唾液Histatin 5突变体在巴斯德毕赤酵母中的优化表达

目的通过优化重组毕赤酵母GS115-pPICZα-A-HRP5′表达条件,提高表达水平,增强产物抗菌活性。方法将培养基甘油含量、pH、诱导前培养时间、甲醇诱导量、诱导后培养时间设置不同梯度,采用琼脂孔穴扩散法比较各梯度下表达产物抗菌活性。结果以pH6.0、甘油含量2.0%YEPG培养基、培养30h后用1.5%甲醇诱导培养48h,表达产物抗菌活性最高。结论优化条件为HRP5′的大规模发酵奠定了基础。     

人纤溶酶原K5突变体在大肠杆菌中的优化表达

 【目的】 降低成本，增大产出，提高K5突变体（mK5）在原核系统的单位表达量。 【方法】 调整可能影响表达的参数：抗生素浓度、pH、A600值、IPTG终浓度、诱导时间、诱导温度，同时固定其它参数。通过电泳分析，获得mK5在原核系统pET22b-BL21的最优表达条件；组氨酸结合柱亲和层析、纯化获得mK5蛋白，SDS-PAGE和Western-blot方法鉴定mK5蛋白；MTT法分析mK5对人视网膜毛细血管内皮细胞（HRCEC）增殖的影响。【结果】 优化后的表达条件为：最适细菌培养温度为37℃，最佳抗生素浓度为50μg/mL羧苄青霉素，最适pH值为7.0，在A600为0.9～1.0时加入终浓度为1.0 mmol/L的IPTG为最佳诱导条件，37℃诱导10 h为最佳诱导时间；优化条件后mK5纯化蛋白得率为21 mg/L，产量较优化前(15 mg/L)提高近30％；mK5特异性地抑制HRCEC的增殖，IC50=40 nmol/L。【结论】 本研究确定了mK5蛋白诱导表达的最适参数，并获得具有生物活性的高纯度、高表达量的重组蛋白，为工业化大规模发酵生产提供了基本参数。     

人纤溶酶原K5突变体在大肠杆菌中的优化表达

【目的】提高K5突变体（mK5）在原核系统的单位表达量。【方法】调整可能影响表达的参数：抗生素浓度、pn、A600值、IPTG终浓度、诱导时间、诱导温度，同时固定其它参数。通过电泳分析，获得mK5在原核系统pET22b-BL21的最优表达条件；组氨酸结合柱亲和层析、纯化获得mK5蛋白，SDS-PAGE和Western-blot方法鉴定mK5蛋白；MTT法分析mK5对人视网膜毛细血管内皮细胞（HRCEC）增殖的影响。【结果】优化后的表达条件为：最适细菌培养温度为37℃．最佳抗生素浓度为50μg／mL羧苄青霉素．最适pH值为7．0,在A600为0．9～1．0时加入终浓度为1．0mmol／L的IPTG为最佳诱导条件，37℃诱导10h为最佳诱导时间；优化条件后mK5纯化蛋白得率为21mg／L．产量较优化前（15mg／L）提高近30％：mK5特异性地抑制HRCEC的增殖．IC50=40nmol／L。【结论】本研究确定了mK5蛋白诱导表达的最适参数．并获得具有生物活性的高纯度、高表达量的重组蛋白，为工业化大规模发酵生产提供了基本参数。     

人MT-1E融合蛋白在大肠杆菌中的表达及纯化

目的：体外表达人源性MT-1E融合蛋白并进行纯化。方法：采用RT-PCR方法获得人MT-1E基因的编码区，将其克隆入原核表达载体pQE40，并在大肠杆菌M15中表达，对蛋白的表达形式及诱导条件进行分析。用Ni-NT agarose亲和层析柱纯化目的蛋白。结果：重组蛋白在原核细胞中以可溶和不可溶两种表达形式存在。但以不可溶性形式为主。表达量随诱导时间延长而增加，在诱导8h时目的蛋白约占菌体总蛋白的32％。经亲和层析获得较高纯度的人MT-1E融合蛋白。结论：利用基因重组原核表达技术获得较纯的人源性MT-lE融合蛋白。为进一步研究金属硫蛋白的功能及特异性抗体的制备奠定了基础。     

GST-p60PLAD融合蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达和纯化

目的:制备GST-p60PLAD融合蛋白. 方法:依据人p60PLAD氨基酸序列,根据大肠杆菌偏爱密码子进行反翻译,获得适合在大肠杆菌中表达的基因序列. 根据该基因序列设计五条引物,用重叠延伸PCR法获得编码人p60PLAD的基因,进而将其克隆入原核表达载体pGEX-4T-2中,转化大肠杆菌BLR(DE3)polys. 经IPTG诱导表达后收集菌体,超声裂解,将上清液经GSTrapFF亲和层析柱纯化、经HiTrap脱盐柱脱盐,用SDS-PAGE进行分析. 结果:成功构建重组质粒pGEX-4T-2-p60PLAD,经DNA 测序证实插入序列与设计完全一致. 并在大肠杆菌中高表达出Mr约为34×103大小具有可溶性的目的蛋白,经亲和层析柱纯化后获得纯度很高的GST-p60PLAD融合蛋白. 结论:成功制备了高纯度的GST-p60PLAD融合蛋白,为进一步探讨p60PLAD蛋白的结构和生物学活性提供必要的物质基础.     

My027融合蛋白表达载体构建及其在大肠杆菌的表达

目的探索My027蛋白的体外表达,通过原核表达获得大量可溶性My027融合蛋白。方法逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法扩增出My027片段,插入原核表达载体pGEX-4T-2,构建质粒pGEX-My027。转化BL-21菌,IPTG低温诱导表达融合蛋白,亲和层析法获得融合蛋白,采用十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)、Western印迹法及质谱进行鉴定。结果融合蛋白以水溶形式分泌于大肠杆菌BL-21胞质中,纯化后的目的蛋白经SDS-PAGE、Western印迹法及质谱证实高效表达,氨基酸序列正确。结论人脂肪细胞新蛋白My027在pGEX-4T-2原核表达载体可获高效表达,为进一步研究其功能奠定基础。     

人MT-1E融合蛋白在大肠杆菌中的表达及纯化

目的 :体外表达人源性MT 1E融合蛋白并进行纯化。方法 :采用RT PCR方法获得人MT 1E基因的编码区 ,将其克隆入原核表达载体pQE4 0 ,并在大肠杆菌M15中表达 ,对蛋白的表达形式及诱导条件进行分析 ,用Ni NTagarose亲和层析柱纯化目的蛋白。结果 :重组蛋白在原核细胞中以可溶和不可溶两种表达形式存在 ,但以不可溶性形式为主 ,表达量随诱导时间延长而增加 ,在诱导 8h时目的蛋白约占菌体总蛋白的 32 %。经亲和层析获得较高纯度的人MT 1E融合蛋白。结论 :利用基因重组原核表达技术获得较纯的人源性MT 1E融合蛋白 ,为进一步研究金属硫蛋白的功能及特异性抗体的制备奠定了基础。     

瑞替普酶融合蛋白在大肠杆菌中表达条件的优化及其复性

目的:为优化瑞替普酶(reteplase,r-PA)在大肠杆菌中的高效融合表达的条件,并提高其复性率。方法:通过改变诱导时间和温度、诱导剂浓度、培养基pH值及氨苄青霉素(Amp)浓度等条件,利用SDS-PAGE分析以上条件的改变对表达产物产量的影响。运用金属螯合层析对融合蛋白进行纯化和复性。结果与结论:LB培养基pH值为6,Amp浓度为100μg/mL,乳糖浓度为5 mmol/L的条件下39℃诱导4 h可获得高效表达的r-PA融合蛋白,其表达量占全菌蛋白的70%,其产物主要以包涵体形式存在。融合蛋白运用金属螯合层析一步纯化复性,其复性率可达10%,比活为55.7 U/μL。     

Thanatin突变体在大肠杆菌中的表达及纯化

目的:在大肠杆菌中克隆表达thanatin突变体(Th-T)蛋白并纯化. 方法:PCR合成Th-T基因并克隆到pET32a载体的BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点之间,构建Th-T原核表达载体(pET32a-Th-T)并转化到大肠杆菌BL21融合表达,通过正交实验优化表达条件,His-Bind介质纯化.考察经酶切纯化后的重组Th-T对4种供试菌的最低抑制浓度.结果:菌体在LB培养基(pH 6.5)培养4.5 h,IPTG 0.4 mmol·L-1诱导7 h,Th-T融合蛋白大量可溶性表达,经药敏试验证明纯化的重组Th-T具有预期的抗菌活性.结论:本研究为通过大肠杆菌体系表达重组Th-T抗菌药物奠定了基础.     

血小板生成素突变体融合蛋白表达及纯化研究

目的：用大肠杆菌融合蛋白表达载体pMAL—c2构建人血小板生成素突变体融合蛋白表达质粒pMAL-TPOM。方法：采用基因重组和表达、SD-聚丙烯酰胺凝胶电泳和蛋白纯化技术。结果：SDS-PAGE分析表明，IPTG诱导5h后大肠杆菌JM109表达到最高水平，约占大肠杆菌菌体总体蛋白的36．6％。除了大肠杆菌RR1不表达以外，大肠杆菌DH5a、H101均有较高水平的表达，表达产物血小板生成素突变体融合蛋白经SephacyIS-200和DEAE-SepharoseFF层析纯化后，蛋白纯度约为87．6％。结论：人血小板生成素突变体融合蛋白在大肠杆菌JM109、DH5a和H101中均获得高效表达。     

GST-hCAP融合蛋白表达载体的构建及其在原核细胞中的表达

目的:构建GST标签的人c-Cbl相关蛋白(GST-hCAP)融合蛋白表达载体,并在大肠埃希菌(E.coli)中诱导其表达.方法:从COS-1细胞中提取mRNA,反转录为cDNA.用PCR方法扩增出hCAP基因全长,通过EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位点将其定向插入pGEX-5X-1载体中,构建原核表达质粒pGEX-5X-1-hCAP,并转化E.coli DH5α,通过限制性内切酶酶切电泳和DNA测序鉴定正确后,转入E.coli BL21中,经异丙基硫代β-D半乳糖苷大量诱导表达,SDS-PAGE电泳和Western blot鉴定.结果:酶切电泳及测序结果证明,原核表达质粒GST-hCAP构建成功,用Western blot方法也证实了GST-hCAP融合蛋白的表达.结论:成功地构建了GST-hCAP原核表达载体,证实了其在原核细胞大肠埃希菌中的表达,为进一步纯化CAP及研究其结构与功能提供了前提基础.     

融合蛋白表达载体的构建及在大肠杆菌中的表达

目的构建人类regucalc in重组原核表达载体。方法用RT-PCR的方法从人类肝癌细胞系HepG2中扩增出regucalc in基因cDNA序列,应用T克隆载体及pET-32 a(+)表达载体后,将质粒转化进入原核表达菌株进行表达。结果表达产物经SDS-PAGE电泳分析后,在45 000处有一明显表达条带,与理论结果相符。结论成功构建融合表达载体Pet-regucalc in,并在原核细胞中表达出人类regucalc in-H is融合蛋白。     

突触融合蛋白6 与突触融合蛋白8 的表达 在胃癌预后中的价值

目的 分析突触融合蛋白6（STX6）和突触融合蛋白8（STX8）在胃癌中与临床病理特征的关系, 评价STX6 和STX8 对胃癌的预后价值。方法 利用Kaplan-Meier plotter（KM plotter）在线数据库收集882 例胃 癌患者病理信息,分析STX6、STX8 表达与胃癌患者预后的关系。结果 STX6 mRNA 高表达与胃癌患者较好的 总生存期（OS）相关（P <0.05）,风险比[H^R=0.70（95%CI ：0.57,0.86）]。STX6 mRNA 表达与胃癌患者 的Lauren 分型中混合型、淋巴结转移状态、无远处转移及HER2 状况相关（P <0.05）。STX8 mRNA 高表达 与胃癌患者较好的OS 相关（P <0.05）,风险比[H^R=0.75（95%CI ：0.63,0.89）]。STX8 mRNA 表达与胃癌 患者的临床分级的Ⅱ级和Ⅳ级、Lauren 分型中肠型和弥漫型、无远处转移及HER2 阴性相关（P <0.05）。结 论 利用在线数据库,发现STX6、STX8 mRNA 的表达水平与胃癌患者的预后密切相关,高表达的患者预后 更好,可以作为胃癌潜在的预后指标进行研究。     

SARS冠状病毒受体结合域在大肠杆菌中的融合表达和鉴定

目的为了研究SARS冠状病毒感染与免疫和跨种属传播机制,从来源于人和果子狸的SARS冠状病毒spike蛋白基因中,克隆病毒受体结合域（receptor binding domain,RBD）基因片段,在大肠杆菌中进行表达。方法用PCR方法扩增RBD基因,先经T-A连接,转化大肠杆菌DH5α,挑选阳性克隆测序鉴定,双酶切后进一步亚克隆至质粒pGEX-6p-3,构建原核表达重组质粒,通过IPTG诱导在大肠杆菌BL21中表达,并用SDS-PAGE和Western-blotting方法检测表达情况。结果扩增了RBD的编码基因并成功构建了其原核表达载体pGEX-6p-3-hsRBD和pGEX-6p-3-csRBD,RBD能够在大肠杆菌中获得良好的表达,表达的融合蛋白相对分子质量约为47000。结论本工作利用基因工程技术表达了两物种来源的SARS冠状病毒的RBD,两者具有高度的同源性,因此我们可通过配基受体结合实验,为进一步研究SARS冠状病毒感染与免疫及跨种属传播机制奠定了基础。     

泡球蚴Em18重组蛋白在大肠杆菌中的表达和纯化方法的优化

目的：筛选和优化泡球蚴Em18重组蛋白在大肠杆菌中表达和纯化的方法,为进一步筛选Em18抗原表位奠定基础.方法：原核表达pET41a-Em18重组质粒,经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）诱导、表达,获得rEm18-GST蛋白,采用不同的超声程序破碎大肠杆菌细胞,分别采用GST柱、His柱及两者结合方法,改变不同的平衡、洗涤和洗脱缓冲液浓度,纯化rEm18-GST蛋白.结果：（1） rEm18-GST蛋白在相对分子质量为50 kDa处有表达条带,蛋白表达量随诱导时间的延长而增加;（2）超声程序为工作1 s,间歇3 s,每个循环时程10 min,加入蛋白酶抑制剂,可降低目的蛋白的降解;（3）采用单纯His柱可获得回收量高、纯度高的rEm18-GST蛋白.结论：（1）对含有GST-tag和His-tag双重标签重组蛋白的纯化,应用His柱更有效,更经济;（2）建立和优化一套从大肠杆菌细胞中分离纯化重组Em18蛋白的有效方法.     

TTV蛋白抗原在大肠杆菌中的表达

目的：用原核系统表达TTV的重组蛋白抗原,建立诊断TTV感染的特异性方法。方法：采用PCR方法扩增TTV ORF2基因,将之插入到测序质粒载体中进行测序,验证序列正确后再嵌入到原核表达载体pQE30,并转化大肠杆菌M15菌株,进行诱导表达。用SDS－PAGE分析表达产物。表达产物经Ni-NTA 柱层析纯化后,得到纯度为90％的ORF蛋白抗原。用TTV感染者的阳性血清对该蛋白进行了Western-Blot Blotting。结果：经IPTG诱导后,筛选出2株高表达株。结论：该蛋白具有良好的抗原活性。     

大鼠内皮抑素在大肠杆菌中的融合表达及活性鉴定

目的获得有活性的内皮抑素融合蛋白。方法利用已成功转化的pthiohis-Endo融合表达重组子的大肠杆菌TOP10,在IPTG诱导下表达融合蛋白,亲和层析方法纯化,纯化产物经EK酶酶切后行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳及Western-blot鉴定;MTT法鉴定其对人脐静脉内皮细胞增殖的影响。结果纯化后的内皮抑素的融合蛋白经EK酶酶切行聚丙烯酰胺电泳和Western-blot鉴定与预期相符,并能抑制人脐静脉内皮细胞增殖。结论大鼠内皮抑素基因在大肠杆菌中获得成功表达,表达的融合蛋白能够抑制人脐静脉血管内皮细胞的增殖。     

血小板生成素突变体融合蛋白表达及纯化研究

目的：用大肠杆菌融合蛋白表达载体ｐＭＡＬ－ｃ２构建人血小板生成素突变体融合蛋白表达质粒ｐＭＡＬ－ＴＯＰＭ，方法：采用基因重组和表达，ＳＤＳ－聚丙烯酰胺胶电泳和蛋白纯化技术。结果：ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析表明，ＩＰＴＧ诱导５ｈ后大肠杆菌ＪＭ１０９表达到最高水平，约占大肠杆菌菌体总体蛋白的３６．６％，除了大肠杆菌ＲＲ１不表达以外，大肠杆菌ＤＨ５αＨ１０１均有较高水平的表达，表达产物血小板生成素突变体融合蛋