小分子干扰RNA基因沉默与骨肉瘤治疗

小分子干扰RNA(siRNA)是真正触发RNA干扰(RNAi)的效应分子,具有高度特异性、高效性、高度稳定性的特点,可在组织细胞内介导基因沉默,近年在研究基因调控、信号转导、疾病治疗等方面显示出显著优越性.该文就siRNA干扰技术在骨肉瘤治疗中的应用研究进展作一综述.     

小干扰RNA引发多药耐药乳腺癌细胞内MDR1基因沉默的研究

目的　研究小干扰RNA(siRNA)抑制耐药乳腺癌细胞系MDR1基因表达的可行性。方法　选用耐阿霉素人乳腺癌细胞系MCF7/ADR及其药物敏感细胞系MCF7作为研究对象。将预先设计的siRNA包装入质粒载体 ,然后转化质粒到大肠杆菌中 ,经过克隆、扩增、纯化后转染到MCF7/ADR细胞中 ,10 0mg/L潮霉素筛选 2周 ,用流式细胞术从蛋白水平检测P gp的表达率 ,及作实时定量聚合酶链式反应从基因转录水平检测MDR1基因的表达率。结果　流式细胞术检测结果显示 ,MCF7/ADR细胞经特异性siRNA作用后P gp的表达率由99.8%下降到 12 .3 % ;作为阳性对照的转染过GFP基因的LA795细胞的GFP蛋白表达率由 74.8%下降到 10 .6%。实时相对定量PCR检测结果显示 ,MCF7/ADR细胞经特异性siRNA作用后其Ct值由 2 5 .2 2增加到 3 0 .64。结论　siRNA能抑制人乳腺癌多耐药细胞系MCF7/ADR内MDR1基因表达 ,从而为逆转肿瘤细胞的耐药性提供了一种新的方法。     

小干扰RNA特异性沉默c-myc基因对人胰腺癌SW1990细胞生物学影响

目的 观察小干扰RNA(siRNA)沉默c-myc基因的表达对人胰腺癌细胞株SW1990细胞生物学影响.方法 用siRNA沉默胰腺癌SW1990细胞中c-myc基因,用实时定量反转录聚合酶链反应(RT-qPCR)及Western blot技术检测c-myc mRNA及蛋白的表达量;噻唑蓝(MTT)法检测siRNA沉默c-myc基因对SW1990细胞增殖的影响;膜联蛋白V/碘化丙锭(Annexin V/PI)双染流式细胞术检测沉默c-myc基因细胞凋亡水平;Transwell细胞迁移实验检测siRNA沉默c-myc基因对SW1990细胞迁移能力的影响.结果 靶向c-myc的特异性siRNA可以高效抑制人胰腺癌SW1990细胞c-myc基因表达,在mRNA水平(0.263±0.048)较转染对照质粒组(0.970±0.012)明显降低,c-myc蛋白质表达量及细胞增值率均较转染对照质粒组明显降低;转染后48 h c-myc siRNA组细胞凋亡率为(19.90±2.09)％,明显高于siRNA阴性对照组(4.93±0.25)％和空白对照组(4.40±0.34)％;Transwell实验结果示细胞穿膜数c-myc siRNA组[(34.3±1.2)个]较siRNA-NC组[(68.3±5.8)个]和空白组[(72.3±1.2)个]均明显降低.结论 c-myc siRNA能够显著抑制c-myc基因在人胰腺癌SW1990细胞中的表达,降低细胞的增殖和迁移能力,促进细胞的凋亡.     

小干扰RNA抑制人端粒酶逆转录酶基因对胃癌细胞增殖的影响

目的 应用小干扰RNA(siRNA)技术特异性抑制人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因在胃癌SGC7901细胞中的表达,观察其对细胞增殖的影响.方法 hTERT基因的RNA干扰表达重组体用脂质体介导方法转染SGC7901细胞.荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测hTERT基因表达.TRAP-PCR法检测端粒酶活性、噻唑蓝(MTT)比色法检测细胞增殖.结果 SGC7901细胞转染前后hTERT基因的表达强度分别为:转染pU6组平均表达量为6.5×105拷贝/μg RNA;转染pU6-hTERT-siRNA Ⅰ组平均表达量为4.1 × 104拷贝/μg RNA;转染pU6-hTERT-siRNAⅡ组平均表达量为5.4×104拷贝/μg RNA.转染pU6组与其余两组P值<0.01;转染pU6-hTERT-siRNA Ⅰ组和转染pU6-hTERT-siRNAⅡ组P值>0.05.端粒酶活性下降,细胞生长速度明显减慢.结论 小干扰RNA能有效抑制SGC7901细胞中hTERT基因表达,hTERT基因表达下调影响SGC7901细胞增殖.     

RNA干扰技术及其在男科学研究中的应用

RNA干扰(RNA interference,RNAi),是一种在动植物中存在的通过双链RNA诱导同源特异性序列转录后基因沉默的过程。RNAi在抵抗病毒感染、抑制转座子活动、调控内源性基因表达等方面发挥着重要作用,已成为当前生物医学的研究热点之一。近年来,RNAi作为一种研究工具,已开始应用于ED、PCa及精子发生等男科学研究中,并取得了一定进展。本文就RNAi的基本原理、研究进展及其在男科学研究中的应用作一概述。     

非病毒靶向载体递送小干扰RNA的研究进展

近年来由小干扰RNA(siRNA)所介导的RNA干扰(RNAi)技术发展迅速,如何高效、安全地将siRNA转运至靶组织是决定这一技术应用前景的关键问题。本文重点围绕构建siRNA的非病毒靶向载体递送系统的研究进展进行综述。     

RNA干扰沉默hTERT基因对大肠癌SW480细胞生物学特性的影响

目的 观察人端粒酶催化亚单位(hTERT)基因对SW480细胞生物学特性的影响.方法 将重组质粒pGPU6/GFP/Neo-hTERT-shRNA (hTERT-shRNA)用脂质体转染法导人大肠癌细胞株SW480,实验分4组,每组设3个复孔,分别于转染后24、48、72 h,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测hTERT mRNA的表达,免疫细胞化学法检测hTERT蛋白表达,PCR-TRAP-ELISA法检测端粒酶活性,流式细胞仪检测细胞周期分布,终端脱氧核苷酸转移酶介导的缺口末端标记(TUNEL)法和透射电镜观察细胞凋亡变化及共聚焦显微镜观察线粒体膜电位(MMP)的改变.结果 转染后48 h hTERT-shRNA组hTERT mRNA相对表达量为0.32±0.03,hTERT蛋白表达的平均灰度值为209.60±17.10,端粒酶A450 ～ A630值为2.242±0.284,较其他对照组均明显降低(P＜0.05,P＜0.01);G0/G1期细胞为(49.37±1.63)％,增殖指数为(50.60±1.57)％,凋亡指数为22.2％,较其他对照组均明显增高(P ＜0.05,P＜0.01);凋亡细胞体积明显缩小,表面突起和微绒毛减少,甚至消失,线粒体Rhodamine 123平均荧光强度为719.99±17.08,MMP水平显著下降(P＜0.01).结论 RNA干扰(RNAi)沉默hTERT基因能有效抑抑制SW480肿瘤细胞生长,并降低端粒酶活性,诱导肿瘤细胞凋亡.     

小干扰RNA技术与骨质疏松症治疗

以骨量减少、骨微结构破坏为主要特征的骨折疏松症及其所致骨折严重影响人均寿命及生活质量,目前的治疗方法因多种原因并不能很好地解决相关问题。RNA干扰是一种序列特异的转录后基因沉默技术,通过小干扰RNA技术可以特异性调控蛋白表达,达到靶向治疗目的。该文就小干扰RNA技术在骨质疏松症治疗方面的研究作一综述。     

靶向突变K-ras基因的小干扰RNA体内外抑制肺癌细胞生长的研究

目的探讨应用小于扰RNA（siRNA）敲除突变K-ms基因对肺癌细胞H441体内外生长的抑制作用。方法构建真核表达载体pSilencer3．1-K-ras^v12,转染H441细胞后应用半定量RT-PCR及Westernblotting检测突变K-l＇as基因mRNA及蛋白质的表达变化,噻唑蓝法检测H441细胞增殖速度的变化,流式细胞仪检测H441细胞凋亡率的变化。裸鼠皮下移植pSilencer3．1-K-ras^v12。处理的H441细胞,观察其成瘤性的改变。结果测序证实pSilencer3．1-K-ras^v12。真核表达载体构建成功。RT-PCR灰度比值结果示空载体组、阴性对照组、实验组K-rasmRNA相对表达量分别为：93．7％±2．2％、95．1％±2．5％、43．6％±3．1％,差异有统计学意义（F=78,P〈0．01）;Westernblotting结果示空载体组、阴性对照组、实验组K-ms蛋白相对表达量分别为：98．1％±2．4％、97．5％±2．0％、33．5％±3．7％,差异有统计学意义（F=93,P〈0．01）;经pSilencer3．1-K-ras^v12。作用的H441细胞生长受到明显抑制（P〈0．05）,凋亡率较对照组明显升高（F=8．9,P〈0．01）,H441细胞在裸鼠体内生长受到明显抑制。结论靶向突变K-ras基因的siRNA可以抑制肺癌H441细胞在体内外的生长速度,诱导细胞凋亡,为肺癌的基因治疗提供了新的思路和方法。     

小干扰RNA对LNcap细胞CXCR4基因表达的影响

目的:研究小干扰RNA(siRNA)对LNcap细胞中CXC趋化因子4(CXCR4)基因表达的影响。方法:用针对CXCR4基因的siRNA表达质粒pSilencer-CXCR4转染人前列腺癌细胞株LNcap细胞,用RT-PCR方法检测其CXCR4基因表达水平的变化。结果:重组体pSilencer-CXCR4转染LNcap细胞后,能明显抑制CXCR4基因的表达;转染48 h后,其表达水平下降75%,与空白对照组和阴性对照组比较,其差异有统计学意义(P<0.01)。结论:利用RNA干扰技术能有效抑制靶基因的表达,为下一步有关CXCR4的研究奠定一定的基础。     

RNA干扰沉默EZH2基因增强人肝癌多药耐药Bel/Fu细胞对氟尿嘧啶的敏感性

目的 研究沉默人肝癌多药耐药Bel/Fu细胞的EZH2基因表达是否影响癌细胞对氟尿嘧啶( fluorouracil,5-Fu)的敏感性.方法 体外培养肝癌多药耐药Bel/Fu细胞;EZH2 siRNA干扰沉默EZH2基因表达;RT-PCR和Western blot检测干扰后EZH2 mRNA和蛋白的表达水平;MTT法检测细胞生长抑制率;Annexin V-FITC/PI双标记法检测细胞凋亡率;流式细胞仪分析细胞周期;Western blot检测多药耐药相关蛋白MDR1的表达水平.实验设对照组、5-Fu处理组、EZH2 siRNA处理组、5-Fu和EZH2 siRNA联合处理组.结果 EZH2 siRNA干扰24h后,EZH2 mRNA和蛋白的表达水平明显降低.在联合处理组中,MTF法检测其细胞凋亡抑制率为43.17％±3.81％,明显高于其他3组;流式检测联合处理组细胞凋亡率,其细胞凋亡值为30.4％±1.77％,明显高于其他3组.流式检测联合处理组细胞周期,发现联合组G1期细胞的百分比为69.16％±2.31％,明显高于其他3组,S+G2 +M期细胞的百分比为30.76％±1.29％,明显低于其他3组,细胞周期被阻滞于G1期.检测MDR1在联合组中的表达水平,发现MDR1蛋白的表达水平明显低于其他组别.结论 RNA干扰沉默EZH2基因可以增强Bel/Fu细胞对5-Fu的敏感性,其机制可能与MDR1蛋白表达降低有关.     

Atrogin-1基因沉默对肌细胞营养不良保护作用的实验研究

目的 采用肿瘤坏死因子α(TNF-α)诱导的肌细胞营养不良模型和核糖核酸干扰技术,研究Atrogin-1基因沉默对肌细胞营养不良的保护作用.方法 设计5对Atrogin-1-siRNA靶序列及对照序列,逐步克隆到慢病毒核心载体FG12中,重组FG12与三种包装质粒(pRSVREV、pMDLg/pRRE、pHCMV-G)共同转染293T细胞以包装病毒,感染C2C12细胞,并将其分化成肌管,用TNF-α进行刺激,实时荧光定量PCR法、Western blot法检测肌管中Atragin-1表达,观察比较各组肌管的形态学变化.结果 重组载体中含大小、序列正确的片段,能成功感染C2C12细胞,TNF-α能引起对照组肌管Atrogin-1表达上调、肌管萎缩,但RNA干扰组肌管无此现象.结论 沉默Atrogin-1基因可避免产生TNF-α诱导的肌细胞营养不良,Atrogin-1基因可作为肿瘤恶液质的理想治疗靶点.     

靶向垂体特异转录因子-1的小干扰RNA对大鼠生长激素垂体腺瘤GH3细胞生物学行为的影响

目的 观察小干扰RNA (siRNA)抑制大鼠垂体生长激素腺瘤细胞(GH3)中垂体特异转录因子-1(Pit-1)的基因表达对其生物学行为的影响.方法 设计合成针对Pit-1基因的siRNA,经脂质体包裹转染GH3细胞.采用Western blot、逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法测定经siRNA转染24 h后;Pit-1蛋白和Pit-1 mRNA表达;用细胞计数试剂盒(CCK-8)细胞增殖-毒性检测法检测细胞生长增殖的变化;用流式细胞仪检测细胞凋亡的改变;制备Transwell小室测定GH3细胞体外侵袭能力的变化.结果 siRNA显著地抑制Pit-1蛋白和Pit-1 mRNA的表达水平,分别降低58.18％和75.82％;CCK-8法结果显示siRNA组细胞增长率明显低于与阴性对照组;流式细胞仪分析显示,siRNA组细胞凋亡率[(9.250 00±0.996 95)％]较阴性对照组[(2.893 30±0.665 16)％]增加;,siRNA组穿过Matrigel胶及滤膜的细胞数[(92.91±53.25)个],与阴性对照组[(7.50±7.95)个]比较侵袭力明显减弱,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 Pit-1 siRNA能够有效地抑制GH3细胞的生长、促进其凋亡,降低侵袭力.     

靶向沉默Notch1基因对人膀胱癌细胞生物学行为的影响

目的 探讨沉默Notch1基因对人膀胱癌细胞生物学行为的影响. 方法 将靶向Notch1的siRNA真核表达载体psiRNA Notch1-1转染膀胱癌细胞株T24和BIU-87,噻唑盐法、流式细胞术检测沉默Notch1后膀胱癌细胞生长、细胞周期和凋亡情况.RT-PCR和蛋白质印迹法检测转染前后Notch1基因mRNA和蛋白表达的变化. 结果 转染后72 h,T24和BIU-87细胞G0/G1期细胞比例明显增加,分别为(80.13±2.69)%和(69.44±2.41)%,与T24对照组(23.89±1.32)%和BIU-87对照组(24.63±1.68)%比较差异有统计学意义(P值均<0.05).转染后72 h,T24和BIU-87细胞凋亡率分别为(13.75±1.23)%和(8.72±1.01)%,与T24对照组(1.28±0.14)%和BIU-87对照组(1.01±0.27)%比较差异均有统计学意义(P值均<0.05).转染后24 h细胞生长明显受到抑制,该抑制作用持续到转染后96 h.转染后72 h,T24和BIU-87细胞中Notch1基因mRNA和蛋白表达明显下调(P<0.05). 结论 Notch1在膀胱癌细胞株中可能起致癌作用.沉默Notch1基因能够抑制膀胱癌细胞的增殖.     

siRNA诱导EZH2基因增强子的表观沉默及其对人前列腺癌细胞的增殖抑制

目的 通过小分子RNA(siRNA)介导靶基因沉默技术,干扰前列腺癌细胞中果蝇zeste基因增强子的人类同源物的表达,以探讨靶向EZH2基因的RNAi对前列腺癌细胞增殖抑制的效应.方法 设计靶向EZH2基因的RNA干扰(RNAi)载体,构建重组表达质粒并且转染人前列腺癌细胞22RV1.利用MTT比色法检测靶向沉默EZH2表达对于22RVl的增殖抑制的影响:利用qRealtime-PCR鉴定转染组与空白组细胞中EZH2基因mRNA的表达量;提取各组细胞的总蛋白,利用Western Blotting检测EZH2蛋白的表达情况.结果 在转染了靶向EZH2基因siRNA的细胞株中,可以检测到EZH2表达呈明显的下调趋势:而在空白对照组中其表达很稳定.另外,诱导EZH2基因沉默可以抑制该前列腺肿瘤细胞的增殖和生长.上述结果 在各组细胞间旱现明显的统计学差异(P<0.05).结论 siRNA诱导的RNAi可以有效的抑制其靶基因EZH2的表达,同时可以抑制前列腺癌细胞的增殖和生长,是一种潜在的基因治疗新方法 .     

siRNA沉默高迁移率蛋白A2基因对人膀胱移行细胞癌细胞T24增殖凋亡的影响

目的 观察siRNA靶向沉默HMGA2基因在人膀胱移行细胞癌T24细胞中表达的变化,探讨抑制HMGA2基因对T24细胞增殖、周期和凋亡的影响.方法 针对人HMGA2基因构建siRNA干扰片段,瞬时转染T24细胞后,采用Western-blot方法检测转染siRNA干扰片段48h后T24细胞蛋白表达量的变化,CCK-8法检测T24细胞增殖和流式细胞仪（FCM）检测T24细胞周期和凋亡情况.结果 转染后48h的T24细胞HMGA2蛋白表达水平较空白对照组（CON）和阴性对照组（NC）显著下降,差异有统计学意义（P＜0.05）,转染HMGA2-siRNA的实验组抑制T24细胞增殖,T24细胞S期细胞比例（35.47±0.23）％高于CON组和NC组（P＜0.05）,实验组T24细胞凋亡率为（17.25±0.24）％,明显高于CON组和NC组（P＜0.05）.结论 HMGA2基因的特异性siRNA可以抑制T24细胞增殖,细胞周期阻滞在S期,并促进其凋亡.     

沉默RelB表达诱导耐受性树突状细胞产生

目的 利用RelB短发卡RNA(shRNA)慢病毒转染树突状细胞(DC)诱导耐受性DC的产生.方法 将Lenti-RelB shRNA转染未成熟DC后,应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot检测DC中RelB的表达;流式细胞仪检测DC凋亡以及表型分子人类主要组织相容性复合体(MHC)-Ⅱ、CD80、CD86、CD83的表达;酶联免疫吸附试验(ELISA)检测分泌的细胞因子白细胞介素(IL)-10、IL-12、转化生长因子-β1(TGF-β1)以及核因子(NF)-κB各亚基的DNA结合活性.结果 比较不成熟组、成熟组、空载体对照组DC 、Lenti-RelB shRNA-DC下调RelB的表达;而凋亡率同其余3组比较差异无统计学意义(P＞0.05);同时下调DC表型分子MHC-Ⅱ(0.34±0.04)、CD80(0.38±0.03)、CD86(0.17 ±0.02)、CD83(0.21 ±0.02)的表达;转染后的DC低表达IL-12[(96.3±32.8)ng/L],高表达IL-10[(218.2 ±43.3) ng/L];而RelB的DNA结合活性(0.28±0.06)较其他组显著下降,但其他亚基的DNA结合活性各组差异无统计学意义(P＞0.05).结论 利用LentiRelB shRNA沉默RelB表达可体外诱导耐受性DC的产生.