转录组测序分析非酒精性脂肪肝的重要调控分子

目的 探讨非酒精性脂肪肝(non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD)细胞与正常肝细胞中差异表达的基因。方法 建立NAFLD细胞模型。采用棕榈酸诱导人正常肝细胞LO2细胞;油红O染色观察细胞脂肪蓄积情况;流式细胞仪检测棕榈酸对LO2细胞的凋亡影响。对正常LO2细胞和模型细胞组进行转录组测序,筛选差异表达基因,并对差异表达基因进行KEGG功能富集分析和GO功能富集分析。采用RT-PCR检测差异基因的表达。结果 随着棕榈酸浓度的增加,细胞脂肪蓄积越明显,结合凋亡率筛选出最优棕榈酸诱导浓度用于后续研究。转录组结果显示,与对照组相比,模型组差异表达基因数目有780个,上调基因数目447个,下调基因数目333个,GO富集通路分析具有显著富集意义,KEGG富集通路主要涉及了20条信号通路,主要包括TNF、蛋白输出、NOD等信号通路。RT-PCR结果显示FGF21、AMBP、GOLGA7B和DDIT3在NAFLD中高表达,SPTLC3、PALM2和SPTSBB在NAFLD中低表达。结论 NAFLD可引起相关差异基因表达,可能通过脂质代谢中的关键靶基因调控NAFL...     

催乳素基因转录调控的分子机制

大鼠催乳素 (rPRL)基因转录调控过程主要涉及顺式作用元件和反式作用因子。目前 ,已鉴定出多种rPRL基因的反式作用因子 ,如垂体特异转录因子、催乳细胞特异转录因子和雌激素受体等。这些反式作用因子结合于rPRL基因上相应的顺式作用元件 ,发挥基因转录调控功能。此外 ,某些激素、多肽、生长因子、神经递质、第二信使、即早基因以及DNA结构的变化也能影响rPRL基因转录过程     

催乳素基因转录调控的分子机制

大鼠催乳素（rPRL)基因转录调控过程主要涉及顺式作用元件和反式作用因子。目前,已鉴定出多种rPRL基因的反式作用因子,如垂体特异转录因子、催乳细胞特异转录因子和雌激素受体等。这些反式作用因子结合于rPRL基因上相应的顺式作用元件,发挥基因转录调控功能。此外,某些激素、多肽、生长因子、神经递质、第二信使、即早基因以及DNA结构的变化也能影响rPRL基因转录过程。     

转录组测序分析高尔基体蛋白73参与调控肝癌的作用机制

目的基于转录组分析技术,探索高尔基体蛋白73(GP73)参与调控肝癌的作用机制。方法将肝癌细胞株Hep3B分为4组:GP73干扰组和对照组、GP73过表达组和对照组,采用转录组测序技术检测4组样本mRNA的表达。根据测序数据筛选差异表达基因,通过GO功能分析和KEGG富集分析差异表达基因。Western Blot实验验证信号通路相关蛋白的表达。符合正态分布的计量资料2组间比较采用t检验。结果通过分析Hep3B细胞干扰和过表达GP73后的差异表达基因,GO分析结果揭示了586个生物过程,GP73主要参与了细胞过程、单个组织的过程、生物调节等功能。KEGG分析表明GP73主要参与了PI3K-AKT、细胞因子/细胞因子受体相互作用、TNF、JAK-STAT等与肝癌密切相关的信号通路。Western Blot验证PI3K-AKT信号通路中的3个蛋白PI3K、p-AKT和AKT,干扰组和过表达组的蛋白PI3K、p-AKT和对照组比较均有显著差异(P值均0.05)。结论通过转录组测序和生物信息分析筛选到GP73主要参与调控肝癌的信号通路,为阐明GP73对肝癌的作用机制提供了新的思路。     

豪猪血蜱转录组测序分析

目的测序分析豪猪血蜱转录组,比较雌、雄成蜱差异表达基因及其通路,为豪猪血蜱的防制提供参考。方法采用Illumina高通量技术对豪猪血蜱雌、雄成蜱进行转录组测序,将测序得到的数据进行拼接组装,利用生物信息学方法对所得序列进行功能注释、简单重复序列标记及雌雄蜱差异表达基因分析。结果共获得181 246 184个clean reads数据,组装后得到90 957个unigenes序列,平均长度951。通过BLAST软件将所有unigenes序列与Nr, Nt, Pfam, KOG,Swiss-prot, KEGG,GO数据库进行比对。其中与Nr数据库比对发现豪猪血蜱基因序列与肩突硬蜱(Ixodes scapularis)具有较高的同源性,为51.2%;在GO数据库中,有150 460个基因被注释,在56个功能群的二级分类中注释基因较多的是细胞过程(15 274个);获得KOG注释的基因序列有19 745个,将注释成功的基因按KOG的group进行分类,聚集较高的为一般功能预测基因2 071个(16.85%);注释为KEGG代谢通路相关的序列共有12 054个,在参与代谢通路5个分支中,细胞过程注释到的序列较高,为1 765个(14.64%)。在各分支的亚支中,环境信息处理分支中的信号转导丰度较高(1 270,10.54%)。通过SSR位点查找共鉴定出21 883个SSR;SNP分析显示发生转换的SNP数为961 890个,发生颠换的SNP数为509 232个。结论通过对比豪猪血蜱雌、雄蜱差异表达基因及其通路,发现了胚胎发育和性别维持相关基因通路在雌蜱中的高表达,为豪猪血蜱控制策略的制定提供了理论基础。     

转录组测序结合蛋白组学技术筛选肝癌转移基因

目的:通过高通量转录组测序和相对定量血清蛋白组学技术筛选肝癌转移相关的关键基因.方法:利用Ion Proton.测序仪比较人肝癌细胞株(Smmc-7721)和正常人肝细胞株(L-02)的差异表达基因,对差异表达基因进行聚类分析、GO功能注释和富集分析,获得肝癌细胞转移相关基因;收集10例肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)患者血清及匹配10例正常人血清,通过相对和绝对定量的同位素标记(isobaric tags for relative and absolute quantitation,iTRAQ)联合基质辅助激光解吸电离串联飞行时间质谱(ma t r ixassisted laser desorption/ionization tandemtime of flight mass spectrometry,MALDITOF/MS)检测肝癌与正常对照组血清差异表达蛋白;将两组学结果进行交集分析,确定肝癌转移关键基因,并在76例HCC和癌旁组织中进行免疫组织化学验证.结果:对肝癌细胞及正常肝细胞进行转录组测序分析,共得到肝癌细胞差异表达基因618个,生物信息学分析差异表达基因主要聚集在转移相关、转录因子相关、氧化还原过程等14个分子功能,其中转移相关功能基因所占比例最大,达15.05%(93/618);血清蛋白组学分析共得到69个肝癌血清差异表达蛋白,其中在肝癌组上调33个,下调36个;将转录组测序筛选的与转移功能相关基因与蛋白质组学进行交集分析,发现有3个共同交集的差异因子,其中差异最明显的是肝癌中表达上调的热休克蛋白90 AA1(heat shock protein 90 AA1,HSP90AA1);免疫组织化学验证结果显示,HSP90α表达强阳性在门脉转移和无门脉转移HCC组织中的比例分别为66.7%(16/24)和25%(13/52)(P0.005),HSP90α在有门脉转移的肝癌组织表达明显增高.结论:利用转录组结合血清蛋白组策略,发现HSP90AA1可能是在肝癌转移重要基因.     

miR-1301对胃癌细胞侵袭的影响及分子机制

目的探讨微小核糖核苷酸(miR)-1301在人胃癌(GC)组织内的表达及对MGC-803细胞侵袭的影响。方法选择四川省人民医院收治并行手术切除的60例GC组织与对应癌旁组织。检测miR-1301的相对表达量,分析miR-1301表达的临床病理意义;采用人工合成的miR-1301模拟物转染MGC-803细胞,检测MGC-803细胞过表达miR-1301后迁移、侵袭能力的变化。Western印迹检测miR-1301下游潜在靶点信号传导及转录激活蛋白(STAT)3的表达及侵袭相关分子基质金属蛋白酶(MMP)-2的表达。结果GC组织中的miR-1301表达水平较癌旁组织降低(t=2.419,P=0.026),低表达miR-1301与肿瘤淋巴结转移(χ^2=6.140,P=0.021)、较短的总体生存期(HR=2.140,P=0.021)及无病生存期(HR=3.437,P=0.015)均密切相关;过表达miR-1301能够削弱MGC-803细胞迁移(t=6.423,P=0.021)、侵袭能力(t=3.128,P=0.030)及细胞内STAT3(t=3.781,P=0.028)和MMP-2(t=2.168,P=0.036)的表达水平。结论GC中miR-1301表达降低,miR-1301可能通过下调STAT3/MMP-2轴的表达来削弱GC细胞的侵袭能力。     

生长抑素受体SSTR 3基因对胃癌细胞生长的影响

目的克隆生长抑素受体SSTR3基因,构建其真核表达载体,外进行转染研究,探时SSTR3基因在胃癌细胞中的作用。方法从永生化的胃上皮细胞系GES中提取总RNA,经RT－PCR扩增出SSTR3基因．并构建真核表达载体pcDNA 3．1（＋）－SSTR3,转染胃癌细胞系MKN 45,以MTT法和流式细胞仪观察转染SSTR基因前后使用奥曲肽对胃癌细胞增殖和凋亡的影响。结果克隆的SSTR 3基因测序正确;构建的真核表达载体pcDNA3．1（＋）SSTR3能高表达SSTR3蛋白;转染SSTR3基因的胃癌细胞系MKN 45加用奥曲肽后,出现明显的增殖抑制和凋亡发生。结论SSSTR3基因介导了生长抑素类似物引起的胃癌细胞的增殖抑制和凋亡发生。通过基因转移使原来不表达SSTR3基因的胃癌细胞再表达,为生长抑素和SSTR3基因治疗胃癌提供了又有效途径。     

人工诱变利福平抗性布鲁氏菌转录组测序分析

目的 筛选布鲁氏菌中参与利福平代谢相关基因(除rpoB基因外)。方法 利用人工诱变技术获得利福平抗性菌株,通过转录组测序获得标准菌株和利福平抗性菌株全基因组水平的基因表达量,利用EBSeq算法筛选差异表达基因,预测利福平代谢相关基因及主要代谢途径。结果 通过不同浓度的利福平人工诱变,能够获得抗性表型稳定的布鲁氏菌变异菌株。转录组测序发现利福平抗性菌株中有121个基因表达量上调,197个基因表达量下调,差异基因功能主要集中于催化活性、细胞膜和细胞成分、代谢过程和细胞过程;主要参与抗生素的生物合成、细菌分泌系统和ABC 转运蛋白等代谢通路。结论 包括virB操纵子在内的涉及碳代谢等代谢通路的基因,通过表达量的改变参与抵抗利福平的作用。 本研究为布鲁氏菌耐药相关基因的筛选提供新思路,同时为布鲁氏菌耐药菌株的防控提供基础性数据。     

BCG感染树突状细胞的转录组测序和分析

目的 通过转录组学筛选DC2.4细胞内BCG感染相关的差异表达基因和信号通路,为探索DC细胞抗分枝杆菌的胞内免疫机制提供科学依据。方法 以小鼠DC2.4细胞作为细胞模型,设置感染组和未感染组,感染组经BCG(MOI=2)感染,培养24 h后收集细胞,采用转录组测序技术(RNA-Seq)检测感染组和未感染组mRNA表达谱并结合生物信息学分析方法,筛选树突状细胞内与BCG感染相关的差异表达基因并进行qRT-PCR验证。结果 与未感染组相比,感染组差异表达基因共有27个(P<0.05),其中26个上调基因,1个下调基因。通过GO和KEGG富集分析发现差异基因参与炎症反应、免疫系统过程等;TNF信号通路、IL-17信号通路以及细胞因子与细胞因子受体信号通路等参与BCG胞内感染过程。qRT-PCR验证与BCG感染相关的差异表达基因与转录组数据趋势一致。结论 BCG感染树突状细胞后,能够激发宿主细胞炎症反应和免疫应答,TNF、IL-17等信号通路参与BCG胞内感染过程。     

miR-638对胃癌细胞侵袭和迁移的影响及其分子机制

目的探讨miR-638是否可通过直接调控靶向性别决定区Y框蛋白(SOX)2抑制上皮-间质转化(EMT)相关通路从而抑制胃癌细胞的侵袭迁移。方法 qRT-PCR检测miR-638在100对胃癌组织及癌旁组织中的表达、检测miR-638在7株胃癌细胞系及1株正常胃黏膜细胞中的表达。Transwell和Wound Healing实验验证分别转染miR-638模拟物(miR-638 mimics)及其无关对照寡核苷酸序列(scramble)到胃癌细胞AGS中时对细胞的侵袭和迁移能力的影响。Target Scan软件预测miR-638的靶基因、将野生型或突变型SOX2的3'-UTR区域克隆到荧光素酶报告基因的下游(SOX2-wt或SOX2-mut)并分别与miR-638 mimics或scramble共转染,荧光素酶报告基因实验验证所预测的靶基因为SOX2,qRT-PCR和Western印迹分别检测转染miR-638 mimics和scramble后SOX2的mRNA和蛋白表达的及EMT相关蛋白表达。结果 miR-638在胃癌组织中的表达水平显著低于癌旁组织,同时miR-638在胃癌细胞系中的表达水平也显著低于正常胃黏膜细胞系。转染miR-638后,胃癌细胞AGS的侵袭和迁移能力显著低于scramble组(P<0.05)。在共转染miR-638或scramble和SOX2-wt的两组中,共转染miR-638和SOX2-wt组的荧光素酶活性强度降低了约43.1%(P<0.05)。转染miR-638后,SOX2的mRNA和蛋白表达水平均显著下调;EMT相关的上皮标志物钙黏附蛋白E(E-cadherin)的表达显著增加,而EMT相关的间质标志物神经钙联素(N-cadherin)和波形蛋白(Vimentin)的表达则显著降低(P<0.05)。结论 miR-638可通过靶向调控SOX2而影响EMT,抑制胃癌细胞AGS的侵袭和迁移。     

腐食酪螨转录组测序及生物信息学分析

目的　获得腐食酪螨转录组数据,为后续基因功能研究奠定基础。方法　基于Illumina HiSeqTM 2000高通量测序平台,对腐食酪螨雌雄混合螨体进行测序,采用Trinity软件组装转录本获得单基因簇（Unigenes）。将单基因簇与非冗余蛋白质序列（RefSeq non?redundant protein sequence,NR）数据库、核苷酸序列（nucleotide sequence database,NT）数据库、Swiss?Prot数据库、京都基因和基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG）数据库、直系同源簇（clusters of orthologous groups,COG）数据库中的蛋白质序列进行比对,对其进行功能注释。将单基因簇按照NR、Swiss?Prot 蛋白库优先级顺序进行编码序列（coding sequence,CDS）比对、预测。利用MISA软件对腐食酪螨Unigenes进行简单重复序列（simple sequence repeats,SSR）位点分析。使用SOAPsnp技术检测螨虫单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism,SNP）。结果　转录组测序数据质控后获得4.67 Gb高质量数据,组装后获得51 271个单基因簇,总长度为41 848 995 个核苷酸（nucleotide,nt）、平均长度为816 nt。将单基因簇与公共数据库进行比对和功能注释后,得到29 053个有功能注释的Unigenes。预测发现27 443条CDS,检测到23 092个SSR位点信息和148 027个SNP位点信息。结论　通过测序技术建立了腐食酪螨转录组数据库,获得了大量腐食酪螨转录本信息,为后续过敏相关基因功能学研究奠定了基础。     

单细胞转录组测序在心血管疾病中的文献计量学分析

目的 心血管疾病是世界范围内的主要死亡原因之一。单细胞转录组测序（scRNA-seq能够揭示单个细胞的基因结构和基因表达状态,反映细胞间的异质性。然而,这一领域的文献计量学研究较少。本研究提供了该领域的研究现状、研究热点和未来研究发展趋势,以期为今后的相关研究提供参考。方法 从Web of Science核心集检索相关文献,检索时间不限,检索日期为2021年11月8日,利用CiteSpace和VOSviewer软件从发文量、国家、作者和研究机构、学科分布、期刊分布、高被引文献、共被引文献和关键词进行可视化分析,并生成知识图谱。结果 共检索相关文献366篇,被引频次9407次。2004～2016年的发文量增长缓慢,2017～2021年发文量迅速增加。美国、中国和德国发文量最多,美国和其他国家的合作很紧密,拥有强大的合作网络,涉及心血管系统心脏病学、细胞生物学和生物化学分子生物学等学科相关。德国心血管研究中心、哈佛医学院、加利福尼亚大学、清华大学这4个机构对该领域的研究较深入。在该领域发表文章最多的杂志是CIRCULATION RESEARCH,其次是CIRCULATION、NATURE ...     

下调GPC-3基因转录对肝癌细胞侵袭及血管新生的抑制作用

目的:观察以短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)下调磷脂酰肌醇蛋白多糖-3(glypican-3,GPC-3)基因转录,对抑制肝癌MHCC-97H细胞侵袭和血管新生的作用与机制.方法:将对GPC-3特异性shRNA转染肝癌MHCC-97H细胞,以荧光定量PCR和Western blot分析GPC-3 mRNA及蛋白表达;以5-ethynyl-2'-deoxyuridine(EdU)和Transwell法等评估细胞增殖、迁移和侵袭能力.结果:shRNA1转染MHCC-97H细胞,GPC-3在mRNA水平下降75.6%(t=15.473,P0.001),蛋白表达同步下调;干预GPC-3基因转录,可抑制肝癌细胞增殖,细胞迁移与侵袭能力减低,与抗癌药物具协同作用;Wnt/β-catenin中β-catenin表达下调67.7%;Hedgehogs通路中脑胶质瘤相关癌基因1(glioma-associated oncogene 1,Gli1)表达上调53.3%;shRNA1转染72 h细胞血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)表达下调54.2%(t=46.746,P0.001).结论:shRNA下调GPC-3转录,经Wnt/β-catenin和Hh信号通路抑制癌细胞迁移、侵袭和血管新生,为肝癌基因治疗潜在的分子靶目标.     

miR-106a-5p靶向调控ERK2对胃癌细胞顺铂耐药性的影响及其分子机制

目的 观察微小RNA106a-5p(miR-106a-5p)通过靶向调控细胞外信号调节激酶2(ERK2)对胃癌细胞顺铂(DDP)耐药性的影响,并探讨其可能的分子机制.方法 建立胃癌细胞系MGC-803 DDP耐药细胞株MGC-803/DDP,采用RT-PCR法检测MGC-803及MGC-803/DDP中miR-106a...     

E2F-1基因过表达对胃癌细胞动力学影响机制

目的:了解E2F-1过表达对胃癌细胞MGC-803增殖、生长和细胞周期的影响,并探讨E2F-1对胃癌细胞动力学影响的分子机制.方法:对稳定转染E2F-1的胃癌MGC-803/E2F-1细胞(实验组)、转染空载体的MGC-803/EV(阴性对照组)及未转染的MGC-803细胞进行MTT法检测,绘制生长曲线和计算细胞增殖率; 流式细胞仪检测各组细胞周期分布.提取各组细胞的总RNA,逆转录成cDNA,用荧光探针与含有21 522条人类基因表达谱芯片进行杂交.采用LuxScan 10K/A双通道激光扫描仪扫描芯片上两种荧光信号,应用LuxScan 3.0图像分析软件对芯片图像进行处理和分析.结果:与两个对照组相比,胃癌MGC-803/E2F-1细胞的生长受到明显抑制,增殖率下降(26.61%±5.19% vs 93.4%±10.29%,100%±0.00%,均P <0.05); 细胞周期阻滞在G0/G1期.在检测的21 522条基因中,与细胞增殖、生长和细胞周期相关的差异性表达基因有20条,上调基因9条,下调基因11条.结论:E2F-1基因过表达抑制胃癌细胞的增殖和生长,细胞周期停滞在G0/G1期,其分子机制可能与筛选出来的20条差异表达基因有直接的关系.     

cGKⅠ对胃癌细胞的抑制作用及其机制

目的探讨c GMP依赖性蛋白激酶(cGK)Ⅰ对胃癌细胞的抑制作用及其机制。方法构建过表达cGKⅠ慢病毒,感染胃癌细胞株(AGS)获得过表达cGKⅠ细胞系,通过四甲基偶氮唑蓝比色法(MTT)测定过表达cGK对AGS细胞活力的影响,Western印迹检测原癌基因p53,抑癌基因C-myc,细胞凋亡相关基因半胱氨酸蛋白酶(caspas)3以及迁袭转移相关基质金属蛋白酶(MMP)2、MMP-9蛋白的表达变化。结果 cGKⅠ腺病毒载体感染的AGS细胞,细胞活性显著下降。p53抑癌基因和C-myc原癌基因并没有显著变化,细胞迁移相关蛋白MMP-2、7、9均显著下降,凋亡蛋白caspase3显著上升。结论 cGKⅠ对AGS细胞增殖有抑制作用。cGKⅠ诱导的细胞迁移能力的下降和凋亡的上升与抑癌基因和原癌基因无关,或者在AGS细胞中存在p53和C-myc原癌基因突变。     

压力超负荷大鼠心房颤动易感性及基于基因测序的分子机制

目的 通过压力超负荷模型,探讨高血压条件下心房颤动易感性变化及分子机制.方法 12周龄雄性SD大鼠32只,随机分为对照组(n=15)和腹主动脉缩窄(AAC)组(简称模型组,n=17).模型组采用7号针头(外径0.7 mm)制备AAC模型,对照组不进行AAC,其余步骤相同.比较2组大鼠术后4周心脏超声学、血流动力学指标(...     

Fas基因转导胃癌细胞的表达

目的将Ｆａｓ基因导入胃癌细胞，建立Ｆａｓ基因表达株，并比较转导前后ｍＲＮＡ与蛋白的表达水平．方法采用分子克隆技术将Ｆａｓ基因插入真核表达载体ｐＢＫＣＭＶ的多克隆克隆位点之间，以脂质体介导法将目的基因导入受体细胞ＳＧＣ７９０１，用Ｇ４１８筛选克隆细胞；以Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ，Ｎｏｒｔｈｅｒｎｂｌｏｔ，Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测Ｆａｓ基因的表达．结果成功地构建了真核表达载体ｐＢＫＦａｓｃＤＮＡ．转导细胞后，从１×１０５细胞中筛选出１００个抗性克隆以上，转导率大于０１％，随机挑选２个克隆扩增培养，获得了１株稳定的抗性细胞，从而有效地建立了Ｆａｓ基因表达株（ＳＧＣ７９０１Ｆａｓｃｅｌｓ）．杂交结果表明，转导株与非转导株均有ｃＤＮＡ的表达，但转导株在ｍＲＮＡ及蛋白水平的表达均明显高于非转导株．结论Ｆａｓ基因在胃癌细胞中处于低表达状态；通过真核表达载体的介导，Ｆａｓ基因导入胃癌细胞后，能有效地表达ＦａｓｍＲＮＡ及其蛋白．