     

细粒棘球绦虫重组Bb-Eg95疫苗的构建及鉴定

目的 构建和鉴定细粒棘球绦虫(Eg)重组双歧杆菌(rBb)-Eg95疫苗.方法 自行设计引物,从细粒棘球蚴包囊中分离原头节,超声粉碎后提取总RNA为模板,通过RT-PCR扩增获得Eg95抗原编码基因,采用BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切,定向克隆到大肠埃希菌-双歧杆菌(E.coli-Bb)穿梭表达载体pGEX-1λT中,转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞,构建重组质粒pGEX-Eg95.抽提质粒进行双酶切鉴定后,电穿孔转化到Bb中,构建细粒棘球绦虫rBb-Eg95疫苗,抽提质粒进行PCR扩增鉴定.结果 RT-PCR扩增出471 bp的Eg95抗原编码基因;重组质粒用双酶切鉴定可切出4947 bp的载体片段和471 bp的目的 基因片段:以具有氨苄青霉素抗性的rBb中抽提的质粒为模板进行PCR扩增可得到471 bp的Eg95基因片段.结论 成功构建了细粒棘球绦虫rBb-Eg95疫苗,为该疫苗的开发利用奠定了理论基础.     

细粒棘球绦虫转Eg95基因苜蓿疫苗的培育及鉴定

目的 培育并鉴定细粒棘球绦虫转Eg95基因苜蓿疫苗.方法 利用转pBI-Eg95质粒的根癌农杆菌LBA4404株介导的苜蓿子叶浸染法,将Eg95基因导人紫花苜蓿基因组,转Eg95基因苜蓿外植体在含有卡那霉素的选择培养基上经愈伤、出芽和生根阶段生长出小苗,最后移栽到装有营养土的花盆中,生长2～3个月,获得完整的转Eg95基因苜蓿疫苗.提取转Eg95基因苜蓿的DNA、RNA及叶蛋白,采用PCR、RT-PCR、十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)及Western blot法进行鉴定.结果 PCR、RT-PCR法在471 bp处均扩增出目的条带;SDS-PAGE及Western blot法可见转Eg95基因苜蓿蛋白在相对分子质量约16.5×103处出现特异条带,与预期结果相符;Bio-Rad Quantity one系统分析表达效率约占提取总苜蓿叶蛋白的0.06%.结论 成功培育出细粒棘球绦虫转Eg95基因苜蓿疫苗.     

细粒棘球绦虫重组BCG-Eg95疫苗构建及鉴定

目的构建细粒棘球绦虫重组BCG-Eg95疫苗并鉴定。方法从包囊中分离原头节,超声粉碎后抽提总RNA为模板,采用RT-PCR方法扩增Eg95编码基因并鉴定。将该基因片段定向克隆到大肠杆菌-分枝杆菌穿梭表达载体pBCG中构建pBCG-Eg95重组质粒。用电穿孔法将重组质粒导入BCG菌构建rBCG-Eg95疫苗,用HgCl2筛选经PCR鉴定。结果经电泳及测序证实从原头节扩增出471bp Eg95蛋白编码基因。重组质粒pBCG-Eg95经酶切及PCR证实,并经PCR鉴定已成功转入BCG。结论成功构建细粒棘球绦虫重组BCG-Eg95疫苗,为rBCG-Eg95疫苗进一步研究奠定基础。     

细粒棘球绦虫基因库的构建

细粒棘球绦虫DNA经Sau3AI部分水解,并用电洗脱方法从琼脂糖凝胶中回收15-23kb大小的片段。得到的片段与λ噬菌体置换载体EMBL3 DNA重组,采用体外包装系统构建了细粒棘球绦虫的基因库,获得了1.2×10~6个重组子。通过与探针的分子杂交,从库中分离到6个细粒棘球绦虫γDNA基因的阳性克隆。