旁观者效应在肝癌基因治疗中的作用

目的：观察HSV－tk/ACV(Herpes Simplex Virus thymidine kinase gene/Acyclovir）系统基因治疗恶性肿瘤过程中旁观者效应的作用。方法：HSV－tk基因重组逆转录病毒载体转染PA317细胞为PA317－tk细胞。培养PA317－tk细胞即可获得有感染力的携带HSV－tk基因的病毒颗粒,然后转染肝癌细胞株SMMC－7721细胞为SMMC－tk细胞。SMMC－TK细胞与SMMC－7721细胞以不同百分比混合,用ACV（100ug/ml）培养基培养,MTT法检测ACV对各组细胞抑制率（Inhibit Rate,IR),根据各组IR与该组SMMC－tk细胞数的百分比值（IR／SMMC－tk%,IR/St）的大小判断旁观者效应作用的有无和强弱。结果：旁观效应试验表明,含SMMC-tk细胞10％,20％,30％,40％,50％,60％,70％,80％,90％,100％各组IR／St比值分别为2．15,1．91,1．83,1．47,1．30,1．11,1．02,0．93,0．84,0．76。10％－70％各组IR／St比值均大于1,存在明显旁观者效应,以10％,20％,30％,40％组最强,80％－100％三组IR／St比值小于1,旁观者效应不明显。结论：研究结果证实用HSV－tk/ACV系统基因治疗恶性肿瘤,适宜比例TK^ 细胞时,存在明显的旁观者效应,TK／细胞为10％时旁观者效应最强,这对于HSV－TK／ACV系统基因治疗恶性肿瘤具有重要意义。     

HSV-tk/GCV系统对人宫颈癌细胞株ME180旁观者效应的研究

目的：研究以逆转录病毒载体介导的HSV－tk/GCV系统对宫颈癌ME180细胞株的旁观者效应。方法：应用脂质体及ploybrene转染技术，将重组逆转录病毒载体PLXSN－HSV－tk，导入PA317包装细胞，以其分泌的逆转录病毒感染宫颈癌ME180细胞（ME），建立ME／TK转化细胞株。观察GCV对ME、ME／TK细胞的存活率及旁观者效应。结果：从病毒滴度、电镜及PCR检查，证实tk基因随病毒的感染已成功地导入PA317及ME180细胞。ME／TK细胞对GCV的敏感性显著高于亲代ME细胞。ME／TK及ME＋ME／TK混合细胞还随GCV浓度的增加受到明显的抑制。ME＋ME／TK混合细胞的存活率，随ME／TK细胞比例的增加而降低，说明TK／GCV系统不但能杀伤tk^ 细胞，也能杀伤未导入tk的细胞，存在明显的旁观者效应。结论：HSV－tk/GCV系统对宫颈癌ME180细胞具有明显的杀伤及旁观者效应。     

肝癌HSV-tk/ACV基因治疗的实验研究

目的：观察单纯疱疹病毒胸苷激酶基因（HSV－tk基因,自杀基因）与阿昔洛韦（ＡＣＶ）系统对人肝癌细胞的体外杀伤效果。方法：体外培养已感染含ＨＳＶ-tk基因的重组逆转录病毒的PA317-tk细胞,获取含HSV－tk基因的重组逆转录病毒颗粒。用后者感染人肝癌细胞株SMMC－7721,G418培养基筛选抗性克降SMMC-7721-tk,并以PCR技术检测HSV-tk基因判断转染成功与否。用形态学方法和MTT法检测ACV对SMMC－7721－tk细胞的杀伤作用。结果：SMMC－7721－tk细胞经PCR证实含PCR－tk基因。形态学观察显示,ACV浓度在0.01-1μg/ml时,SMMC－7721－tk细胞小部分死亡,在浓度自1μg-1000μg/ml时,细胞大部分死亡;HE染色可见细胞凋亡。MTT法测定显示,ACV浓度自1μg/ml开始即对SMMC－7721－tk细胞产生明显抑制作用,抑制率自49％到78％,作用强度呈ACV浓度依赖性。各种浓度的ACV对SMMC－7721细胞没有或只有轻度抑制作用。结论：HSV－tk/ACV系统体外对肝癌细胞有明显的杀伤作用,有可能成为临床基因治疗方案。     

转TK基因的人肺腺癌细胞对三种原药敏感性的研究

构建了含有单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSV－TK）基因的重组逆转录病毒载体LTKSN，经PA317细胞包装后，感染人肺腺癌细胞株A549。用G418筛选到稳定表达HSV－TK基因的细胞克隆A549／TK，A549／TK与野生型A549细胞相比，生长曲线无明显差异，细胞形态亦无改变。细胞毒试验证明．HSV－TK对GCV的敏感性很高，半杀伤浓度IC50为0．5μmol／L，比野生型细胞提高了1000倍。三种不同的原药GCV、ACV和BVDU对A549／TK具有效果不等的杀伤作用。旁杀伤效果十分明显，低浓度GCV就可以将含33％A549／TK的混合细胞中的大部分肿瘤细胞杀死。     

反转录病毒介导基因转移治疗脑肿瘤的安全性研究：Ⅱ.HSV—tk／A …

采用细胞接种、Ｘ－ｇａｌ染色、ＴＫ基因的ＰＣＲ和病理切片观察,分别将ＰＡ３１７／ＢＡＧ,ＰＡ３１７／ＴＫ产病毒细胞注射动物体内,结果产病毒细胞在动物体内存活期均不超过１个月;产病毒细胞在体内有形成肿瘤,也没有发现严重的炎症 反应;ＨＳＶ－ｔｋ／ＡＣＶ系统用于动物基因治疗,ＡＣＶ及其代谢物产物没有发现明显的毒副作用和病理改变。说明反转录病毒介导的ＨＳＶ－ｔｋ／ＡＶＣ系统的在动物体内取得了安全的结果。     

反转录病毒介导基因转移治疗脑肿瘤的安全性研究 Ⅰ.具有复制能力野生型反转录病毒检测

目的：检测反转录病毒介导的脑肿瘤基因治疗过程中具有复制能力野生型反转录病毒（RCR）。方法：RCR检测主要方法有：DNA聚合酶链式反应（PCR），反转录PCR（RT／PCR），Southern杂交以及neo基因和lacZ基因的补救分析。结果：建立了RCR的检测系统，从DNA水平、RNA水平和病毒活体水平对产HSV－TK病毒包装细胞（TK／VPC），C6转TK基因细胞和实验动物血液可能存在的RCR野生型病毒进行检测，结果均没有检测到野生型反转录病毒。结论：采用的反转录病毒基因转移系统没有产生野生型病毒，为临床试验的安全进行提供了保证。     

单纯疱疹病毒胸苷激酶基因转染联合药物对卵巢上皮癌细胞杀伤作用的研究

目的:探讨逆转录病毒载体介导的单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV1-tk)基因转染,联合抗病毒药物羟甲基无环鸟苷(ganciclovir,GCV)和无环鸟苷(acyclovir,ACV)对人卵巢上皮癌(OEC)细胞系TYK的杀伤作用.方法:用lipofectionreagent介导法将PINTK5质粒转移入包装细胞PA317中,用滴度最高的PA317病毒上清液转染TYK细胞,运用MTT法及光镜、电镜检测GCV、ACV对目的细胞的体外杀伤效应.结果:将PLNTK5质粒转入PA317细胞后,得到了稳定的产病毒细胞株.TYK细胞可被病毒上清液转染,转导HSV1-tk基因可显著增强ACV、GCV对TYK细胞的杀伤作用.结论:逆转录病毒可介导HSV1-tk基因转染TYK细胞并获稳定表达,ACV、GCV对携有HSV1-tk基因的卵巢癌细胞有明显的体外杀伤作用.     

单纯疱诊病毒胸苷激酶基因转染联合药物对卵巢上皮癌细胞杀伤作用的研究

目的：探讨逆转录病毒载体介导的单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSV1-tk）基因转染,联合抗病毒药物羟甲基无环鸟苷（ganciclovir,GCV）和无环鸟苷（acyclovir,ACV）对人卵巢上皮癌（OEC）细胞系TYK的杀伤作用。方法：用lipofection reagent介导法将PLNTK5质粒转移入包装细胞PA317中,用滴度最高的PA317病毒上清液转染TYK细胞,运用MTT法及光镜、电镜检测GCV、ACV对目的细胞的体外杀伤效应。结果：将PLNTK5质粒转入PA317细胞后,得到了稳定的产病毒细胞株。TYK细胞可被病毒上清液转染,转导HSV1-tk基因可显著增强ACV、GCV对TYK细胞的杀伤作用。结论：逆转录病毒可介导HSV1-tk基因转染TYK细胞并获稳定表达,ACV、GCV对携有HSV1-tk基因的卵巢癌细胞有明显的体外杀伤作用。     

单纯疱疹病毒TK基因介导GCV治疗人RB肿瘤的实验研究

为探讨HSV－TK基因介导的GCV系统对人视网膜母细胞瘤（RB）基因治疗的有效性,利用电穿孔技术把重组逆转录病毒载体pLXSNTK导入包装细胞PA317,筛选出逆转录病毒产生细胞PA317/TK,收获病毒。体外实验：用逆转录病毒感染RB细胞,筛选出含TK基因的RB细胞（RB/TK）,用GCV分别处理RB、RB/TK及不同比例的混合细胞。体内实验：建立人RB裸鼠原位异种移植模型,瘤内注射病毒液后再经GCV处理。结果：体外实验RB/TK细胞对GCV的敏感性显著高于RB细胞,并存在旁观者效应;RB荷瘤裸鼠内TK/GCV系统对RB细胞的生长也有明显的抑制作用。提示HSVTK/GCV系统有望成为人RB肿瘤的基因治疗途径。     

阳离子脂质体介导HSV-TK基因对人脑胶质瘤细胞的杀伤作用

目的 观察阳离子脂质体介导的HSV－TK／ACV系统对人脑胶质瘤细胞的杀伤作用。方法 将新近克隆的含HSV－TK基因的真核表达载体pCR3-5K,用阳离子脂质体Lipofectamine转染至人脑胶质瘤细胞株TJ905中，筛选出阳性克隆，给予不同浓度的ACV，观察不同时间对细胞的杀伤情况，并用MTT方法检测不同细胞对ACV的反应情况。结果 转染TK基因的胶质瘤细胞对ACV的杀伤敏感性明显提高（P＜0．01），ACV对转染TK基因的胶质瘤细胞有特异性抑制和杀伤作用。结论 阳离子脂质体Lipofectamine是一种简便、安全、有效的基因转移方法。可用阳离子脂质体介导pCR3-TK转移，进行胶质瘤HSV－TK／GCV基因治疗的研究，为胶质瘤的治疗提供一种新方法。     

单纯疱疹病毒胸苷激酶基因在肿瘤基因治疗中的应用

胸苷激酶基因在细菌和哺乳动物细胞中都存在，但只有病毒的胸苷激酶如单纯疱疹病毒胸苷激酶才能使更昔洛伟(ganciclovir，GCV)等核苷类似物磷酸化，磷酸化的核苷类似物干扰DNA的合成而中止细胞的复制，尤其在肿瘤细胞中。在近10年，人们利用HSV—tk基因通过病毒载体转染多种肿瘤细胞，然后给予更昔洛伟(GCV)或阿昔洛伟(acyclovir，ACV)，在体外、体内试验对肿瘤细胞的杀伤作用都很明显。另外HSV—tk／GCV系统在抗肿瘤作用中有“旁观”效应，即转染有HSV-tk基因的靶细胞与未转染的HSV-tk基因的靶细胞同样可被GCV杀伤。由于HSV—tk／GCV系统的抗肿瘤作用效果明显，安全性好，越来越多的肿瘤患志愿接受实验，该系统已获准临床实验。本综述了近10年来HSV-tk／GCV系统在抗肿瘤治疗探索中的应用，大量资料显示HSV—tk基因用于抗肿瘤治疗将是本世纪的重要方法。     

HSV-TK/GCV系统治疗鼠膀胱癌细胞T739旁观者效应的实验研究

目的 为探讨HSV－TK／GCV系统治疗鼠膀胱癌细胞T739的旁观者效应。方法 台盼蓝染色计数法对GCV单独作用T739－TK细胞、T739细胞或其两者按不同比例混合在不同容积等情况下的杀伤作用进行研究。结果 HSV－TK／GCV系统有效的杀伤T739－TK细胞，且这种作用有明显的旁观者效应，旁观者效应的强弱与T739－TK细胞所占比例以及细胞间接触程度成正相关。结论 HSV－TK／GCV系统不仅能有效的杀伤T739－TK细胞，而且对T739细胞有明显的旁观者效应。     

含HSVtk基因重组逆转录病毒包装细胞PA317/TK的建立

目的 :研究肿瘤的自杀基因疗法 ,建立含单纯疱疹病毒胸苷激酶 (HSVtk)基因重组逆转录病毒包装细胞PA317/TK。　方法 :应用脂质体转移方法将逆转录病毒载体GINaTK导入PA317,经G4 18筛选阳性克隆细胞后分别用PCR和扫描电镜检测HSVtk基因整合和病毒颗粒分泌情况。　结果 :逆转录病毒载体GINaTK导入PA317,G4 18后筛选得到阳性克隆细胞 ,命名为PA317/TK。PCR检测PA317/TK细胞出现一特异性 4 0 4bp阳性条带 ,而PA317细胞没有扩增出相应条带。PA317/TK细胞经扫描电镜检测见其表面有颗粒状突起 ,其周围有许多呈团状的病毒颗粒。证实含HSVtk基因重组逆转录病毒存在于包装细胞中。　结论 :成功建立含HSVtk基因重组逆转录病毒包装细胞     

HSV-tk基因反转录病毒载体的构建及体外抗脑肿瘤细胞作用研究

构建了含有pgk启动子驱动的HSV-tk基因的反转录病毒载体pLNTK，PCR证实pLNTK成功地转移至SHG44及NBA2细胞。体外实验证实，表达HSV-tk次的细胞对ACV的敏感性明显高于未修饰的亲本细胞，SHGLNTK、NBALNTK细胞对ACV的敏感性分别是其亲本细胞的1000、500倍。3H－TdR掺入法证实转染HSV－tk细胞在ACV存在下，其DNA合成能力较亲本细胞明显受抑制。共培养实验证实存在旁观者效应。     

HSV1—tk／GCV系统对前列腺癌基因治疗的实验研究

目的：前列腺癌是男性最常见的恶性肿瘤之一。临床常用的治疗方案包括雄激素去势治疗、放射治疗等能取得近期效果。但对于雄激素非依赖性前列腺癌和雄激素非依赖性骨转移癌，至今尚无行之有效的临床治疗方案，本研究采用逆转录病毒载体介导单弛疱疹病毒Ⅰ型胸苷激酶（Herpes Simplex Virus Type ⅠThymidine Kinase,HSV1-tk)结合环氧鸟苷（Ganciclovir,GV)，就三种前列腺癌细胞系（C4、C4－2、PC3）进行体外基因治疗观察，以便为进行体内实验和临床应用提供有意义的实验依据。方法：将逆转录病毒载体pN2A与HSV1－tk基因重组，转染包装细胞系PA317，经G418筛选，选择高病毒滴度的生产细胞系（Virus producer cells,VPC）PCR、RT－PCR检测VPC内HSV1－tk基因整合和表达。VPC与三种癌细胞胺1：1，1:2,1:4,1:8的比例混合培养，以硫基罗丹B（Sulforhodamine B,SRB)法测定GCV治疗后第1、3、5、7天的细胞对雄激素非依赖性前列腺癌及骨转移性前列腺癌均有杀伤效应，其中以1：1的剂量和第五天效果最佳；镜下没有发现凋亡小体；其与其他两种癌细胞相比较，HSV1-tk/GCV系统对PC3的治疗效果最好，具有统计学差异。结论：HSV1－tk/GCV系统三对种体外培养的前列腺癌细胞均有杀伤作用，其杀伤机制是通过细胞毒作用。VPC与肿瘤细胞混合培养，以1：1并给予GCV后第五天疗效最佳。本研究对雄激素非依赖性前列腺癌及骨转移性前列腺癌提出了一个新的治疗方案。     

突变型胸苷激酶促进前体药物对小鼠T淋巴细胞的杀伤作用

目的研制表达单纯疱疹病毒胸苷激酶基因（HSV1-TK）及其突变体HSV1-SR39TK的T淋巴细胞,探讨给予更昔洛韦（GCV）和阿昔洛韦（ACV）后T细胞的生存率。方法采用磷酸钙沉淀法将慢病毒载体三质粒系统共转染来源于人胚肾的293T细胞,表达HSV1-SR39TK和HSV1-TK的T细胞与不同浓度的GCV和ACV培养3d后,应用CCK-8法测定T细胞存活率。结果包装后慢病毒载体的滴度超过106IU/ml、ACV/GCV浓度在1～10μmol/L时,SR39TK＋T细胞的存活率下降明显,ACV组T细胞存活率从（98.4±2.7）%下降至（49.9±5.9）%,GCV组从（97.9±2.7）%下降至（33.7±5.3）%,差异均有统计学意义（均P〈0.05）。当ACV/GCV浓度进一步升高时,T细胞活率下降不明显。TK＋T细胞对GCV敏感,T细胞活率从（97.9±2.7）%下降至（38.4±5.5）%,差异有统计学意义（P〈0.05）;但是对ACV不敏感,T细胞存活率从（98.4±2.7）%下降至（73.8±7.4）%,差异无统计学意义（P〉0.05）。IC50值测定结果显示,SR39TK＋T细胞对GCV和ACV的敏感性高于TK＋T细胞。结论表达HSV1-SR39TK的T细胞对GCV和ACV的敏感性均较HSV1-TK高。突变型HSV1-TK在体外可促进前体药物介导的杀伤小鼠T细胞的作用。     

HSV-tk/GCV自杀基因系统对骨肉瘤细胞体外杀伤效应

目的：观察：HSV—tk／GCV系统对骨肉瘤细胞SAOS-2的体外杀伤作用．方法：构建tk基因逆转录表达载体pL(tk)SN,在lipofectamine2000介导下转染PA317包装细胞,G418筛选,直至出现抗性克隆,扩大培养,用NIH3T3测定病毒滴度,将重组病毒感染人骨肉瘤细胞SAOS-2,G418筛选出抗性克隆命名为SAOS／tk,以RT—PCR及Southern blot检测tk基因的整合及表达．观察tk基因修饰细胞生长状况及MTT法观察前药对tk基因修饰骨肉瘤细胞的杀伤效应．结果：RT—PCR及Southern blot分析证明tk基因在人骨肉瘤细胞系SAOS-2中有整合及表达;SAOS／tk与未转基因的原肿瘤细胞相比,两者生长速度及形态结构无明显差别;在前药敏感性试验中,GCV对SAOS／tk细胞的杀伤作用十分明显,半数致死量约为1mg／L,而亲本细胞SAOS-2和空白质粒转染SAOS／0细胞,半数致死量大于100mg／L．tk基因修饰细胞与不同比例亲本细胞混合后经GCV治疗,SAOS／tk占混合细胞总数的20％时即可杀伤约50％的混合培养细胞.结论：人骨肉瘤细胞系SAOS-2对HSV—tk／GCV系统高度敏感,并且有明显的旁观者效应,可望成为骨肉瘤基因治疗的新途径．     

CD、TK双自杀基因对消化道肿瘤细胞的体外抑制作用

目的 用粘粒法构建含有胞嘧啶脱氨酶（CD）、单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSV－tk)双自杀基因的腺病毒载体，检测双自杀基因对不同消化道恶性肿瘤细胞的体外抑制作用。方法 利用重组腺病毒载体介导的CD、HSV－tk融合基因感染人结肠腺癌细胞系LoVo、胃癌细胞系SGC－7901、肝癌细胞系BEL－7402，通过MTT法测定细胞存活率，通过细胞集落形成实验分析GCV（丙氧鸟苷）、5－FC（5－氟胞嘧啶）双前药（double prodrugs)对肿瘤细胞的杀伤作用和旁观效应的大小。结果 Western blot检测分析融合基因的表达，显示重组腺病毒介导的双自杀基因可以在3种肿瘤细胞中高效表达。使用前药GCV和5－FC后，各组肿瘤细胞的集落形成和细胞存活率显低于对照组。感染细胞在混合细胞中比例较低时，就能获得明显的旁观效应。联合两种前药能获得最大的细胞抑制作用，并且CD／5－FC系统对于消化道肿瘤细胞的杀伤作用强于HSV－tk/GCV系统。结论 CD、TK融合基因联合双前药治疗对消化道肿瘤有显的体外抑制作用。     

单纯疱疹病毒胸苷激酶丙氧鸟苷自杀基因系统对宫颈癌Hela细胞系体外杀伤作用的研究

目的：观察单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)丙氧鸟苷(GCV)自杀基因系统对人宫颈癌Hela细胞系体外杀伤作用及其旁观效应。方法：采用脂质体转染法将GINaTK载体转入包装细胞PA317。取病毒上清液感染Hela细胞,得到带有HSV-TK基因的Hela／TK细胞,并将其用于体外实验。结果：载体HSV-TK导入了PA317细胞。体外实验结果显示,当Hela／TK细胞数占混合细胞10％时,低浓度(10mg／L)的GCV就可将50％左右的肿瘤细胞杀死。GCV作用后的实验组Hela／TK细胞基因组经琼脂糖凝胶电泳后可观察到典型的DNA梯状条带。结论：逆转录病毒可介导HSV-TK基因转入人宫颈癌Hela细胞并获稳定表达,HSV-TK／GCV自杀基因系统在体外对宫颈癌细胞有杀伤作用,且存在明显的旁观效应。     

双自杀基因CD+TK对胰腺癌BxPC-3细胞的影响

目的探讨逆转录病毒介导的双自杀基因对胰腺癌BxPC-3细胞的杀伤作用及胰腺癌的基因治疗方法。方法通过脂质体将含有双自杀基因的逆转录病毒载体MMLV—CD＋TK导入包装细胞PA317，经G418筛选后大量培养产病毒的阳性克隆PA317／CD＋TK细胞株，收集病毒上清液，浓缩后转染胰腺癌BxPG3细胞系，再次经G418筛选，获得稳定表达双自杀基因的BxPC-3／CD＋TK细胞株。用RT—PCR检测双自杀基因的表达。给予前体药物5-氟胞嘧啶（5-flourocytosine，5-FC）和（或）无环鸟苷（Ganciciovir，GCV）后，MTT法测定转基因组及未转基因组胰腺癌BxPC-3系细胞的存活率。结果双自杀基因在胰腺癌BxPC-3系细胞中可稳定表达，联合使用5-FC和GCV对细胞增殖的杀伤作用及旁杀伤效应效果明显。结论逆转录病毒介导自杀基因可有效杀死胰腺癌Bx-PC-3系细胞，双自杀基因具有更强的抗肿瘤作用。