蛋白酶体抑制剂MG132对脑室室管膜下区神经干细胞增殖潜能的影响

目的: 观察侧脑室注射蛋白酶体抑制剂MG132对脑室室管膜下区(SVZ)神经干细胞(NSCs)增殖能力的影响,了解蛋白酶体对NSCs增殖潜能的调控作用,从而进一步探讨蛋白酶体在帕金森病(PD)等老年性疾病神经元损伤中的可能作用机制。方法: 选90日龄健康BALB/c小鼠,左侧侧脑室注射10 μg MG132,于注射后3 d、7 d、14 d提取SVZ总蛋白,荧光酶标仪检测蛋白酶体活性。同时腹腔注射5-溴-2'-脱氧尿嘧啶核苷(BrdU),BrdU免疫荧光染色标记NSCs,动态观察蛋白酶体活性改变对NSCs增殖能力的影响。另设溶剂对照组左侧侧脑室注射等剂量DMSO,进行上述实验。结果: 侧脑室注射MG132 3 d、7 d后,SVZ蛋白酶体活性较DMSO对照组显著降低(P<0.05),同时SVZ BrdU⁺ NSCs也显著减少至21±4和22±3,与DMSO对照组相比差异显著(P<0.05)。随着MG132注射时间延长,14 d后SVZ蛋白酶体活性恢复至正常水平(P＞0.05),BrdU⁺ NSCs数量MG132组(82±4)与DMSO组(67±6)相比无显著差别(P＞0.05)。结论: 应用蛋白酶体可逆性抑制剂MG132短时期内能显著抑制SVZ蛋白酶体活性,并且能够降低NSCs增殖能力,提示蛋白酶体活性与NSCs增殖潜能密切相关。     

18α-GA激活Nrf2对成体神经干细胞的影响

目的:明确18α-甘草次酸(18α-GA)对核因子E2相关因子2(Nrf2)的激活作用,观察上调Nrf2对成体神经干细胞(a NSCs)增殖和分化能力的影响,探讨维持a NSCs活力的有效途径。方法:体外培养新生、成年和老年小鼠的侧脑室室膜下区神经干细胞(NSCs),观察随年龄增长NSCs中Nrf2的表达变化。以18α-GA作用a NSCs,用real-time PCR和Western blot实验比较18α-GA组与DMSO对照组a NSCs的Nrf2表达变化。构建携带绿色荧光蛋白(GFP)基因的Nrf2-shRNA慢病毒载体(LV)感染a NSCs,用real-time PCR和Western blot实验检测shRNA对Nrf2的沉默效率。将a NSCs按照干预条件不同分为DMSO组、18α-GA组、LV-GFP组和LV-Nrf2-shRNA组,运用Brd U掺入实验、Tuj1免疫荧光染色、CCK-8实验、Hoechst 33342/PI双染色和活性氧簇(ROS)水平测定等方法评价18α-GA是否通过激活Nrf2对a NSCs的增殖、分化、细胞活力、细胞凋亡以及氧化应激水平产生影响。结果:随年龄增长,成年和老年小鼠a NSCs的Nrf2 mRNA表达水平较新生小鼠NSCs显著降低(P0.01),但a NSCs的ROS水平显著高于新生小鼠NSCs(P0.05)。应用18α-GA后,a NSCs的Nrf2 mRNA与蛋白表达水平较DMSO组明显升高(P0.01),并且a NSCs的Brd U阳性率也显著增加(P0.01)。2 mg/L 18α-GA作用后,a NSCs的Tuj1阳性率和细胞活力较DMSO组显著升高(P0.05),而凋亡率和ROS水平显著下降(P0.05和P0.01)。但是,敲减a NSCs的Nrf2并应用18α-GA干预后,LV-Nrf2-shRNA组Brd U阳性率、Tuj1阳性率以及细胞活力均较LV-GFP组显著下降(P0.05),ROS水平却显著上升(P0.05)。结论:18α-GA可能通过激活Nrf2提高a NSCs的抗氧化能力,促进a NSCs增殖和分化,维持a NSCs潜能。     

靶向PSMB5基因的shRNA慢病毒载体对神经干细胞增殖和分化潜能的影响

目的:优化20S蛋白酶体β5亚单位(proteasome subunit beta type-5,PSMB5)-shRNA慢病毒感染神经干细胞(neural stem cells,NSCs)的方案,观察PSMB5表达下调对NSCs增殖和分化能力的影响,探讨调控NSCs潜能的分子机制。方法:构建携带绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)基因的PSMB5-shRNA慢病毒载体,并设错义序列对照,感染新生小鼠(postnatal day 0,P0)NSCs。倒置荧光显微镜观察GFP阳性率,计算感染率,RT-PCR、免疫印迹和荧光分光光度法检测PSMB5沉默效率和蛋白酶体活性。比较对照组和shRNA组神经球的数量和直径,利用CCK-8实验观察PSMB5基因沉默对NSCs增殖潜能的影响。Tuj1染色观察PSMB5基因沉默对NSCs分化能力的影响。结果:PSMB5-shRNA慢病毒感染NSCs 24 h后可见GFP荧光表达,48 h达峰值,传代后可见GFP稳定表达。其感染复数MOI为40,polybrene 3μg/ml时,感染48 h GFP阳性率可达92.5%±2.3%;PSMB5-shRNA组PSMB5 mRNA和蛋白表达水平分别较对照组降低66.49%±4.81%(P0.001)和33.1%±2.54%(P0.001)。PSMB5-shRNA组蛋白酶体活性较对照组下降43.4%±1.48%(P0.01)。shRNA组NSCs的增殖能力降低,神经球数量为126.5±8.4显著低于对照组163.5±9.5(P0.01),神经球的平均直径为29.9μm±2.6μm显著低于对照组42.9μm±2.3μm(P0.01)。CCK-8结果表明PSMB5-shRNA组细胞吸光度值0.36±0.04,显著低于对照组0.59±0.03(P0.001),PSMB5-shRNA组Tuj1+阳性率为39.13%±8.14%,较对照组显著降低(P0.01)。结论:PSMB5基因沉默可降低NSCs蛋白酶体活性抑制P0期小鼠NSCs增殖分化能力。     

p53对体外神经干细胞增殖能力的影响

目的:探讨p53对神经干细胞(neural stem cells,NSCs)增殖能力的影响,寻求维持NSCs活力的有效途径。方法:分离出生后0 d(postnatal day 0,P0)和生后90 d(postnatal day 90,P90)小鼠前脑室管膜下区(subventricular zone,SVZ)组织,培养NSCs。比较P0和P90 NSCs增殖能力并通过q PCR和Western Blot检测衰老相关分子p53和p21在新生和成年NSCs的表达变化。应用p53抑制剂PFT-α(20μmol/L)连续作用于P90 NSCs 72 h,通过Brd U掺入实验和CCK-8实验,分析抑制p53对NSCs增殖能力的影响。结果:随年龄增加,NSCs的增殖能力降低,P90组神经球的数量和直径分别是P0组的22.9%±1.2%(P0.01)和63.5%±3.7%(P0.05)。P90NSCs p53和p21 mRNA表达水平分别较P0 NSCs显著增高了1.4±0.05和1.2±0.04(P0.01)。Western Blot结果证明P90 NSCs p53蛋白的表达水平比P0 NSCs增加了1.2±0.01倍(P0.05)。经p53抑制剂PFT-α连续处理P90 NSCs 72 h后,CCK-8结果显示PFT-α组吸光度值1.1±0.02高于DMSO组0.8±0.03(P0.05),Brd U掺入实验也显示PFT-α组Brd U阳性细胞率为43.3%±4.0%显著高于DMSO组24.8%±3.1%(P0.05)。结论:p53信号通路激活可能是导致成年小鼠NSCs增殖能力下降的重要因素,应用p53抑制剂PFT-α能够增加成年NSCs的增殖能力。     

叔丁基对苯二酚激活蛋白酶体活性促进成年小鼠神经干细胞增殖与分化

目的:探讨叔丁基对苯二酚(tBHQ)对成年小鼠神经干细胞(aNSCs)增殖分化能力的影响,寻找维持aNSCs活力的有效手段。方法:成年BALB/c小鼠腹腔注射tBHQ(每日16.7 mg/kg)7 d,收集室管膜下区(SVZ)的脑组织,应用荧光酶标仪定量检测其蛋白酶体的活性;同时小鼠腹腔注射5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU),Brd U免疫荧光染色检测SVZ内a NSCs的增殖能力。分离培养SVZ aNSCs,tBHQ(20μmol/L)作用7 d,分析比较tBHQ组与DMSO组a NSCs的蛋白酶体活性、BrdU阳性率以及形成神经球的数量和直径。应用1%的胎牛血清诱导a NSCs分化,早期神经元标记物β-Ⅲ微管蛋白(Tuj1)免疫荧光染色并比较tBHQ组与DMSO组a NSCs向神经元分化的能力。结果:小鼠腹腔注射tBHQ,其SVZ蛋白酶体活性较DMSO对照组上调12.9%±4.6%(P0.05),并且BrdU标记实验显示tBHQ组阳性细胞数为31.3±6.3,与DMSO对照组(15.4±1.3)比较,aNSCs增殖能力显著提高(P0.05)。体外实验结果也显示tBHQ组aNSCs蛋白酶体活性较DMSO对照组上升10.1%±0.8%(P0.01)。tBHQ组Brd U阳性率(31.3%±3.2%)是DMSO对照组(20%±1.5%)的1.6倍(P0.05)。tBHQ组神经球的数量和直径分别是DMSO对照组的1.7倍(P0.05)和1.4倍(P0.05),提示tBHQ促进aNSCs的自我更新。此外,tBHQ组Tuj1阳性率为26.5%±1.6%,较DMSO对照组18.6%±2.1%显著提高(P0.05),提示tBHQ能够促进a NSCs向神经元方向分化。结论:tBHQ能够上调蛋白酶体活性,促进aNSCs的增殖与分化。     

蛋白酶体功能障碍通过激活P53抑制人骨髓间充质干细胞增殖

 目的：明确蛋白酶体活性下降导致人骨髓间充质干细胞（hBMSCs）增殖能力降低的机制,探讨P53在此过程中的调控作用,以期为组织工程提供数量充足且活性优良的种子细胞。方法：检测早期（第3~4代）与晚期（≥14代） hBMSCs蛋白酶体活性及P53表达变化。将早期hBMSCs分为DMSO对照组、蛋白酶体抑制剂MG132组（10 μmol/L MG132作用4 h）和P53抑制剂pifithrin-α（PFT-α）+ MG132组（20 μmol/L PFT-α预干预1 h,随后加入10 μmol/L MG132作用4 h）,通过BrdU掺入实验和流式细胞术观察细胞增殖能力及细胞周期分布。随后将PFT-α直接作用于晚期hBMSCs,通过BrdU掺入实验检测P53抑制剂对晚期细胞增殖能力的影响。结果：体外培养晚期hBMSCs伴随蛋白酶体活性降低,P53表达水平较早期细胞上调16.89%±4.44%（P<0.05）。给予MG132能够显著抑制hBMSCs增殖,BrdU阳性率降低至33.36%±2.24%（P<0.01）;但是若提前给予PFT-α则能部分拮抗MG132对hBMSCs增殖能力的影响,BrdU阳性率上升至49.23%±2.67%（P<0.05）。流式细胞术结果显示,PFT-α+ MG132组各期细胞分布与DMSO对照组相似,增殖指数显著高于MG132组（P<0.01）。抑制P53激活能够显著提高晚期hBMSCs增殖能力,BrdU阳性率较对照组升高24.73%±8.35%（P<0.01）。结论：传代晚期hBMSCs蛋白酶体活性下降可能通过激活P53、影响细胞周期进程进而导致hBMSCs增殖潜能下调。     

mfn2基因转染对非酒精性脂肪肝细胞线粒体功能的影响

目的:研究线粒体融合蛋白基因2(mfn2)对非酒精性脂肪肝细胞线粒功能的影响。方法:利用脂质体lipofectamine2000将mfn2基因荧光表达载体(pEGFP-mfn2)转染肝细胞株L02,并采用油酸诱导L02建立非酒精性脂肪性肝细胞模型,RT-PCR及Western blotting检测细胞mfn2mRNA和蛋白的表达;荧光素酶ADP/ATP发光法检测各组细胞内ATP水平,荧光探针DCFH-DA测定细胞活性氧(ROS)生成水平;JC-1标记细胞线粒体,流式细胞仪检测线粒体跨膜电位(Δψm)的变化。结果:转染mfn2基因的L02可以稳定高表达mfn2mRNA及蛋白,转染后L02内ATP浓度及线粒体跨膜电位显著升高(P0.05),而ROS生成水平则显著下降(P0.05);经油酸诱导肝细胞脂肪变性后,L02mfn2表达受抑制,各组细胞内ATP浓度及线粒体跨膜电位均显著下降(P0.01),而ROS生成水平较前均显著升高(P0.01),但转染组细胞内ATP下降水平以及线粒体跨膜电位下降幅度均显著低于未转染组,而未转染组ROS升高程度则显著高于转染组(P0.01)。结论:外源性mfn2基因转染可以抑制油酸诱导的肝细胞内ATP浓度和线粒体跨膜电位的下降以及ROS生成的增加。     

20S蛋白酶体β5亚单位对小鼠神经干细胞增殖和分化能力的影响

目的:探讨20S蛋白酶体β5亚单位(PSMB5)对小鼠神经干细胞(NSCs)增殖和分化能力的影响。方法:体外分离培养新生BALB/c小鼠(P0)的NSCs,应用免疫荧光染色观察PSMB5在NSCs中的表达与分布;利用real time RT-PCR方法检测PSMB5 mRNA的表达;荧光分光光度法测定PSMB5相关的糜蛋白酶活性的变化;应用PSMB5-siRNA抑制P0 NSCs中PSMB5基因的表达;使用含有PSMB5基因的重组慢病毒((lentiPSMB5))感染成年小鼠(P90) NSCs。利用CCK-8试验检测PSMB5对NSCs增殖能力的影响,利用BrdU和Tuj1染色观察PSMB5基因敲低和过表达对NSCs增殖及分化能力的影响。结果:PSMB5主要分布于NSCs的胞浆,P0的NSCs分化后,PSMB5 mRNA的表达下调。成年和老年小鼠NSCs中糜蛋白酶体活性较新生小鼠显著降低。PSMB5敲减后NSCs增殖能力和向神经元分化能力减弱,PSMB5过表达后NSCs增殖能力和向神经元分化能力增强。结论:PSMB5可能参与小鼠NSCs增殖及分化的调控。     

18α-甘草次酸通过抗氧化作用促进成年小鼠室管膜下区神经干细胞增殖

目的 探讨18 α-甘草次酸(18α-GA)对成年小鼠室管膜下区(SVZ)神经干细胞(NSCs)增殖的影响及其机制.方法 100只6月龄BALB/c小鼠随机平均分为18α-GA组(腹腔注射18α-GA 40 mg/kg两个月,以DMSO为溶解介质)和DMSO对照组(腹腔注射含等体积DMSO溶解介质的PBS溶液),每组5...     

丙泊酚减轻H2O2诱导的心肌细胞系H9C2损伤

目的研究丙泊酚对过氧化氢(H_2O_2)诱导的心肌细胞系H9C2损伤及活性氧(ROS)水平的影响。方法将心肌细胞分成对照组、H_2O_2处理组和15、30和60μmol/L丙泊酚干预组。MTT检测细胞活力;二硝基苯肼显色法检测乳酸脱氢酶(LDH)漏出率;流式细胞计量术检测细胞凋亡;Western blot检测细胞中激活型caspase-3(cleaved caspase-3)、胞质和线粒体中细胞色素C(cytochrome C)蛋白水平;黄嘌呤氧化法检测超氧化物歧化酶(SOD)活性;钼酸铵法检测过氧化氢酶(CAT)活性;二硫代二硝基苯甲酸法检测谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性;硫代巴比妥酸法检测丙二醛(MDA)含量;二氯二氢荧光素-乙酰乙酸酯法检测ROS活性;JC-1法检测线粒体膜电位。结果与对照组比较,H_2O_2处理组细胞活力降低;LDH漏出率和凋亡率升高;cleaved caspase-3蛋白水平及胞质中cytochrome C水平升高;线粒体cytochrome C水平降低;SOD、CAT和GSH-Px活性降低;MDA及ROS含量升高;线粒体膜电位下降(P0.05)。与H_2O_2处理组比较,15、30和60μmol/L丙泊酚组细胞活性升高;LDH漏出率降低;凋亡率和cleaved caspase-3水平降低;胞质中cytochrome C蛋白水平减少;线粒体中cytochrome C水平升高;细胞SOD活性、CAT活性和GSH-Px活性升高;MDA含量和ROS含量降低;线粒体膜电位升高(P0.05)。结论丙泊酚可以减轻H_2O_2诱导的心肌细胞损伤,减少细胞凋亡并降低细胞ROS水平。     

卡维地洛对自身免疫性心肌炎的免疫调节作用

目的通过检测心肌组织中细胞因子表达量的变化来评价卡维地洛对大鼠实验性自身免疫性心肌炎（EAM）的治疗效果及其作用机制。方法大鼠接种肌球蛋白后被分为两组,治疗组每日给予卡维地洛,对照组给予赋形剂,治疗效果在第21天进行评价。结果实验组心肌炎症面积23．07％±1．6％与对照组33．65％±2．71％相比明显减少（P〈0．0001）,左室短轴缩短率43．52％±3．53％与对照组32．3％±3．31％相比明显提高（P=0．0021）。治疗组中心力衰竭标示物心钠肽的表达量（7．28×10^6±0．49×10^6绝对复制数／总RNAμg）明显低于对照组（32．67×10^6±2．78×10^6绝对复制数／总RNAμg）,（P〈0．0001）。治疗组炎性细胞因子IL-1β的表达量（0．298±0．04）明显低于对照组（0．818±0．252）,（P=0．0005）,而抗炎性细胞因子IL-1受体拮抗剂的表达量在治疗组0．112±0．009明显高于对照组（0．051±0．002）,（P〈0．0001）。结论卡维地洛对EAM有良好的治疗效果,其治疗机制可能是通过抑制炎性细胞因子同时增加抗炎性细胞因子等免疫调节作用而发挥。     

乳酸链球菌素诱导氧化应激促进人骨肉瘤MG63细胞凋亡

目的:探讨乳酸链球菌素(nisin)对人骨肉瘤MG63细胞凋亡及其相关的氧化应激机制.方法:乳酸链球菌素单独或联合抗氧化剂N-乙酰-L-半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine,NAC)处理MG63细胞后,采用CCK-8法检测细胞活力;annexin-V/PI双染法检测细胞凋亡;2',7'-二氯荧光素二乙酸酯(...     

肿瘤标记物联合检测对肿瘤高危人群筛查的临床意义

目的 研究应用肿瘤标记物联合检测对恶性肿瘤高危人群筛查的临床价值.方法 选择血清肿瘤标记物组合对3 766例恶性肿瘤高危人员进行检测,对肿瘤标记(CA125、CEA、Cyfra21-1、CA19-9、AFP、NSE、CA72-4、SCC、CA153)升高人员进一步行颈胸部CT、腹盆部CT或内窥镜检查,女性进行妇科检查,未明确诊断者进行长期随访(大于6个月).结果 经过随访,共发现肿瘤患者69例,其中发现肿瘤标志物升高6个月内诊断为恶性肿瘤20例(62.5％),6个月至1年诊断5例(15.6％),1年至2年诊断4例(12.5％),2年至3年诊断2例(9.4％).COX分析显示肿瘤标志物升高的程度(RR=2.308,95％ CI:2.517 ～2.475,P＜0.001)、肿瘤标志物逐渐升高(RR=7.727,95％ CI:3.008 ～ 19.836,P＜0.05)和有相关临床症状(RR=7.879,95％ CI:2.357 ～ 26.384,P＜0.05)是筛查肿瘤标志物升高人员患肿瘤的危险因素.结论 血清肿瘤标记物联合检测对肿瘤筛查人群应答率高,危险因素调查是肿瘤筛查的有效手段.     

Bmi-1基因对人胚胎纹状体来源神经干细胞的自我更新和增殖的作用

目的 探讨人类纹状体来源的神经干细胞(NSCs)中,Bmi-1基因是否参与自我更新和增殖的维持. 方法 用human-Bmi-1干扰病毒和绿色荧光蛋白(GFP)对照病毒分别转染NSC,镜下观察转染效率.于转染后0h、48h、72h和168h 4个时间点收集细胞,用实时定量聚合酶链反应检测Bmi-1干扰组与同时间点GFP对照病毒转染组细胞中的Bmi-1基因的相对转录水平,1周后比较human-Bmi-1干扰病毒和GFP对照病毒转染后细胞的克隆形成数和新生神经球直径. 结果 经Bmi-1干扰病毒和GFP对照病毒转染后48h,显微镜下观察见细胞均带有绿色荧光,转染效率超过90%.与转染后0h的Bmi-1基因的相对转录水平(107.3±8.0618)%相比,48h、72h和168h的Bmi-1基因的相对转录水平下降,分别为(32.7±9.74)%、(24.4±12.15)%和(32.7±10.39)%,差异有统计学意义(P<0.05).经Bmi-1干扰后,细胞的克隆形成数和新生神经球直径都显著下降. 结论 Bmi-1基因正向调控人类纹状体来源的NSC的自我更新和增殖,当细胞内的Bmi-1转录水平下降时,细胞的克隆形成数和新生神经球直径也显著下降.     

三七总皂苷抑制心肌细胞凋亡的作用机制研究

目的探讨三七总皂苷（Ponax notoginsengsaponin,PNS）对无糖无血清／缺氧诱导的心肌细胞凋亡的抑制作用。方法将心肌H9c2细胞株分为正常对照组（control）、模型组（model）和PNS不同浓度（0．05、0．25、2．25g／L）组。对照组采用含10％胎牛血清（FBS）的DMEM／F12培养基于普通二氧化碳培养箱培养,模型组采用无糖无血清培养基培养,同时进行缺氧处理诱导细胞凋亡,给药组按照模型组方法处理的同时给予不同浓度的PNS。细胞处理结束后收集细胞．Annexin V／PI染色后流式细胞仪检测不同浓度PNS干预后各组细胞的凋亡率。DCFH-DA荧光探针检测细胞内活性氧的水平。Western blot检测Akt和磷酸化Akt（P—Akt）的表达水平。结果PNS能够抑制缺血环境诱导的心肌细胞凋亡．且呈剂量依赖性。对照组、模型组和PNS处理组细胞凋亡率分别为（8．01±1．44）％、（65．71±3．36）％（vs control P〈0．001）、（65．00±1．24）％、（52．51±1．76）％（vs model P〈0．01）、（23．99±0．76）％（vs model P〈0．001）。DCFH—DA染色结果显示,模型组细胞能够观察到明显的绿色荧光信号,而PNS组荧光信号与模型组比较明显减弱．说明PNS具有清除ROS的作用。Western blot结果显示与对照组比较,模型组p-Akt蛋白表达水平明显降低;与模型组比较,PNS组p-Akt蛋白表达水平显著升高,而P13K特异性抑制剂LY294002明显抑制PNS促进p-Akt表达的作用。结论PNS通过促进p-Akt的活性从而抑制缺血诱导的心肌细胞凋亡。