慢性粒细胞白血病患者外周血单个核细胞诱生树突细胞的体外研究

目的 :体外诱生慢性粒细胞白血病 ( CML)患者外周血单个核细胞 ( PBMNCs)为树突细胞( DCs)。方法 :CML患者 PBMNCs在含 GM- CSF、IL- 4、TNF- α的培养液中培养 1 4d,倒置显微镜、电镜下观察细胞形态 ,流式细胞仪检测细胞的表面标志 ,免疫磁珠 ( MACS)富集所诱生的 DCs,用D- FISH、RT- PCR方法检测 DCs的白血病源性。利用 MTT法检测所诱生 DCs刺激 T细胞增殖能力。结果 :所诱生的细胞高表达 CD80 、CD86、CD1a、HLA- DR,电镜下细胞表面有丰富突起 ,细胞浆内有丰富线粒体 ,D- FISH、RT- PCR检测所诱生的 DCs具有 bcr/abl融合基因。CML DCs具有刺激 T细胞增殖能力。结论 :体外利用 CML患者 PBMNCs成功诱导生成了来源于 CML细胞的 DCs( CML DCs)。     

当归多糖促进慢性粒细胞白血病细胞性树突状细胞的诱导生成

目的 探讨当归多糖(APS)对慢性粒细胞白血病细胞诱导生成树突状细胞(DCs)的影响。方法 取慢性粒细胞白血病(CML)患者骨髓单个核细胞，分别予粒-巨噬集落刺激因子(GM—CSF)／白介素-4(IL-4)培养或GM-CSF／IL-4联合各浓度APS(50，100，200mg／L)培养，普通光镜和电镜观察细胞形态，台盼蓝拒染法检测细胞成活率，流式细胞仪检测DCs的免疫表型(CD80，CD86，CD83)，自体或异体混合淋巴细胞反应检测DCs刺激T淋巴细胞的增殖能力。结果GM-GSF/TL-4或GM-CSF，IL-4／APS诱导培养的慢性粒细胞白血病骨髓单个核细胞均表现出典型的树突状形态而且表达高水平的免疫表型。GM-CSF／IL-4／APS培养的DCs的细胞成活率和增殖能力显著提高，CD83，CD80，CD86表达显著升高，APS组慢性粒细胞白血病细胞诱导的树突状细胞(CML-DCs)刺激T淋巴细胞的增殖能力更强。结论 GM-CSF/IL-4/APS培养的DCs的CD83，CD80、CD86表达率明显高于GM-CSF／IL-4组。GM-CSF／IL-4／APS诱生的CML-DCs刺激T淋巴细胞增殖能力强于GM-CSF／IL-4组。APS能促进IL-4和GM-CSF对CML-DCs的诱生与成熟。     

小鼠骨髓来源树突状细胞培养鉴定和诱导T淋巴细胞增殖

目的:建立一种体外诱导培养小鼠树突状细胞(DCs)的方法,并观察其不同生长阶段生物学形态及刺激淋巴细胞增殖的能力。方法:联合应用粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白细胞介素-4(IL-4)诱导培养小鼠骨髓单个核细胞向DCs分化,并从形态学、表型及功能方面对其加以检测。结果:用GM-CSF和IL-4诱导培养小鼠骨髓来源的单核细胞,3 d后可见细胞形态改变,并呈集簇生长,培养至5 d可见典型的树突状突起,体外诱导培养8 d后获得大量成熟的DCs,扫描电镜可见典型的树突状细胞形态,高表达骨髓来源DCs特异性标记CD11c和共刺激分子CD40、CD80、CD86和MHC-Ⅱ,成熟DC具有很强的刺激同基因型和同种异基因型T淋巴细胞增殖的能力。结论:小鼠骨髓来源的单个核细胞体外诱导培养可生成大量成熟的DCs,为进一步抗肿瘤疫苗的实验研究奠定了基础。     

慢性髓性白血病细胞来源的树突状细胞大容量诱导及其功能的实验研究

目的　探索大容量诱导慢性髓性白血病 (CML)细胞来源的树突状细胞 (DCs)的适宜方法 ;研究CML DCs刺激自体T淋巴细胞增殖并分泌γ 干扰素 (IFN γ)的能力。方法　用CS 30 0 0 plus血细胞分离机采集初诊CML病人的外周血单个核细胞 (PBMNCs) ;单采的CML PBMNCS转入组织培养袋 ,加入重组人粒 巨细胞集落刺激因子 (rhGM CSF)和重组人白介素 4 (rhIL 4 ) ,培养诱导 7d ;在诱导前后 ,用流式细胞仪分别检测细胞表面HLA DR、CD1a、CD80和CD86的表达水平 ;用3 H TdR掺入法检测CML DCs和CML PBMNCs刺激自体和异体T细胞增殖的能力 ;用ELISA法检测在自体混合淋巴细胞培养 (MLR)时T细胞分泌的IFN γ浓度。结果　用血细胞分离机收集的CML PBMNCs ,在组织培养袋内经细胞因子培养诱导 ,HLA DR、CD1a、CD80、CD86的表达均有明显上调 ,细胞形态也表现典型的DC特征 ;CML DCs能显著刺激自体和异体T细胞增殖 ,而CML PBM NCs仅能刺激异体T细胞的增殖 ,刺激自体T细胞增殖的能力很弱 ;刺激自体T细胞增殖时分泌的IFN γ浓度 ,CML DCs组为 (877± 2 14 )pg/mL ;CML BPMNCs组仅为 (14± 1.7) pg/mL。 结论　单采的CML PBMNCs转入组织培养袋 ,加入rhGM CSF和rhIL 4 ,可收获大容量的CML DCs;CML DCs在体外具有显著刺激自体T细胞增殖     

人脐血不同前体细胞体外诱导分化为树突状细胞的研究

目的从人脐血不同的前体细胞体外诱导分化树突状细胞(DCs),并对生成的细胞进行鉴定,探讨脐血在DC体外大量扩增的组织来源作用.方法用免疫磁珠法分离人脐血CD34 细胞,以GM-CSF、TNF-α、FL、SCF、IL-4诱导生成DC;用Ficoll分离脐血单个核细胞,2h贴壁后的细胞,以GM-CSF、IL-4、TNF-α诱导生成DC.电镜观察细胞形态,流式细胞仪分析细胞表型,并检测其刺激同种T细胞增殖的能力.结果人脐血CD34 细胞和贴壁细胞体外诱导生成的DC均具有典型的DC 形态特征,表达高水平的DC特异性标志CDla,MHCⅡ类抗原递呈分子HLA-DR和CD80共刺激分子.两种方法获得的DC的形态、CDla表面抗原的表达没有显著的差异,两者均具有刺激同种T细胞增殖的能力,前者扩增DC的效率更高.结论从人脐血中CD34 细胞和贴壁细胞两种DC的前体细胞均可诱生出DC,脐带血是DC理想的组织来源.     

慢性髓性白血病来源的树突状细胞的体外扩增培养

目的 :探讨慢性髓性白血病 (CML)来源的树突状细胞 (DC)的体外扩增及其功能 .方法 :采用两步法 ,首先将慢性髓性白血病骨髓或外周血CD34+ 细胞与rhFlt3 L和rhTPO共育 7d,再用rhGM CSF ,rhTNF α及rhIL 4诱导培养1 4d ;同时以rhGM CSF ,rhTNF α及rhIL 4直接诱导体系作对照 .获得的DC通过免疫表型检测、电镜分析及染色体鉴定 ,并用MTT法检测其刺激T细胞增殖能力及T细胞对CML细胞的杀伤作用 .结果 :两步法培养 2 1d ,CML的CD34+ 细胞扩增 (76 . 5 6± 5 . 1 7)倍 ,DC产率 (39. 1 0± 8. 0 3) % ,直接诱导产生DC扩增倍数及比例均低于两步法 (P <0 . 0 1 ) ,且此DC能刺激自体或异体T细胞增殖进而杀伤CML细胞 .结论 :两步法体外扩增培养可明显提高DC前体总数及产率 ,优于直接诱导培养 ;CML细胞来源的DC可诱导抗白血病免疫应答的产生     

转染IL-18基因慢性粒细胞白血病树突状细胞的抗白血病作用

目的：探讨转染IL-18基因慢性粒细胞白血病（CML）树突状细胞（DCs）抗白血病免疫作用。方法：以脂质体介导法将pVAX1-IL-18真核表达质粒转染CML DCs,检测转染IL-18 DCs的IL-18表达,通过流式细胞仪检测转染IL-18 DCs的CD80⁺、CD86⁺细胞百分率,并检测IL-18基因修饰DCs刺激T细胞增殖能力、特异性CTL杀伤作用及诱导的NK细胞的杀伤活性。结果：转染IL-18 DCs上清中IL-18的含量为（596±34.1）pg/2×10⁶cells/48 h,而在转染空质粒DCs和DCs上清中未检测到IL-18,且转染IL-18 DCs的CD80⁺、CD86⁺细胞百分率高于转染空质粒的DCs（P<0.05）。转染IL-18的DCs刺激T细胞增殖能力、特异性CTL杀伤作用及诱导的NK细胞的杀伤活性明显高于转染空质粒的DCs（P<0.05）,且随着S/R或R/T增加,其多种免疫反应逐渐增强。结论：IL-18与DCs抗肿瘤作用具有协同性。     

慢性粒细胞白血病患者树突状细胞抗原加工递呈和迁移功能观察

目的:研究细胞因子体外联合诱导培养的慢性粒细胞白血病(CML)患者树突状细胞(DCs)的表型和抗原递呈、分泌和迁移功能的变化.方法:分离CML患者(CML组)和健康志愿者(正常组)外周血单个核细胞(PMNCs),经培养获取贴壁细胞,将CML组和正常组的贴壁细胞及K562细胞用细胞因子rhGM-CSF、rhIL-4、TNF-α体外诱导10 d后,流式细胞仪检测细胞的免疫表型;培养5 d后,用ELISA检测细胞的内吞功能;应用混合淋巴细胞培养分析3组DCs对静息T细胞的免疫刺激活性.结果:正常组、CML组、K562组DCs的特异性标志CD83和共刺激分子标记CD80和CD86以及CD11和HLA-DR的表达差异无统计学意义(P＞0.05);DCs的抗原吞噬、迁移能力和对T细胞的免疫刺激活性,CML组和K562组之间差异无统计学意义(P＞0.05),CML组和正常组间差异有统计学意义(P＜0.05).结论:CML患者DCs的免疫表型和正常人相似,但其抗原捕获、递呈和迁移功能有缺陷.     

RNA转染树突状细胞诱导特异性抗前列腺癌免疫反应的实验研究

目的 研究前列腺癌细胞RNA转染树突状细胞(DCs)诱导的细胞毒T淋巴细胞(CTL)对前列腺癌细胞的特异性杀伤作用.方法 联合应用粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白细胞介素-4 (IL-4) 诱导培养小鼠骨髓单个核细胞向DCs分化,脂质体法转染RNA,流式细胞术测定转染后树突状细胞共刺激分子表达的变化,MTT法测定DCs对T淋巴细胞的刺激能力.ELISA法检测IFN-γ的分泌水平.LDH法测定DCs诱导的CTL对前列腺癌细胞的杀伤效果.结果 用GM-CSF和IL-4诱导培养小鼠骨髓来源的单核细胞,体外诱导培养6 d后获得大量DCs;RNA转染后,DCs表面共刺激分子CD40、CD80、CD86和MHC-Ⅱ分子表达提高(P<0.05),刺激T淋巴细胞增殖能力明显提高(P<0.01);前列腺癌RNA转染的DCs诱导CTL对前列腺癌细胞和肝癌细胞的杀伤作用有明显差异(P<0.01).结论 前列腺癌细胞RNA转染DCs后诱导的CTL对前列腺癌有特异性杀伤作用,为进一步抗肿瘤疫苗的实验研究奠定了基础.     

A23187诱导HL-60细胞分化为树突状细胞的研究

目的 探讨用钙离子载体A23187通过钙动员机制使人急性粒细胞性白血病细胞系HL-60细胞迅速分化为树突状细胞(DCs)的方法,为今后临床用DCs进行抗白血病免疫治疗打下基础.方法 将生长良好的HL-60细胞加入不同浓度A23187(45～720 ng/mL)或联用重组人γ-干扰素(rhIFN-γ,1000 U/mL)培养20～96 h,倒置显微镜和扫描电镜观察其形态学特征,流式细胞术检测其免疫表型,混合淋巴细胞反应检测其刺激T淋巴细胞增殖的能力.结果 HL-60细胞加入适量A23187(180 ng/mL)或联合rhIFN-γ(1000 U/mL)诱导20 h后,即可出现细胞表面树状突起,且树突状细胞表面特异性成熟标志抗原CD83、共刺激分子CD80、CD86表达升高;培养48 h,CD83分子表达开始降低;培养72 h,可获得DC的典型形态,CD80、CD86分子表达持续升高.同种异体混合淋巴细胞反应检测经A23187或联用rhIFN-γ诱生的DCs可明显刺激同种异体T淋巴细胞增殖.结论 钙离子载体可诱导HL-60细胞分化为高表达共刺激分子及具有刺激同种异体T淋巴细胞增殖的成熟DCs,钙动员有望成为一种快速获取DCs的有效方法.     

CD34+HPC来源的树突状细胞体外扩增和功能研究

目的研究脐血CD34^ HPC体外扩增诱导产生功能性树突状细胞(DCs)的有效方案。方法Ficoll分离脐血获得单个核细胞。免疫磁珠阳性分选CD34^ HPC,^sH^-TdR检测DCs激发异体T细胞增殖的能力。MTT法检测特异性CTL的杀伤能力。结果SCF FL GM—CSF IL-4诱导生成的DCs激发T细胞增殖和特异性CTL的杀伤能力均高于其他组。结论SCF FL GM—CSF IL-4可有效扩增CD34^ HPC并诱导产生功能性DCs。     

用DNA-PCR方法于基因组水平检测K562细胞及慢性粒细胞白血病患者bcr/abl融合基因

目的：在慢性粒细胞白血病（慢粒）细胞系K562及慢粒患者中尝试基于DNA水平的bcr／abl融合基因检测方法。方法：以Waller的“L—T DNA PCR”方法为基础，并针对其引物位置设计的缺陷，改进设计了一套DNA—PCR引物，分别提取K562细胞及慢粒患者外周血单个核细胞DNA，进行bcr／abl融合基因扩增，并对扩增片段进行序列测定。结果：运用DNA—PCR方法成功地扩增出了K562细胞及2名CML患者外周血基因组的bcr／abl融合基因片段，随后进行的片段测序进一步明确了融合基因的断裂位点。结论：DNA—PCR提供了一种基于基因组DNA水平的新检测手段，结合测序能鉴定融合基因的断裂位点，若结合定量PCR的方法则能监测患者的治疗效果与预后，还能检测患者经化疗后的残留微小病灶。     

Bcr/abl融合基因的小干扰RNA对K562细胞增殖和凋亡的影响

目的 观察特异性bcr/abl融合基因的siRNA对慢性粒细胞白血病K562细胞增殖和凋亡的影响。方法　设计并化学合成bcr/abl融合基因融合位点b3:a2 21个核苷酸 siRNA作用于K562细胞,用WST-8法检测细胞增殖抑制率;RT-PCR 检测 bcr/abl mRNA表达水平;PI单染流式细胞仪检测细胞周期;Annexin V-PI双染测定细胞凋亡比例;Hochest33258 染色荧光显微镜观察细胞凋亡的形态学变化。结果 ①Bcr/abl siRNA作用K562细胞24h,48h,72h后,明显抑制K562细胞增殖,各浓度组间的增殖抑制率无明显差异(p>0.05);②Bcr/abl siRNA能显着下调bcr/abl mRNA水平,各浓度组间差异无显著性(p>0.05);③Bcr/abl siRNA作用组细胞周期阻滞于G1期;④Bcr/abl siRNA作用后细胞出现明显的早期凋亡群,各浓度组间的早期凋亡率差异无统计学意义(p>0.05),细胞出现核固缩、核边集、凋亡小体等改变。结论 　特异性bcr/abl siRNA可显着抑制K562细胞bcr/abl融合基因的表达,抑制细胞的增殖,诱导凋亡,但其作用未显示明显的剂量依赖性。     

RT-PCR检测慢性粒细胞白血病患者骨髓细胞集落bcr/abl mRNA的表达

采用ＲＴＰＣＲ 技术对ＣＭＬ 患者骨髓细胞１４ ｄ 的细胞集落群和部分１４ ｄ 或２８ ｄ 的单个细胞集落ｂｃｒ／ａｂｌ ｍ ＲＮＡ 表达进行分析。结果显示：所检测的骨髓细胞集落ｂｃｒ／ａｂｌ 基因的表达均呈阳性,即为ＣＭＬ 集落,与细胞遗传学分析结果一致。该方法为研究ＣＭＬ 造血前体细胞基因表达及其诊断、治疗监测提供了灵敏、有效的分析手段;并可作为研究ＣＭＬ 发病、治疗及筛选抗ＣＭＬ 药物较为理想的方法。     

慢性粒细胞性白血病患者间充质干细胞的分离、纯化及向神经元样细胞分化的研究

目的研究慢性粒细胞性白血病（CML）骨髓间充质干细胞（MSCs）的分离、纯化、扩增以及在体外向神经元样细胞定向分化的能力。方法获取CML患者的骨髓MSCs，采用低血清培养液培养，瑞士染色观察其形态；流式细胞仪检测其免疫表型和细胞周期；逆转录-聚合酶链反应（RT—PCR）检测CML特异性表达的bcr／abl基因；分析骨髓MSCs染色体核型。全反式维甲酸（ATRA）诱导MSCs在体外分化为神经元样细胞，倒置相差显微镜观察神经元样细胞的形态，免疫组织化学染色法和Western blot法检测神经丝蛋白（NF）和神经元烯醇化酶（NSE）的表达。结果CML来源的骨髓MSCs呈纤维样贴壁生长，体外培养易扩增；表达相关抗原CD29、CD44、CD105，不表达CD31、CD13、CD34、CD45、HLA—DR；不表达bcr／abl融合基因，且具有正常的核型；不同扩增代数的MSCs在诱导剂的作用下呈现典型的神经元样细胞形态，NF、NSE呈阳性反应。结论CML患者骨髓中可以分离培养MSCs，它具有体外大量扩增并保持低分化状态的特性和定向分化为神经元样细胞的能力，是一种可用于神经系统疾病治疗的种子细胞。     

STI571、三氧化二砷和Velcade对bcr/abl+-CD34+细胞增殖、凋亡的影响

目的 研究STI571、三氧化二砷(As2O3)和Velcade在单独及联合应用时对bcr/abl -CD34 细胞增殖、凋亡的影响.方法 提取慢性粒细胞白血病患者骨髓的bcr/abl -CD34 细胞,用STI571、As2O3、Velcade单独及联合处理96 h,通过CCK-8分析及流式细胞术分别检测细胞增殖、凋亡的变化,并用Hoechst33342染色及荧光显微镜技术观察凋亡细胞形态学改变.同时检测上述方案对正常骨髓CD34 细胞的抑制作用.结果 STI571、As2O3及Velcade对bcr/abl -CD34 细胞的作用呈剂量依赖性,其中在低浓度时以抑制增殖作用为主,促凋亡作用不明显.当0.25～2 μmol/L STI571分别与2.5 μmol/LAs2O3及15nmol/L Velcade联合后,抑制率和凋亡率均显著提高,呈相加或协同作用,且对正常CD34 细胞的抑制作用无进一步增强.结论 As2O3及Velcade与STI571联合能够增强对BCR/ABL -CD34 细胞的作用,具有一定临床意义.     

Effect of Interferon-alpha in systemic lupus erthematosus (SLE) serum on the differentiation and maturation of dendritic cells derived from CD34+ hematopoietic precursor cells

Objective: To study the effect of interferon-alpha IFN-α in the serum of SLE patients on the differentiation and maturation of dendritic cells (DCs) derived from CD34+ hematopoietic precursor cells (HPCs). Methods: Serum samples from SLE patients and normal controls were collected and the concentration of IFN-α detected by ELISA. CD34+HPCs were purified from cord blood by a magnetic cell sorting system (MACS), and cultured to differentiate to DCs. Normal serum, normal serum with exogenous IFN-α, SLE serum with raised levels of IFN-α, or SLE serum with anti-IFN-α neutralizing antibody was added to the culture medium. The phenotype of DCs was analyzed by flow cytometry (FCM) and the capacity of DCs to stimulate allogenic T lymphocyte proliferation was evaluated in a mixed lymphocyte reaction by the Cell Counting Kit-8. Cytokine production was assessed by ELISA. Results: Serum levels of IFN-α were significantly higher in SLE patients than in normal controls and this correlated positively with disease activity. Cultured in SLE serum with raised levels of IFN-α, CD34+ HPCs could differentiate into DCs that expressed higher levels of HLA-DR, CD80 and CD86, and showed an enhanced allogenic T-cell stimulatory capacity, while producing lower levels of IL-12 and higher amounts of IL-10 compared with those DCs cultured in normal serum. Conclusion: Increased levels of IFN-α in SLE serum promotes the differentiation and maturation of DCs derived from CD34+ HPCs and could contribute to the pathogenesis of SLE.