糖基化终产物对人肾小球系膜细胞半乳糖凝集素-3基因表达的影响

目的:研究糖基化终产物(AGEs)对人肾小球系膜细胞半乳糖凝集素-3(galectin-3)表达的影响。方法:将培养的人肾小球系膜细胞(HRMC)用不同浓度(50、100、200及400 mg.L-1)的AGEs干预24 h或同一浓度(200 mg.L-1)的AGEs干预0、24、48及72 h,以无血清培养基(DMEM)和相应浓度的牛血清白蛋白(BSA)为对照。用RT-PCR检测细胞中半乳糖凝集素-3的mRNA水平。结果:不同浓度AGEs组HRMC的半乳糖凝集素-3 mRNA水平与对照组相比均有显著差异(P<0.01),且随着AGEs浓度的增高,半乳糖凝集素-3 mRNA水平也逐渐增高(P<0.05);AGEs干预HRMC 24、48、72 h,半乳糖凝集素-3mRNA水平与对照组相比有显著差异(P<0.05),且随着干预时间的延长,半乳糖凝集素-3 mRNA水平也逐渐增高(P<0.01)。结论:AGEs以时间及剂量依赖的方式促进HRMC半乳糖凝集素-3 mRNA的表达。     

晚期糖基化终末产物对巨噬细胞Nampt表达的影响

目的探讨晚期糖基化终末产物(AGEs)对巨噬细胞尼克酰胺磷酸核糖转移酶(Nampt)表达的影响。方法以人单核细胞株THP-1为体外细胞干预模型,经佛波酯诱导分化为巨噬细胞后,以0(阴性对照组)、50、100、250、500、1 000μg/mL的AGEs干预12 h,采用Western blotting方法检测细胞Nampt蛋白表达。以Western blotting检测结果选择合适浓度的AGEs处理巨噬细胞,分别于干预后0(阴性对照组)、3、6、12、24 h时点收集细胞,采用实时定量聚合酶链式反应(Real-Time PCR)技术和Westernblotting方法检测巨噬细胞Nampt mRNA和蛋白表达。结果在50～500μg/mL的浓度范围内,AGEs处理组巨噬细胞Nampt蛋白表达量均显著高于阴性对照组(P<0.01),且随干预浓度的升高呈现逐渐上升趋势,250μg/mL和500μg/mL AGEs处理组的干预效应最显著,设定后续实验中以250μg/mL AGEs对巨噬细胞进行干预。250μg/mL AGEs处理组巨噬细胞干预后各时点的Nampt mRNA和蛋白表达量均显著高于阴性对照组(P<0....     

特异性抑制单核细胞中EMMPRIN基因表达的siRNA筛选和鉴定

目的设计合成干扰细胞外基质金属蛋白酶诱导因子(EMMPRIN)基因表达的不同小型干扰RNA(siRNA),筛选出能高效抑制单核/巨噬细胞中EMMPRIN表达的siRNA。方法根据人源EMMPRIN mRNA的序列,设计合成3对不同的且能干扰EMMPRIN基因表达的siRNA,将其转染THP-1单核细胞株,采用荧光定量PCR和蛋白印迹法评价基因表达情况。结果设计合成的3对siRNA中的2对siRNA可以特异性抑制单核细胞中EMMPRIN mRNA和蛋白表达(分别减少70%和50%,P<0.05)。结论成功设计合成了针对EMMPRIN基因的siRNA,并从中筛选出能特异且高效阻断EMMPRIN表达的siRNA,为进一步研究EMMPRIN基因对动脉粥样硬化形成的影响及其临床应用奠定了基础。     

晚期糖基化终末产物对巨噬细胞Nampt表达的影响

目的 探讨晚期糖基化终末产物(AGEs)对巨噬细胞尼克酰胺磷酸核糖转移酶(Nampt)表达的影响.方法 以人单核细胞株THP-1为体外细胞干预模型,经佛波酯诱导分化为巨噬细胞后,以0(阴性对照组)、50、100、250、500、1 000μg/mL的AGEs干预12 h,采用Western blotting方法检测细胞Nampt蛋白表达.以Western blotting检测结果选择合适浓度的AGEs处理巨噬细胞,分别于干预后0(阴性对照组)、3、6、12、24 h时点收集细胞,采用实时定量聚合酶链式反应(Real-Time PCR)技术和Western blotting方法检测巨噬细胞Nampt mRNA和蛋白表达.结果 在50～500μg/mL的浓度范围内,AGEs处理组巨噬细胞Nampt蛋白表达量均显著高于阴性对照组(P＜0.01),且随干预浓度的升高呈现逐渐上升趋势,250μg/mL和500μg/mL AGEs处理组的干预效应最显著,设定后续实验中以250μg/mL AGEs对巨噬细胞进行干预.250μg/mL AGEs处理组巨噬细胞干预后各时点的Nampt mRNA和蛋白表达量均显著高于阴性对照组(P＜0.01),且随干预时间的延长呈现逐渐上升趋势.结论 AGEs干预能促进巨噬细胞Nampt表达上调;提示AGEs 可能部分通过Nampt途径激活巨噬细胞而参与糖尿病动脉粥样硬化的发生过程.     

晚期糖基化终产物引起内皮细胞connexin43表达上调

目的研究晚期糖基化终产物(advanced glycation end products,AGEs)对体外培养的人脐静脉内皮细胞缝隙连接蛋白(gap junction protein)connexin43基因表达的影响。方法 D-葡萄糖孵育牛血清白蛋白制备糖基化牛血清白蛋白作为晚期糖基化终产物。体外常规培养的人脐静脉内皮细胞分为4组,分别为对照组,100、200和400mg/L AGEs干预组,干预24h后通过RT-PCR方法检测各组connexin43基因mRNA的表达有无差别;通过免疫荧光方法检测对照组和200mg/L AGEs干预组之间connexin43蛋白的表达水平有无差别。结果不同浓度(100、200、400mg/L)的AGEs干预24h均能引起人脐静脉内皮细胞con-nexin43基因mRNA的表达上调(P<0.01);200mg/L的AGEs干预24h引起人脐静脉内皮细胞connexin43基因的蛋白表达上调(P<0.01)。结论 AGEs体外短期干预可引起人脐静脉内皮细胞connexin43基因的mRNA和蛋白表达水平上调。     

晚期糖基化终产物对内皮细胞Connexin40基因表达的影响

目的 研究晚期糖基化终产物(advanced glycation end products,AGEs)对体外培养的人脐静脉内皮细胞缝隙连接蛋白Connexin40 基因表达的影响.方法 D- 葡萄糖孵育牛血清白蛋白制备糖基化牛血清白蛋白作为晚期糖基化终产物.体外常规培养的人脐静脉内皮细胞分为4组,分别为对照组、100mg/L AGEs 干预组、200mg/L AGEs 干预组和400mg/L AGEs 干预组,干预24h 后通过RT-PCR 方法检测各组Connexin40 基因mRNA 的表达有无差异;通过免疫细胞荧光方法检测对照组和200mg/LAGEs 干预组之间Connexin40 基因蛋白的表达水平有无差异.结果 不同浓度(100、200、400mg/L)的AGEs 干预24h 均能引起人脐静脉内皮细胞Connexin40 基因mRNA 的表达减少(均P＜0.01);200mg/L 的AGEs 干预24h 引起人脐静脉内皮细胞Connexin40基因的蛋白表达减少(P＜0.01).结论 AGEs 体外短期干预可引起人脐静脉内皮细胞Connexin40 基因的mRNA 和蛋白表达水平减少.     

糖基化终产物对人肾小球系膜细胞结缔组织生长因子及纤维连接蛋白基因表达的影响

目的：探讨体外培养条件下糖基化终产物（AGEs）对人肾小球系膜细胞结缔组织生长因子（CTGF）及纤维连接蛋白（FN）基因表达的影响。方法：用不同浓度体外制备的AGEs干预系膜细胞及同一浓度的AGEs干预细胞不同时间。应用RT-PCR检测细胞中CTGF和FN的mRNA水平。结果：随着AGEs干预浓度的增加或干预时间的延长,系膜细胞CTGF和FNmRNA水平与对照组相比显著上升。结论：AGEs可导致人肾小球系膜细胞CTGF和FNmRNA的表达增加,在糖尿病肾病的发生、发展中起一定作用。     

转化生长因子β_2对人视网膜色素上皮细胞Ⅰ型胶原蛋白表达和Smad 2/3磷酸化水平的影响

目的:探讨转化生长因子β2(TGF-β2)对人视网膜色素上皮(RPE)细胞Ⅰ型胶原蛋白(COLⅠ)表达及细胞内Smad 2/3蛋白磷酸化水平的影响。方法:传代培养人RPE-19细胞,采用不同浓度的TGF-β2(0.1,1,5,10μg/L)分别刺激RPE细胞6,12,24h。RT-PCR测定各个不同浓度、时间干预的RPE细胞COLⅠA2mRNA的表达,Western blot检测COLⅠ蛋白水平表达。选择干预效果最好的TGF-β2浓度刺激RPE细胞,检测各时间点RPE细胞内Smad 2/3蛋白磷酸化水平的变化。结果:不同浓度TGF-β2可刺激RPE细胞COLⅠA2mRNA及COLⅠ蛋白表达上调,其中10μg/L最明显,作用24h达到高峰,为对照组的2.74倍。各组间差异有统计学意义(P<0.05)。在浓度为10μg/L TGF-β2刺激24h后,细胞内Smad 2/3蛋白的磷酸化水平明显升高,是对照组的2.33倍,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:TGF-β2能以剂量和时间依赖的方式上调COLⅠA2mRNA及COLⅠ蛋白的表达,这种表达可能与TGF-β/smad通路中Smad 2/3蛋白的磷酸化水平相关。     

特异性抑制单核细胞中EMMPRIN基因表达的siRNA筛选和鉴定

目的 设计合成干扰细胞外基质金属蛋白酶诱导因子(EMMPRIN)基因表达的不同小型干扰RNA(siRNA),筛选出能高效抑制单核/巨噬细胞中EMMPRIN表达的siRNA.方法 根据人源EMMPRIN mRNA的序列,设计合成3对不同的且能干扰EMMPRIN基因表达的siRNA,将其转染THP-1单核细胞株,采用荧光定量PCR和蛋白印迹法评价基因表达情况.结果 设计合成的3对siRNA中的2对siRNA可以特异性抑制单核细胞中EMMPRIN mRNA和蛋白表达(分别减少70%和50%,P＜0.05).结论 成功设计合成了针对EMMPRIN基因的siRNA,并从中筛选出能特异且高效阻断EMMPRIN表达的siRNA,为进一步研究EMMPRIN基因对动脉粥样硬化形成的影响及其临床应用奠定了基础.     

氨基胍对糖基化终产物干预后人肾系膜细胞fractalkine表达的影响

目的观察氨基胍(AG)对体外制备的糖基化终产物(AGEs)诱导的人肾系膜细胞(HRMC)趋化因子fractalkine表达的影响。方法分别给予无血清的DMEM培养基、牛血清清蛋白(BSA)、糖基化终产物-牛血清清蛋白(AGE-BSA)干预HRMC,以及不同浓度AG与AGE-BSA共同干预HRMC 24 h;采用RT-PCR和Western-blot法分别检测HRMC fractalkine mRNA和蛋白表达。结果与DMEM、BSA组相比,AGE-BSA明显升高HRMC frac-talkine mRNA和蛋白表达(P<0.05),AG以浓度依赖的方式下调HRMC fractalkine mRNA和蛋白表达(P<0.05)。结论 AG可能通过拮抗AGEs对fractalkine表达的增加作用而发挥其肾脏保护作用。     

匹伐他汀片在中国健康人体的单、多剂量药动学

目的建立快速、灵敏的匹伐他汀人体内血药浓度的液相色谱-质谱测定法,研究匹伐他汀片在中国健康人体内的单、多剂量药动学。方法 30名健康志愿者随机分为3组,每组10人（男女各半）,分别口服匹伐他汀低、中、高3个剂量（1 mg、2 mg、4 mg）进行单剂量药动学研究,2 mg剂量组继续给药（每天1次,连续7 d）,进行多剂量药动学研究。采用HPLC-MS/MS法测定血浆中匹伐他汀的浓度,并采用PKS程序对试验数据进行处理,求算有关药动学参数。结果健康受试者单剂量给药1、2、4 mg匹伐他汀后主要的药动学参数：Cmax（30.89±11.05）μg.L-1、（74.02±35.71）μg.L-1、（123.70±26.37）μg.L-1;Tmax（0.78±0.18）h、（0.73±0.25）h、（0.70±0.16）h;T1/2（9.80±3.33）h、（10.81±1.96）h、（12.79±3.00）h;AUC0-48（90.51±31.10）μg.h.L-1、（225.89±82.71）μg.h.L-1、（350.15±70.25）μg.h.L-1;AUC0-∞（93.72±32.72）μg.h.L-1、（232.15±86.22）μg.h.L-1、（365.39±75.46）μg.h.L-1。中剂量组10名受试者多次口服受试药2 mg后主要药动学参数：Cmax（80.26±19.43）μg.L-1;Tmax（0.75±0.29）h;T1/2（10.76±1.96）h;AUC0-48（270.53±98.44）μg.h.L-1;AUC0-∞（280.55±104.97）μg.h.L-1;波动度DF为（8.21±2.11）%。结论匹伐他汀在连续多次给药后,体内无蓄积现象,血药浓度第5天已达稳态。匹伐他汀的剂量与Cmax、AUC0-∞和AUC0-24呈正相关关系;匹伐他汀的体内过程在男女性别间差异无显著性。匹伐他汀片单、多剂量给药后在中国健康人体内的药动学行为与国外文献报道基本一致。     

MT01对牙龈卟啉单胞菌感染成骨细胞MG63中Ⅰ型胶原mRNA表达的促进作用及其意义

目的：检测单链寡脱氧核苷酸MT01 作用下牙龈卟啉单胞菌（Pg） 感染成骨细胞MG63中Ⅰ型胶原（ColⅠ）mRNA 表达水平,探讨MT01对感染状态下成骨细胞成骨向分化的影响。方法：体外培养的MG63细胞分为空白对照组、MT01组、Pg组和MT01+Pg组。按分组情况进行相应处理,加入MT01（质量浓度1 mg·L^-1）,以1 mg·L^-1PBS作对照共孵育3h后,以100∶1的感染复数（MOI）加入Pg悬液共培养。4组细胞分别孵育2、4、6、8、12和24h后采用RT-PCR法检测MG63细胞中ColⅠ mRNA表达水平。结果：与空白对照组比较,MT01和MT01+Pg组MG63细胞中ColⅠ mRNA表达水平在2和4h时无明显变化（P > 0.05）,8、12和24h时MT01组细胞中ColⅠ mRNA表达水平明显升高（P < 0.05或P < 0.01）;与Pg组比较,2和4h时MT01+Pg组细胞中ColⅠ mRNA呈低表达,6、8、12和24h时ColⅠ mRNA表达水平升高（P < 0.05或P < 0.01）。结论：MT01上调感染状态下MG63细胞中ColⅠ mRNA的表达水平,MT01可促进感染状态下成骨细胞成骨向分化。     

糖基化终产物对小鼠胚胎成纤维细胞结缔组织生长因子表达的影响

目的：探讨糖基化终产物（AGEs）对NIH Swiss小鼠胚胎成纤维细胞（NIH/3T3）中结缔组织生长因子（CTGF）基因表达的影响,并观察氨基胍（AG）、葛根素（Pue）对NIH/3T3中CTGF mRNA表达的干预作用。方法：葡萄糖和牛血清白蛋白（BSA）共同孵育制备AGEs,运用荧光法测定AGEs水平。用不同浓度葡萄糖（20、50和80 mmol•L^-1）制备的AGEs培养NIH/3T3细胞24 h;用50 mmol•L^-1葡萄糖制备的AGEs培养NIH/3T3细胞0、6、12、24和48 h。观察AG和不同浓度Pue（0.25、0.5、1.0和1.5g•L^-1）的干预作用。应用RT-PCR检测NIH/3T3中CTGF mRNA的表达。结果：与BSA对照组比较,用20、50和80 mmol•L^-1葡萄糖制备的AGEs培养24 h后,NIH/3T3中CTGF mRNA表达增高（P<0.01）,以50 mmol•L^-1最明显。与0 h比较,同一浓度葡萄糖制备的AGEs培养6、12、24及48 h后,NIH/3T3中CTGF mRNA的表达增高（P<0.01）,以24 h最明显。与50 mmol•L^-1葡萄糖制备的AGEs培养24 h比较,AG和不同浓度的Pue干预后NIH/3T3中CTGF mRNA的表达明显降低（P<0.01）。结论：AGEs能增强NIH/3T3中CTGF基因表达,且与孵育AGEs的葡萄糖浓度和作用时间有关,提示AGEs可能促进糖尿病并发症纤维化的发展,AG和Pue可抑制AGEs促纤维化的病理过程。     

同型半胱氨酸对人血管平滑肌细胞死亡受体Fas、TNFR1mRNA表达的影响

目的通过观察同型半胱氨酸对人血管平滑肌细胞死亡受体Fas、TNFR1mRNA表达的研究,探索同型半胱氨酸诱导血管平滑肌细胞凋亡的分子机制。方法应用RT-PCR技术对死亡受体Fas、TNFR1mRNA的表达进行观察。结果 RT-PCR技术检测结果发现同型半胱氨酸使血管平滑肌细胞Fas、TNFR1mRNA的表达呈浓度和时间依赖性上调（P〈0.05）。结论同型半胱氨酸诱导人血管平滑肌细胞死亡受体Fas、TNFR1 mRNA表达增加,这可能是同型半胱氨酸诱导血管平滑肌细胞凋亡的机制之一。     

五味子甲素对脑胶质瘤C6细胞生长的抑制作用及其机制

目的：探讨五味子甲素对脑胶质瘤C6细胞生长的抑制作用,阐明其作用机制。方法：培养大鼠脑胶质瘤C6细胞,将其分为对照组及50、100和200mg·L^-1五味子甲素组,采用MTT法检测C6细胞增殖率,流式细胞术分析细胞周期百分率,酶联免疫吸附实验（ELISA）检测细胞培养上清中CyclinD1、Bax、Bcl-2和Casepase-3蛋白表达水平。结果：与对照组比较,24和48h时50、100和200 mg·L^-1五味子甲素组细胞增殖率均明显降低（P < 0.01）,72h时100和200 mg·L^-1五味子甲素组细胞增殖率明显降低（P < 0.05或P < 0.01）。与对照组比较,200 mg·L^-1五味子甲素组SubG₁期细胞百分率升高（P < 0.05）,S期细胞百分率降低（P < 0.05）。与对照组比较,100和200mg·L^-1五味子甲素组细胞CyclinD1蛋白表达水平降低（P < 0.01）,不同浓度五味子甲素组Bax蛋白表达水平升高（P < 0.05或P < 0.01）,200mg·L^-1五味子甲素组Bcl-2蛋白表达水平降低（P < 0.01）,不同浓度五味子甲素组Bax/Bcl-2比值明显升高（P < 0.01）,200 mg·L^-1五味子甲素组Caspase-3蛋白表达水平升高（P < 0.01）。结论：五味子甲素通过下调CyclinD1蛋白表达水平、上调促凋亡因子Bax和Bcl-2表达水平而抑制C6细胞的生长。     

二甲双胍对糖基化终产物诱导血管平滑肌细胞钙化的抑制作用

目的:在细胞水平观察二甲双胍对晚期糖基化终产物(AGEs)诱导的血管平滑肌细胞钙化的抑制作用。方法:应用大鼠血管平滑肌细胞株(A7R5)进行体外实验,分别设对照组、牛血清白蛋白(BSA)组、AGE-BSA组、二甲双胍与AGE-BSA共干预组。将200 mg.L-1 AGE-BSA与不同浓度(10-4、5×10-5、10-5 mol.L-1)的二甲双胍在含10 mmol.L-1β-甘油磷酸的钙化培养液中共培养血管平滑肌细胞,观察不同浓度二甲双胍对血管平滑肌细胞钙化的影响。采用全自动生化分析仪测定细胞层钙含量,磷酸苯二钠法检测碱性磷酸酶活性,RT-PCR检测骨形成蛋白-2(BMP-2)mRNA表达,Western blotting检测BMP-2蛋白表达。结果:与对照组相比较,AGE-BSA组细胞层钙含量增加,碱性磷酸酶活性升高,细胞BMP-2 mRNA表达升高,BMP-2蛋白表达增加(P<0.01);不同浓度二甲双胍与AGE-BSA共干预可降低AGEs诱导的上述指标升高。结论:AGE-BSA可促进血管平滑肌细胞钙化,二甲双胍可剂量依赖性地抑制AGE-BSA诱导的钙化促进作用。     

白花蛇舌草总黄酮对黑色素瘤A375和B16细胞增殖抑制作用的研究

目的观察白花蛇舌草总黄酮（FOD）对体外培养黑色素瘤A375和B16细胞增殖的影响。方法体外培养黑色素瘤A375和B16细胞,分别使用浓度为6.25、12.5、25、50、100 mg.L-1的FOD作用24、48 h,通过MTT比色法检测细胞生长的抑制作用。结果 12.5 mg.L-1的FOD作用A375细胞48 h后,细胞增殖能力明显受抑制（P〈0.05）,25 mg.L-1的FOD作用A375细胞24 h后,细胞增殖能力也明显受抑制（P〈0.05）;25 mg.L-1的FOD作用B16细胞48 h后,细胞增殖活力明显下降（P〈0.05）,50 mg.L-1的FOD作用B16细胞24 h后,细胞增殖活力也明显降低（P〈0.05）;分别作用24 h和48 h后,两组随着浓度的升高,不同浓度对细胞的增殖能力抑制差异有统计学意义（P〈0.05）;随着浓度的增高和作用时间的延长,细胞的增殖能力随着下降。结论 FOD能有效抑制黑色素瘤A375和B16细胞增殖,且具有一定的时-效和量-效关系。     

OX-LDL介导内皮细胞损伤及其对TLR-4和EpCAM表达的影响

目的:研究氧化型低密度脂蛋白(OX-LDL)对血管内皮细胞的损伤效应及其对Toll样受体4(TLR-4)和上皮细胞黏附分子(EpCAM)表达的影响。方法:培养人脐静脉内皮细胞ECV-304,实验分为对照组和实验组(25、50、100和200 mg·L^-1 OX-LDL),处理后细胞继续培养24 h,台盼蓝拒染法检测细胞活力;流式细胞术检测活性氧(ROS)水平、线粒体膜电位(MMP)、细胞周期与凋亡以及EpCAM和TLR-4表达水平。结果:与对照组比较,25、50、100和200 mg·L^-1OX-LDL组ECV-304细胞内ROS水平升高,细胞活力和MMP下降(P<0.05)。与对照组比较,25和50 mg·L^-1OX-LDL组S期细胞百分率升高,而G₀/G₁期细胞略减少,SubG₁期细胞(凋亡细胞)随OX-LDL浓度增加而增加。与对照组比较,50 mg·L^-1 OX-LDL组24 h时ECV-304细胞膜表面TLR-4和EpCAM表达水平均明显升高(P<0.05)。结论:OX-LDL具有提高内皮细胞ROS水平、降低细胞活力和MMP以及诱导细胞凋亡等损伤效应,此过程中ECV-304细胞中TLR-4和EpCAM水平升高。     

糖基化终产物AGEs对U937巨噬细胞高密度脂蛋白受体(SR-BI)蛋白表达的影响

目的研究诱导分化及糖基化终产物对人单核/巨噬细胞(U937细胞)高密度脂蛋白受体(SR-BI)蛋白表达的影响.方法U937细胞经PMA诱导分化,并将不同浓度或同一浓度AGEs与诱导分化48h后的U937细胞共同孵育,用免疫细胞化学法和Western印迹法检测SR-BI蛋白的表达.结果诱导分化后U937细胞SR-BI表达在24、48 h逐渐升高,72 h下降;100、200和400mg/L AGEs刺激后细胞表面SR-BI蛋白表达量分别是BSA组的1.44、2.38和2.77倍(P＜0.05);400mg/L的AGEs作用6、12、24、48 h后,U937巨噬细胞SR-BI蛋白表达量分别为0 h的1.38、2.49、3.76和4.25倍(P＜0.05).结论诱导分化24及48 h SR-BI蛋白表达逐渐增加,而分化72h蛋白表达下降;AGEs可增加U937巨噬细胞SR-BI蛋白表达且呈浓度和时间依赖性.