下调GPC-3基因转录对肝癌细胞侵袭及血管新生的抑制作用

目的:观察以短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)下调磷脂酰肌醇蛋白多糖-3(glypican-3,GPC-3)基因转录,对抑制肝癌MHCC-97H细胞侵袭和血管新生的作用与机制.方法:将对GPC-3特异性shRNA转染肝癌MHCC-97H细胞,以荧光定量PCR和Western blot分析GPC-3 mRNA及蛋白表达;以5-ethynyl-2'-deoxyuridine(EdU)和Transwell法等评估细胞增殖、迁移和侵袭能力.结果:shRNA1转染MHCC-97H细胞,GPC-3在mRNA水平下降75.6%(t=15.473,P0.001),蛋白表达同步下调;干预GPC-3基因转录,可抑制肝癌细胞增殖,细胞迁移与侵袭能力减低,与抗癌药物具协同作用;Wnt/β-catenin中β-catenin表达下调67.7%;Hedgehogs通路中脑胶质瘤相关癌基因1(glioma-associated oncogene 1,Gli1)表达上调53.3%;shRNA1转染72 h细胞血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)表达下调54.2%(t=46.746,P0.001).结论:shRNA下调GPC-3转录,经Wnt/β-catenin和Hh信号通路抑制癌细胞迁移、侵袭和血管新生,为肝癌基因治疗潜在的分子靶目标.     

DEK基因在肝癌中的表达及靶向抑制其表达对肝癌细胞增殖及凋亡的影响

目的探讨DEK基因在肝癌中的表达及RNA干扰抑制其表达对肝癌细胞增殖及凋亡的影响及机制。方法以人正常肝细胞HL-7702作为对照,RT-PCR检测人肝癌HepG2、Huh-7、SMMC-7721、SNU-475细胞中DEK mRNA表达;DEK-siRNA转染HepG2细胞,同时转染阴性对照和空白对照,转染48 h后Western blotting检测各组细胞中DEK、Cleaved caspase 3、β-catenin、Cyclin D1蛋白表达;CCK8实验和流式细胞仪分别检测细胞的增殖及凋亡情况。结果各个肝癌细胞中DEK mRNA表达均显著高于正常细胞,差异有统计学意义(P0.01);DEK基因在HepG2细胞中表达最高,选择作为后续研究对象;转染DEK-siRNA后DEK蛋白表达显著降低;DEK-siRNA组细胞存活率及β-catenin、Cyclin D1蛋白表达显著低于空白对照组和阴性对照组,细胞凋亡率和Cleaved caspase 3蛋白表达显著高于空白对照组和阴性对照组,差异有统计学意义(P0.01)。结论抑制肝癌HepG2细胞中DEK基因可降低癌细胞的增殖及诱导细胞凋亡,其机制与Wnt/β-catenin信号通路的调控有关。     

Glypican-3对HepG2肝癌细胞增殖及侵袭转移的影响

目的探讨磷脂酰肌醇蛋白多糖-3(Glypican-3,GPC-3)在Hep G2肝癌细胞增殖及侵袭转移中的作用。方法构建并筛选沉默GPC-3最有效的shRNA,转染HepG2细胞,Western blot分析GPC-3蛋白表达水平;MTT、划痕实验和Transwell小室实验分别检测GPC-3基因沉默对HepG2细胞增殖、转移和侵袭能力的影响。结果 GPC-3-shRNA-1干扰效果最好,对GPC-3表达抑制率为77.7%;GPC-3沉默后HepG2细胞增殖显著受到抑制(P=0.014),细胞转移和侵袭能力显著减弱,侵袭抑制率为52.4%。结论 GPC-3基因沉默后Hep G2细胞增殖、转移和侵袭能力显著受抑制,提示GPC-3在肝癌的发生发展中起关键作用,可能成为肝癌靶向治疗的目标。     

Wnt信号通路的组件蛋白DKK-1、β-链接素及周期素D1蛋白表达与胃癌的相关性

目的探讨Wnt信号通路中的组件蛋白DKK-1、β-catenin及周期素(Cyclin)D1在胃癌的发生、发展及转移的相互关系。方法采用免疫组织化学方法标记DKK-1、β-catenin及Cyclin D1蛋白在80例胃癌组织标本,10例正常胃组织中的表达情况。结果 1DKK-1在胃癌组织中的表达明显低于胃正常组织(P0.05),高、中分化胃癌的表达高于低分化胃癌的表达(P0.05),伴有淋巴结转移的胃癌组织DKK-1较无转移病例阳性率低(P0.05)。2β-catenin在胃癌组织中的阳性表达率明显高于胃正常组织(P0.05),高、中分化胃癌的表达低于低分化胃癌的表达(P0.05),伴有淋巴结转移的胃癌组织β-catenin较无转移病例阳性率高(P0.05)。3Cyclin D1在胃癌组织中的表达明显高于胃正常组织(P0.05),高、中分化胃癌的表达低于低分化胃癌的表达(P0.05),伴有淋巴结转移的胃癌组织Cyclin D1较无转移病例阳性率较高(P0.05)。4在胃癌组织中DKK-1与Cyclin D1呈负相关关系(r=-0.453,P0.01),DKK-1与β-catenin呈负相关关系(r=-0.553,P0.01),Cyclin D1与β-catenin呈正相关关系(r=0.562,P0.05)。结论 Wnt信号通路中的组件蛋白DKK-1、β-catenin及Cyclin D1在胃癌的发生、发展及转移有一定的相互关系。     

Wnt/β-连环素信号通路对肝细胞癌信号分子的调节作用及其意义

目的 研究肝细胞癌中Wnt/β-连环素信号传导通路与糖原合成激酶(GSK)-3 β、STAT3、Smad3和人端粒酶逆转录酶(TERT)的关系及其意义.方法 用RNAi技术将针对β-连环素的siRNA转染入肝癌细胞系HepG2细胞中沉默β-连环素基因,于72h和96h提取蛋白质,用Western blot法检测β-连环素、GSK-3 β、p-GSK 3 β、STAT3、Smad3和TERT蛋白质的表达.用Student's t检验及方差分析进行统计学分析.结果 针对β-连环素的siRNA转染HepG2细胞72 h和96 h均可抑制β-连环素蛋白质的表达,且96 h比72 h的表达略有增加(t=4.43,P＜0.05),而GSK-3 β及p-GSK-3 β的蛋白质表达于转染后72 h和96 h依次增加(tGSK 3β=4.98,tp-GSK-3β=29.83,P值均＜0.05);STAT3的蛋白质表达于转染前后一致,差异无统计学意义(F=0.49,P＞0.05);smad3的蛋白质表达于转染后72 h增加(t=10.67,P＜0.05),96 h减少至原有水平(与转染前比较,t=0.90,P＞0.05);TERT的蛋白质表达于转染后72 h减少(t=4.18,P＜0.05),96 h增加至原有水平(t=1.26,P＞0.05).结论 肝细胞癌中Wnt/β-连环素信号通路可能通过调节GSK-3 β、p-GSK-3 β、Smad3、TERT蛋白质的表达来参与肝癌的发生和发展过程;而与STAT3蛋白质的表达无关.     

遗传印记基因PEG10沉默对人肝癌细胞Wnt/β-catenin信号转导通路的影响

目的观察靶向封闭遗传印记基因PEG10对人肝癌细胞(HepG2)Wnt/β-catenin信号转导通路的影响,探讨PEG10促进肝癌形成的可能机制。方法设计针对PEG10基因的shRNA,体外转录制备shRNA后利用脂质体转染技术转染肝癌细胞株HepG2,RT-PCR检测PEG10、β-catenin(CTNNB1)、WNT1基因mRNA水平,应用免疫组化技术检测其蛋白表达水平。结果转染PEG10-shRNA后HepG2细胞PEG10 mRNA水平下降65.6%,其蛋白表达水平减少60.9%;同时,β-catenin(CTNNB1)、WNT1基因mRNA水平随之分别下降52.5%、96.1%,蛋白表达水平分别减少94.3%、63.2%。结论靶向封闭PEG10可下调肝癌细胞Wnt/β-catenin信号通路关键因子β-catenin(CTNNB1)、WNT1表达水平。PEG10对肝癌的促进作用可能部分与其影响Wnt/β-catenin通路有关。     

吡格列酮调控β-连环蛋白表达延缓糖尿病大鼠肾脏纤维化的组织和细胞实验研究

目的在组织和细胞水平研究吡格列酮通过调控Wnt/β-连环蛋白(β-catenin)通路延缓糖尿病大鼠肾脏纤维化的发生发展。方法 18只SD大鼠随机分为正常对照(NC)组、DKD组和吡格列酮治疗组(PIO),每组各6只。HE、Masson染色观察肾组织形态学变化。大鼠肾小管上皮细胞(NRK-52E)分为正常糖组(Con)、高糖组(HG)、吡格列酮处理组(HG+PIO)、HG+空载组(HG+E)和HG+PPARγ过表达组(HG+PPARγ)。免疫细胞荧光观察细胞中β-catenin表达;Western blot法检测大鼠肾组织和NRK-52E细胞相关蛋白表达变化。结果与NC组比较,DKD组PPARγ表达降低(P0.05),磷酸化糖原合成酶激酶3β(p-GSK3β)、β-catenin、细胞核β-catenin、Ⅳ型胶原(Collagen Ⅳ)、Ⅲ型胶原(Collagen Ⅲ)和Ⅰ型胶原(Collagen Ⅰ)蛋白表达升高(P0.05),与DKD组比较,PIO组PPARγ表达升高(P0.05),p-GSK3β、β-catenin、细胞核β-catenin、Collagen Ⅳ、Collagen Ⅲ和Collagen Ⅰ表达降低(P0.05)。与Con组比较,HG组PPARγ降低(P0.05),p-GSK3β、β-catenin、细胞核β-catenin、Collagen Ⅳ、Collagen Ⅲ和Collagen Ⅰ蛋白表达升高(P0.05),与HG组比较,HG+PIO组PPARγ表达升高,p-GSK3β、β-catenin、细胞核β-catenin、Collagen Ⅳ、Collagen Ⅲ和Collagen Ⅰ表达降低(P0.05)。与HG组比较,HG+PPARγ组PPARγ表达升高(P0.05),p-GSK3β、β-catenin、Collagen Ⅳ和Collagen Ⅲ表达降低(P0.05)。结论吡格列酮可上调PPARγ表达,下调β-catenin表达,抑制Wnt/β-catenin通路活化,减少ECM沉积,延缓糖尿病肾脏纤维化的发生发展。     

YAP调控Wnt信号通路影响肝癌细胞凋亡的研究

目的探讨Yes相关蛋白(Yes associated protein,YAP)对肝癌细胞凋亡的影响。方法 Western blotting方法检测人肝癌细胞Hu H-7、Hep G2、SNU-449和人正常肝细胞7702中YAP的表达水平。在肝癌细胞中转染YAP小干扰RNA1(YAP siRNA1组)和YAP小干扰RNA2(YAP siRNA2组),同时转染对照siRNA(siRNA-NC组),未转染组只加入转染试剂,培养48 h后,Western blotting检测细胞中YAP水平,筛选出干扰效率较高的YAP siRNA2继续研究。MTT检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞凋亡,激光扫描共聚焦显微镜法检测活性氧(ROS)水平,Western blotting检测细胞中β-连环蛋白(β-catenin)、Wnt信号通路下游靶基因(C-myc)、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Cleaved Caspase-3)蛋白水平。结果人肝癌细胞Hu H-7、Hep G2、SNU-449中YAP表达水平均高于人正常肝细胞7702,且在Hep G2细胞中YAP的表达水平最高。YAP siRNA1、YAP siRNA2能够成功干扰肝癌细胞中YAP的表达水平,且YAP siRNA2的干扰效率最高。YAP siRNA2组细胞存活率和细胞中β-catenin、C-myc水平均低于未转染组,凋亡率和细胞中Cleaved Caspase-3、ROS水平均高于未转染组(P0.01)。结论干扰YAP表达后能够促进肝癌细胞凋亡,抑制肝癌细胞增殖,Wnt信号通路是其可能的作用机制之一。     

miR-183调控Wnt/β-catenin信号通路影响胃癌SGC-7901细胞生物学特性的研究

背景 miR-183在胃癌、乳腺癌、膀胱癌等多种肿瘤组织中低表达,发挥抑癌基因的作用,但其在胃癌中作用机制目前尚不十分清楚.研究表明, miR-183可以通过调节Wnt/β-catenin信号通路抑制骨肉瘤细胞的生长、迁移和侵袭,而Wnt/β-catenin信号通路在胃癌中高度激活与胃癌的发生和转移密切相关.但miR-183是否调节Wnt/β-catenin信号通路影响胃癌细胞生物学特性尚不清楚.目的探讨miR-183调控Wnt/β-catenin信号通路对胃癌细胞生物学特性的影响.方法采用q RT-PCR检测miR-183在不同胃癌细胞株中的表达情况,在胃癌细胞SGC-7901中转染miR-183mimics或mimics对照,分别设为miR-183组和miR-NC组, qRT-PCR检测转染效率,噻唑蓝增殖实验检测SGC-7901细胞增殖变化,流式细胞仪检测SGC-7901细胞凋亡情况, Transwell实验检测SGC-7901细胞侵袭和迁移能力, Western blot法检测凋亡相关及Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白表达水平.使用Wnt/β-catenin信号通路激动剂氯化锂处理过表达miR-183的SGC-7901细胞,观察SGC-7901细胞生物学特性的变化.结果与正常胃黏膜上皮GES-1细胞相比, 4株胃癌细胞中miR-183的表达水平明显降低(P 0.05).转染miR-183mimics后SGC-7901细胞中miR-183的表达水平显著升高(P0.05).过表达miR-183后SGC-7901细胞OD值降低(P0.05),凋亡率、Bax和Cleaved Caspase-3蛋白表达水平升高(P 0.05),侵袭和迁移细胞数减少(P0.05),β-catenin、p-GSK-3β和Cyclin D1蛋白表达水平下调(P0.05), GSK-3β蛋白表达水平上调(P 0.05).激活Wnt/β-catenin信号通路部分逆转了过表达miR-183对SGC-7901细胞增殖、侵袭和迁移的抑制作用及凋亡促进作用(P0.05).结论miR-183可能通过抑制Wnt/β-catenin信号通路阻碍人胃癌SGC-7901细胞增殖、侵袭和迁移能力,促进细胞凋亡.     

DNA甲基转移酶及分泌型卷曲相关蛋白1在糖尿病肾脏疾病大鼠肾组织中的表达研究

目的 探讨DKD大鼠肾组织中DNA甲基转移酶(Dnmts)及分泌型卷曲相关蛋白1(Sfrp1)的表达变化及意义。方法 16只雄性SD大鼠随机分为DKD组与正常对照(NC)组,每组8只。造模成功10周后处死,检测相关生化指标并计算肾脏指数(KI);HE、Masson染色观察肾组织病理学改变;Western blot检测Dnmts、Sfrp1、β-catenin、GSK3β、p-GSK3β、col-Ⅲ、col-Ⅳ蛋白表达变化;q-PCR检测Sfrp1mRNA表达水平;分析Sfrp1与Dnmts相关性。结果 与NC组比较,DKD组血糖[(8.51±1.19)vs(21.00±2.24)mmol/L]、24hUAlb[(12.22±4.91)vs(65.31±18.03)mg]、KI[(6.80±0.53)vs(12.15±1.57)mg/g]均增高(P0.01);Dnmt1、Dnmt2、Dnmt3a、Dnmt3b、β-catenin、p-GSK3β蛋白表达水平上调(P0.05);Dnmt3l未见明显变化;Sfrp1 mRNA和蛋白表达水平均下调(P0.05);Dnmt1、Dnmt2、Dnmt3a、Dnmt3b与Sfrp1的蛋白表达呈负相关(r=-0.811、-0.692、-0.855、-0.858;P0.01);与Dnmt3l无相关性(r=-0.262,P=0.411)。结论 DKD大鼠肾组织Dnmts蛋白表达增加,可能引起sfrp1表达下调,导致对Wnt信号通路的抑制作用减弱,Wnt信号通路异常活化并促进DKD时肾纤维化的发生发展。     

miR-26b通过信号通路Wnt调控肝癌细胞分化、增殖、凋亡

目的探讨miR-26b对肝癌细胞分化增殖凋亡的影响及机制。方法以qRT-PCR方法检测肝癌细胞SMMC-7721、HuH-7、HepG2和正常肝细胞HL-7702中miR-26b的表达水平。在肝癌细胞中转染miR-26b mimic、mimic control,qRT-PCR测定转染后细胞中miR-26b水平。CCK-8测定细胞增殖情况,流式细胞术测定细胞凋亡情况,Western印迹测定细胞中β-连环蛋白(catenin)、细胞周期蛋白(Cyclin)D1、剪切型含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Cleaved Caspase)-3、Bcl-2相关X蛋白(Bax)表达水平。结果 HL-7702细胞中miR-26b表达水平显著高于SMMC-7721、HuH-7、HepG2细胞(P0.05)。SMMC-7721细胞中miR-26b表达水平显著低于HuH-7、HepG2细胞(P0.05)。选用SMMC-7721细胞作为研究对象。转染miR-26b mimic后的细胞中miR-26b水平显著升高(P0.05)。高表达miR-26b后的肝癌细胞存活率显著降低,细胞凋亡率显著提高,细胞中促凋亡蛋白Cleaved Caspase-3、Bax水平也显著升高,细胞中Wnt关键蛋白β-catenin、CyclinD1水平显著降低(均P0.05)。结论 miR-26b诱导肝癌肝癌细胞凋亡,抑制肝癌细胞增殖,作用机制与抑制Wnt信号通路有关。     

microRNA-21靶向调控Wnt2基因对肝癌细胞HepG2增殖与迁移的影响

目的探讨分析microRNA-21(miR-21)靶向调控Wnt2基因对肝癌细胞HepG2增殖与迁移的影响。方法采用实时荧光定量PCR法检测肝癌细胞HepG2及正常肝细胞株LO2 miR-21的表达情况。对HepG2细胞转染miR-21抑制剂,分析转染后抑制剂组与对照组miR-21的表达情况、细胞增殖、迁移及凋亡情况,检测两组细胞Wnt2蛋白表达水平,并采用双荧光素酶报告基因实验验证miR-21与Wnt2基因的关系。计量资料两组间比较采用t检验。结果 HepG2细胞miR-21相对表达水平明显高于LO2细胞(1. 978±0. 035 vs 1. 586±0. 022,t=16. 424,P 0. 05)。转染miR-21抑制剂后,抑制剂组miR-21相对表达水平较对照组显著降低(0. 857±0. 017 vs 1. 684±0. 039,t=33. 669,P 0. 05)。转染miR-21抑制剂24、48、72 h后,抑制剂组HepG2细胞增殖能力均较对照组显著降低(P值均0. 05);抑制剂组穿过Tranwell小室的细胞数显著低于对照组(83. 72±15. 06 vs 147. 85±20. 64,t=4. 347,P 0. 05);抑制剂组细胞凋亡率明显高于对照组(25. 67%±3. 95%vs 10. 27%±2. 14%,t=5. 937,P 0. 05)。抑制剂组HepG2细胞的Wnt2相对表达水平明显低于对照组(0. 862±0. 127 vs 1. 306±0. 218,t=3. 048,P 0. 05)。TargetScan软件显示,miR-21抑制剂可显著抑制野生型Wnt2-3'UTR质粒转染细胞的荧光素酶活性(0. 972±0. 102 vs 0. 612±0. 092,t=4. 219,P 0. 05),而对突变型Wnt2-3'UTR质粒转染细胞的荧光素酶活性并无明显影响(0. 982±0. 093 vs 0. 911±0. 128,t=0. 972,P 0. 05)。结论抑制miR-21表达可有效抑制HepG2细胞增殖和迁移,促进HepG2细胞凋亡,并抑制Wnt信号通路的过度激活,可能成为肝癌治疗的潜在靶基因之一。     

干预磷脂酰肌醇蛋白多糖3基因转录联合抗肿瘤药物抑制肝癌细胞增殖的协同作用

目的探讨干预磷脂酰肌醇蛋白多糖(GPC)3基因转录和联合抗肿瘤药物对肝癌细胞增殖的抑制效果。方法构建4种GPC-3-shRNA质粒转染肝癌HepG2细胞,以realtime-PCR、Western Blot法观察GPC-3基因及蛋白表达水平,分析其与肝癌细胞增殖、凋亡的关系。计量资料两组间比较采用独立样本t检验,多组间比较采用单因素方差分析。结果 4种转染质粒中shRNA1转染HepG2细胞效率85%,在mRNA水平的沉默效率为89.3%,GPC-3蛋白表达显著抑制(P0.01)。shRNA1干扰组72 h HepG2细胞抑制率71.1%,与阴性组比较差异有统计学意义(t=18.092,P0.001);shRNA1干扰组肝癌细胞发生生物学特性改变,迁移抑制率为89.1%,明显慢于阴性组,差异有统计学意义(t=8.326,P0.001);HepG2细胞运动抑制率为53.6%、侵袭抑制率60.1%,与阴性组比较差异均有统计学意义(t值分别为52.400、48.245,P值均0.001)。shRNA1干扰组β-catenin mRNA抑制率为46.9%,Gli1 mRNA上调率为7.4%,与对照组比较差异均有统计学意义(t值分别为30.108、-3.551,P值分别为0.001、0.009)。在24 h时,10μmol/L索拉非尼与shRNA1联合,对肝癌细胞抑制率为52.6%,100μmol/L索拉非尼与shRNA1联合,对肝癌细胞的抑制率为79.5%,与对照组比较差异有统计学意义(t值分别为23.314、50.352,P值均0.001)。索拉非尼对HepG2细胞的半数抑制浓度(IC_(50))值为(4.67±1.20)μmol/L、雷帕霉素为(7.85±2.00)nmol/L、厄洛替尼为(18.36±0.56)μmol/L,与shRNA1联合使用后HepG2细胞抑制率达95.11%。结论特异性shRNA干预GPC-3转录可抑制肝癌细胞增殖、迁移运动和侵袭能力,并诱导肝癌细胞凋亡,与抗肿瘤药物协同抑制癌细胞增殖,提示GPC-3可能是肝癌治疗有效靶点,联合靶向治疗将为肝癌提供更佳治疗策略。     

Wnt信号通路在结肠癌中的表达及其作用机制

目的探讨Wnt信号通路在结肠癌中的表达及其相关的分子机制。方法用酶联免疫吸附法(ELISA)检测所有参与者(65例结肠癌和30例健康人)血清中半乳糖凝集素(galectin)-3的含量,观察galectin-3和人结肠癌发病的关系,荧光实时定量PCR检测人结肠癌组织和癌旁组织中相关基因的表达。Western印迹检测人结肠癌组织和癌旁组织中相关蛋白的表达水平,包括轴蛋白基因(AXIN)、β-catenin,c-myc和cyclin D1蛋白。结果血清中的galectin-3水平在结肠癌Ⅲ期患者血清中的含量较健康对照组明显升高(P0.01)。结肠癌组织中AXIN mRNA表达水平下降,β-catenin mRNA表达水平不变但其下游分子c-myc和cyclin D1基因的表达水平升高。β-catenin、c-myc和cyclin D1蛋白水平均升高,Wnt信号通路明显激活。结论在结肠癌患者血清中galectin-3水平明显升高,AXIN表达水平降低,其可以活化Wnt信号通路,激活后的Wnt信号通路通过β-catenin上调细胞增殖相关因子c-myc和cyclin D1水平的升高,促进结肠癌细胞的增殖。     

SOX1过表达抑制食管癌细胞的增殖并促进凋亡的发生

目的 探索SOX1过表达对食管癌细胞增殖及凋亡的作用及其机制。方法 构建SOX1过表达细胞株，检测SOX1 mRNA和蛋白表达，CCK-8检测细胞增殖，细胞划痕及结晶紫染色检测细胞的迁移及克隆形成能力，Hochest染色实验检测细胞凋亡情况，Western blotting检测GSK-3β及Wnt/β-catenin通路相关蛋白表达水平。结果 SOX1过表达组mRNA显著高于对照组(P<0.01)。CCK-8 OD值及增殖曲线绘制表明SOX1过表达组增殖速率显著降低(P<0.05);SOX1过表达组细胞的迁移速率和克隆形成能力明显下降(P<0.05);显微镜下观察到SOX1过表达组细胞的皱缩明显，提示凋亡的发生；Western blotting检测结果表明，SOX1过表达组GSK-3β上调，Wnt信号通路相关基因β-catenin、Cyclin D1、c-Myc蛋白表达明显下降(P<0.05)。结论 SOX1通过抑制Wnt/β-catenin信号传导抑制食管癌细胞的增殖和促进凋亡。     

磷脂酰肌醇蛋白聚糖3转录干预对肝癌细胞侵袭和血管新生的抑制作用

目的 探讨磷脂酰肌醇蛋白聚糖3 (GPC-3)特异性短发夹RNA (shRNA)对肝癌细胞侵袭和血管新生的抑制作用与机制.方法 将GPC-3特异性shRNA转染肝癌细胞,检测GPC-3 mRNA及蛋白表达的变化;分析其对细胞增殖、凋亡及细胞侵袭能力的影响.样本均数两两比较采用独立样本t检验,多样本均数比较采用单因素方差分析.结果 shRNA转染肝癌细胞的效率大于80％,GPC-3 shRNA1转染HepG2、MHCC-97H和Huh7肝癌细胞后,GPC-3 mRNA水平分别为2.13±1.10、4.94±0.59、3.66±0.32,与空白对照组的19.34±0.90、20.24±1.61、13.97±1.15相比,t值分别为21.786、15.473、15.004,P值均＜0.001,差异均有统计学意义,且GPC-3 shRNA1可明显诱导细胞凋亡,抑制肝癌细胞增殖、运动及侵袭能力.HepG2、MHCC-97H和Huh7肝癌细胞干扰组β-连环蛋白mRNA表达分别为6.82±0.21、4.01±0.52和5.47±0.90,与阴性对照组的12.52±0.30、12.03±0.98、12.45±0.26比较,t值分别为26.903、12.578和12.870,P值均＜0.001,差异均有统计学意义;Glil mRNA水平分别为9.78±1.35、10.78±1.15和10.93±0.97,与阴性对照组的6.49±0.72、6.80±0.79、10.03±0.97比较,t值分别为-3.730、-4.918和-3.083,P值均＜0.05,差异均有统计学意义.GPC-3 shRNA1还可下调HepG2和MHCC-97H细胞胰岛素样生长因子Ⅱ和血管内皮生长因子表达.结论 GPC-3shRNA1可下调GPC-3 mRNA水平,通过Wnt/β-连环蛋白和Hedgehogs信号通路抑制癌细胞迁移、侵袭和血管新生,提示GPC-3为肝癌基因治疗潜在的分子靶目标.     

FoxO3a对胆管癌细胞增殖及凋亡的影响

目的研究叉头框转录因子O3a(FoxO3a)对胆管癌细胞增殖及凋亡的影响。方法胆管癌细胞RBE中转染FoxO3a过表达载体,qRT-PCR和Western blotting检测细胞中FoxO3a mRNA和蛋白水平,MTT检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞凋亡水平,Western blotting检测细胞中β-连环蛋白(β-catenin)、c-Myc、细胞周期蛋白D1(cyclin D1)、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Cleaved Caspase-3)蛋白水平。结果转染FoxO3a过表达载体后,RBE细胞中FoxO3a表达水平明显高于未转染的RBE细胞(P0.05),而转染对照载体的RBE细胞中FoxO3a表达水平与未转染的细胞相比,差异无统计学意义(P0.05)。转染FoxO3a过表达载体后RBE细胞A值从0.73±0.12降低至0.52±0.04,细胞凋亡率从(8.36±0.68)%升高至(25.62±2.52)%,细胞中Cleaved Caspase-3水平也升高,β-catenin、c-Myc、cyclin D1蛋白水平降低,与未转染的细胞相比,差异有统计学意义(P0.05)。结论 FoxO3a表达上调后可以抑制胆管癌细胞增殖,诱导细胞凋亡,增加Cleaved Caspase-3的活化水平,抑制Wnt信号通路激活。     

肝癌细胞中Wnt/β-连环素信号通路与caspase-3、X连锁凋亡抑制蛋白和葡萄糖调节蛋白78的表达

目的 研究肝细胞癌中Wnt/β-连环素信号传导通路与caspase-3、X连锁凋亡抑制蛋白(XIAP)、葡萄糖调节蛋白78(Grp-78)、热休克蛋白(HSP)27的关系及其意义.方法 用RNAi技术将针对β-连环素的siRNA转染入肝癌HepG2细胞中沉默β-连环素基因表达,于72、96h提取蛋白质,用Western blot法检测β-连环素、caspase-3、XIAP、Grp-78、HSP27蛋白质的表达.用方差分析的方法进行统计学分析.结果 对照组、转染72h组、转染96h组β-连环素蛋白质表达的灰度值分别为18.9、1.5和3.2 ; β-肌动蛋白表达的灰度值分别为41.1、45.6和47.8 ;caspase-3蛋白质表达的灰度值分别为49.8、5.2和45.1 ; p-caspase-3蛋白质表达的灰度值分别为16.0、67.7和16.3 ; XIAP蛋白质表达的灰度值分别为28.2、21.9和49.9 ; Grp-78蛋白质表达的灰度值分别为23.3、49.9和26.8 ; HSP27蛋白质表达的灰度值分别为29.6、34.8和35.6 ; β-肌动蛋白表达的灰度值分别为32.1、33.6和34.2.针对β-连环素的siRNA转染肝癌HepG2细胞72h和96h均可抑制β-连环素蛋白质的表达(F=160.72,P＜0.01),而96h比72h的表达略有增加,差异有统计学意义.caspase-3的蛋白质表达于72 h被抑制,96h升高恢复至原有水平(F=136.10,P＜0.01);而p-caspase-3的蛋白质表达于72h增加,96h减少至原有水平(F=98.65,P＜0.01).XIAP的蛋白质表达于72 h被抑制,96h表达升高(F=37.29,P＜0.01).Grp-78的蛋白质表达于72 h增加,96h减少至原有水平(F=58.72,P＜0.01).HSP27的蛋白质表达转染前后一致,差异无统计学意义.结论 HepG2细胞中,Wnt/β-连环素信号传导通路与caspase-3、XIAP、Grp-78蛋白质的表达有关,而与HSP27的蛋白质表达无关.Wnt/β-连环素信号传导通路正是通过调节这些因子参与HepG2细胞凋亡及增殖、分化等调节.     

GSK-3β特异siRNA腺病毒对脐静脉内皮细胞增殖的影响

目的 以糖原合成酶激酶3B(GSK-3β)特异的RNA干扰(RNAi)腺病毒表达载体作为研究工具,初步探讨Wnt/β-连环蛋白(Wnt/β-catenin)信号通路对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)增殖的影响.方法 利用体外同源重组技术构建GSK-3β特异的siRNA腺病毒表达载体,在HEK293A细胞中包装并扩增病毒、空斑实验法测定病毒滴度.GSK-3β特异的RNAi腺病毒感染HUVEC,Western印迹和免疫细胞化学法检测其对GSK-3β和β-catenin蛋白表达的影响,以四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测细胞增殖.结果 成功构建了GSK-3β特异的siRNA腺病毒表达载体,获得高滴度的腺病毒液.构建的重组腺病毒感染HUVEC显著抑制GSK-3β蛋白的表达,增加β-catenin的蛋白表达.重组腺病毒感染3、5、7 d后,细胞增殖率明显增加(P<0.05或P<0.01).结论 构建的GSK-3β特异的siRNA腺病毒能有效抑制GSK-3β基因的表达,促进β-catenin的蛋白表达,上调Wnt/β-catenin信号通路对人脐静脉内皮细胞增殖有重要的影响.     

靶向抑制胃癌细胞中TROP2基因的表达对胃癌细胞增殖及凋亡的影响研究

目的探讨RNA干扰肿瘤相关钙信号传导因子2(TROP2)基因的表达对胃癌细胞增殖及凋亡的影响及机制。方法以人胃黏膜正常细胞GES-1作为对照,RT-PCR检测人胃癌SGC-7901、MNK-28、BGC-823细胞中TROP2 mRNA表达;TROP2 siRNA、Control siRNA转染SGC-7901细胞,不作任何处理的细胞作为空白对照组,48 h后Western blotting检测TROP2、Ki67、Cleaved caspase3、β-catenin、Cyclin D1蛋白表达;CCK8实验和流式细胞仪分别检测细胞的增殖及凋亡情况。结果 TROP2 mRNA在人胃癌SGC-7901、MNK-28、BGC-823细胞表达均显著高于GES-1细胞(P0.01),TROP2基因在SGC-7901细胞中的表达最高,选择作为后续的研究对象;转染TROP2 siRNA后TROP2蛋白表达显著降低(P0.01);与对照组及Control-siRNA组比较,TROP2-siRNA组细胞存活率及Ki67、β-catenin、Cyclin D1蛋白表达显著降低,细胞凋亡率及Cleaved caspase3蛋白表达显著升高(P0.01)。结论RNA干扰抑制TROP2基因的表达可降低胃癌细胞的增殖及诱导细胞凋亡,其机制是下调Wnt/β-catenin信号通路。