携带小鼠IGF-1基因的慢病毒载体构建及其在神经干细胞中的表达

目的:构建含有小鼠胰岛素样生长因子-1(IGF-1)基因的慢病毒载体,鉴定其在神经干细胞(NSCs)中的表达。方法:采用RT-PCR方法从小鼠的骨骼肌细胞中扩增IGF-1基因,克隆入pcDNA3.1质粒,构建慢病毒载体pXZ9-IGF-1。用脂质体介导三质粒共转染法转染293FT细胞,获得病毒上清。分离培养神经干细胞,Nestin免疫荧光化学鉴定。慢病毒感染神经干细胞,显微镜下观察GFP表达情况,通过RT-PCR及ELISA试剂盒分别从mRNA和蛋白水平检测IGF-1的表达。结果:通过RT-PCR法从小鼠的骨骼肌细胞中扩增出IGF-1基因并克隆入pcDNA3.1载体,经亚克隆成功构建慢病毒质粒pXZ9-IGF-1。质粒经脂质体转染293FT细胞获高滴度慢病毒颗粒,体外高效感染神经干细胞。神经干细胞经感染后,IGF-1基因mRNA和培养基中蛋白水平均高表达。结论:成功构建含小鼠IGF-1基因的慢病毒载体pXZ9-IGF-1,并在神经干细胞内获得表达。     

NSBP1基因干扰RNA慢病毒载体的构建及效应检测

目的 构建和鉴定NSBP1基因RNA干扰慢病毒表达载体。 方法 针对NSBP1 mRNA设计了3条siRNA,并构建pGCSIL-GFP-NSBP1慢病毒质粒,测序鉴定。用pGCSIL-GFP-NSBP1 、pHelper1.0和 pHelper2.0质粒共转染293T细胞包装产生慢病毒,测定病毒滴度。将慢病毒转染前列腺癌DU145细胞,Western-blot检测NSBP1表达, MTT法检测细胞生长活性,用转染细胞种植裸鼠成瘤,观察抑瘤效果。结果 PCR和测序证实,成功构建LV-shNSBP1的慢病毒载体,病毒滴度达2×108TU/ml。转染细胞中NSBP1蛋白表达显著降低,且MTT检测细胞生长活性明显减慢,转染细胞在裸鼠体内成瘤率没有影响,但对肿瘤的生长有明显抑制作用。结论 人NSBP1基因RNA干扰慢病毒载体的成功构建,且NSBP1对前列腺癌激素非依赖DU145细胞的生长具有重要作用。     

NR1、NR2A与PSD-95在生后大鼠海马发育中的表达

目的:探讨N-甲基-D-天冬氨酸受体亚单位1(N-methy1-D-aspartate receptor subunit1,NR1)、N-甲基-D-天冬氨酸受体亚单位2A(N-methy1-D-aspartate receptor subunit2A,NR2A)与突触后密度蛋白-95(Postsynapticdensity protein 95,PSD-95)在Wistar大鼠海马生后发育过程中的表达。方法:应用免疫荧光染色方法检测NR1、NR2A与PSD-95在生后不同时期大鼠海马CA1、CA3区和齿状回(DG)中的表达情况。结果:NR1于生后各期海马CA1、CA3区和DG的表达均增强,P14~P21达高峰期后减弱。NR2A于生后在海马CA1和CA3区的表达略有减弱,P4后增强至高峰期P14,然后轻微减弱,在DG中NR2A的表达生后略有减弱,P4后在增强的趋势中于P7、P14和P28后均有不同程度的减弱,高峰期在P28。PSD-95于生后各期海马CA1、CA3区和DG的表达均增强,P21~P28达高峰期后轻微减弱。结论:NR1、NR2A和PSD-95在CA1、CA3区和DG中的表达具有特异的时空分布模式,此模式可能与其在生后发育中发挥的不同生理功能相关。     

兔膜联蛋白A1基因短发夹RNA慢病毒载体构建与RNA干扰效率的鉴定*

背景：膜联蛋白A1参与细胞凋亡的调控。 目的：针对兔膜联蛋白A1基因构建短发夹RNA慢病毒载体,并检测其对成骨细胞的沉默效率。 方法：针对兔膜联蛋白A1基因设计RNA干扰靶序列,合成Oligo DNA,退火形成双链DNA,与BamHI和EcoRI 双酶切后的pGLV/H1/GFP载体连接成pGLV-shANXA1,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定。pGLV-shANXA1和pGLV/helper-1、pGLV/helper-2、pGLV/helper-3共转染293FT细胞包装产生慢病毒颗粒LV-shANXA1,并测定其滴度,随后将LV-shANXA1感染兔成骨细胞。 结果与结论：经PCR和测序证实构建片段大小及DNA序列与目标序列一致,shANXA1片段完全正确插入慢病毒载体pGLV/H1/GFP中。包装浓缩慢病毒颗粒LV-shANXA1的滴度为3.8×108 TU/L。经嘌呤霉素筛选后,感染复数为50时,LV-shANXA1对成骨细胞感染效率为80%;感染复数为100时,感染效率为95%。Real-time PCR 和Western blot检测显示,LV-shANXA1-901对膜联蛋白A1基因的沉默效率最高,在感染复数为50时,沉默效率可达71.2%。表明实验成功构建的兔膜联蛋白A1基因短发夹RNA慢病毒载体能够在细胞水平有效沉默靶基因。     

Siglec-1小干扰慢病毒载体的构建和干扰效率验证

目的 构建小干扰唾液酸黏附素(sialic acid-binding immunoglobulin-like lectin 1,Siglec-1)的慢病毒载体,并体外筛选出具有干扰效果的病毒载体.方法 利用软件设计3条Siglec-1 siRNA片段,并克隆到慢病毒pGCSIL-GFP质粒载体,再与pHelper 1.0载体和pHelper 2.0载体共转染293T细胞,培养48 h后,收集并浓缩富含慢病毒颗粒的细胞上清液.逐孔稀释法测定慢病毒滴度并转导原代培养的骨髓巨噬细胞(BMM),流式细胞术和实时荧光定量PCR筛选具有干扰效果的病毒载体.结果 成功构建3个vshRNA质粒载体和一个阴性对照质粒载体,并经测序验证序列正确.包装的慢病毒滴度介于1×108 ～ 1×109 TU/ml之间,适合体外转导及体内试验.体外转导BMM筛选出Lv-1能靶向抑制Siglec-1表达.结论 成功构建并筛选出具有体外干扰效果的小干扰Siglec-1慢病毒载体,为体内应用该病毒载体进行基因敲除实验奠定了基础.     

体外培养海马神经元NR1型受体表达的发育性变化

用免疫细胞化学方法检测了体外培养的大鼠海马神经元不同培养时期的 N-甲基 -D-天门冬氨酸受体 1型亚单位的免疫活性反应强度 ,并用图象分析方法进行了定量研究。结果显示 :体外培养的海马神经元的 N-甲基 -D-天门冬氨酸受体 1型亚单位的免疫反应强度 ,在培养第 1d时较弱 ,第 2 d、第 4d和第 7d时反应强度逐渐加强 ,分别为 1d的 2 .44、3 .82和 4.18倍 ,随后反应强度稍有下降 ,第 10 d、第 14 d分别为第 1d的 3 .71和 3 .65倍。表明 :体外培养的海马神经元在发育进程中 N-甲基 -D-天门冬氨酸受体 1型亚单位表达进行性增加 ;当神经元发育成熟时 ,则其表达不再增加。提示 :N-甲基 -D-天门冬氨酸受体 1型亚单位与神经功能成熟有关     

海马胆碱能刺激肽促进神经干细胞向神经元分化

目的探讨海马胆碱能刺激肽(HCNP)在神经干细胞向神经元分化过程中所起的作用。方法切割SD大鼠右侧穹窿海马伞,14天后取切割穹窿海马伞侧海马制成海马提取液;将神经干细胞接种于24孔板中,分为HCNP与海马提取液联合培养组、HCNP组以及空白对照组,每组八孔;细胞分化至14天时行Tuj-1、MAP-2免疫荧光检测;计数Tuj-1、MAP-2阳性神经元数及细胞周长,并观察胞体大小和突起长度。结果联合培养组Tuj-1、MAP-2阳性神经元最多,胞体大,突起长;HCNP组神经元数量较前组少,胞体较小,突起数量和长度均小于前组;对照组则仅有少量胞体小、突起短的神经元。HCNP与切割穹窿海马伞侧海马提取液联合培养组神经元成熟度优于其它两组。结论 HCNP对神经干细胞向神经元的分化具有明显促进作用。     

miR-146b过表达慢病毒载体构建及对海马神经干细胞增殖的影响

背景:目前越来越多的研究证实miR-146b在神经系统中发挥重要作用,其为神经系统性疾病提供新的治疗方向.目的:构建大鼠miR-146b过表达慢病毒载体,观察miR-146b过表达对原代海马神经干细胞增殖的影响.方法:①PCR扩增获得大鼠miR-146b全长序列,经酶切连接到慢病毒载体pLVX-Luciferase-P...     

新生大鼠海马神经干细胞的培养与传代

目的:探讨新生大鼠海马神经干细胞(neural stem cells,NSCs)分离培养的条件和传代新方法。方法:从新生大鼠海马中分离细胞,采用无血清培养技术,在表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)、碱性成纤维生长因子(basic fibroblast growth factor,b FGF)和B27联合作用下使其不断增殖克隆。采用机械吹打和神经小球分离试剂盒两种不同方法进行传代,利用免疫荧光染色的方法对培养的细胞进行鉴定。结果:从新生大鼠海马分离的细胞群可不断增殖形成细胞克隆球,并能稳定传代,呈nestin阳性表达,且具有多向分化能力。采用神经小球分离试剂盒传代的细胞球比机械吹打传代的细胞球生长快,数量多,体积大,折光性好。结论:利用无血清技术和特定生长因子,可以使来源于新生大鼠海马的NSCs在体外扩增,利用大鼠神经小球分离试剂盒可以有效地进行传代,稳定高效地培养出神经干细胞。     

冬虫夏草含药血清诱导神经干细胞定向分化的影响

目的探讨冬虫夏草中含药血清诱导神经干细胞（NSCs）定向分化的作用。方法取新生24 h内的Wistar大鼠大脑海马区分离培养神经干细胞三代后,加入低、中、高剂量冬虫夏草含药血清与对照血清进行培养,观察其对神经干细胞影响,通过MTT检测神经细胞生长曲线和免疫组化法检测神经干细胞向神经元分化的情况。结果新生大鼠海马分离培养的神经克隆球,经免疫细胞化学染色检测为Nestin阳性细胞。神经干细胞贴壁分化的细胞呈NSE、GFAP阳性。冬虫夏草低、中剂量组诱导神经干细胞分化为神经元的阳性细胞明显高于对照组,且呈量效依赖关系,高剂量组与对照组没有明显差别。结论冬虫夏草含药血清可体外诱导神经干细胞向神经元方向分化,在一定范围内存在量效依赖关系。     

神经干细胞与癫痫治疗研究进展

癫痫是一种常见的神经系统疾病，其发病机制极为复杂。近年来，国内外在神经干细胞移植治疗癫痫方面作了大量的试验研究。神经干细胞移植入癫痫脑后可引起形态学、电生理、临床疗效的改变，并影响所涉及的神经递质和信号转导机制，为神经干细胞移植治疗癫痫的可行性提供了依据。     

体外模拟海马神经再生微环境下的NSCs增殖和向神经元分化

目的:探讨用切割穹窿海马伞海马提取液在体外模拟体内海马神经再生微环境下,对海马神经干细胞(neural stem cells,NSCs)增殖和向神经元分化的影响。方法:分别制备正常侧和切割穹窿海马伞侧海马提取液。实验分为对照组、正常组和切割组,分别在海马NSCs中加入DMEM/F12培养基、含正常侧海马提取液及切割侧海马提取液的DMEM/F12培养基。用WST-8和Ki67/Sox2免疫荧光检测NSCs的增殖,用DCX免疫荧光检测NSCs向神经元的分化情况。结果:切割组与正常组及对照组相比,WST-8检测OD450比值明显增高(P<0.05);Ki67阳性细胞和Sox2阳性细胞的比例均明显增高(P<0.001)。结论:用切割穹窿海马伞侧海马提取液在体外模拟海马神经再生微环境,可以促进海马NSCs的增殖和向神经元的分化。     

神经干细胞的研究进展及应用前景

传统观点认为哺乳动物中枢神经系统的再生仅限于胚胎时期和出生后早期，这意味着成年动物脑和脊髓内的神经细胞只能逐渐减少而不能被更新或替代。然而，中枢神经系统再生现象及具有增殖能力的神经干细胞（Naural stem cell,NSC)的发现向这一理论提出了挑战。神经干细胞具有较强的增殖能力，并能分化为神经元，星形胶质细胞和少突胶质细胞，因此可用来修复损伤的神经系统。近几年来，移植神经干细胞治疗帕金森病、亨廷顿病、脊髓损伤、缺血性中风、老年性痴呆等神经系统疾病成为医学界的研究热点之一，并取得了一定进展。     

离体培养海马神经干细胞中自噬现象的观察

目的:观察离体培养海马神经干细胞中自噬现象。方法:分离新生1 d大鼠海马组织,培养、扩增和传代,鉴定后取培养7 d的细胞,用RT-PCR法检测自噬特异性蛋白LC3和Bclin1的mRNA表达,Western Blot检测LC3和Bclin1的蛋白表达,透射电子显微镜观察神经干细胞中的自噬体的超微结构。结果:分离培养的神经干细胞呈Nestin免疫荧光阳性,且能分化为β-Ⅲtubulin~+的神经细胞和GFAP~+的胶质细胞;RT-PCR和Western Blot分别检测出神经干细胞有LC3、Bclin1的mRNA和蛋白表达;电镜下观察到神经干细胞胞质内有自噬体和自噬溶酶体。结论:正常离体培养的大鼠海马神经干细胞存在自噬现象,提示自噬可能对神经干细胞正常生理功能的维持有重要作用。     

Immunolocalization of NR1, NR2A, and PSD-95 in rat hippocampal subregions during postnatal development

Although the expression of NMDARs and synaptic-associated proteins has been widely studied, the temporospatial distribution of NMDAR subunits and synaptic proteins in different hippocampal subregions during postnatal development still lacks detailed information, and the relationship between NR1 or NR2 subunits and PSD-95 family proteins is controversial. In this study, we used immunofluorescent staining to assess NR1 or NR2A and PSD-95 expressions and the relationship between them in CA1, CA3, and DG of rat hippocampus on postnatal (P) days: P0, P4, P7, P10, P14, P21, P28, P56. The results showed that from P0 to P56, NR1, NR2A, and PSD-95 expressions increased gradually, and the time points of their expression peak differed in CA1, CA3, and DG during postnatal development. Interestingly, although the expression of PSD-95 was positively correlated to both NR1 and NR2A, the NR1 and PSD-95 coexpressed puncta were greatest in CA3, while NR2A and PSD-95 coexpressed puncta were greatest in CA1, compared to other subregions. Surprisingly, at P21, among different strata of CA1, the area of highest expression of NR2A was dramatically changed from stratum pyramidale to stratum polymorphum and stratum moleculare, and returned to stratum pyramidale gradually on the later observed days again, indicating that P21 may be one critical timepoint during postnatal development in CA1. The specific temporospatial distribution pattern of NR1, NR2A, and PSD-95 might be related to the different physiological functions during postnatal development. Discovering the alteration of the relationship between PSD-95 and NMDAR subunits expression may be helpful for understanding mechanisms and therapy of neurodegenerative diseases.     

低氧环境下白细胞介素1β诱导中脑源性神经干细胞的分化

背景：在体外某些外来信号的调控和诱导下,神经干细胞可定向诱导分化成与受体部位细胞类型与构成相似的细胞群体,使其更容易掺入靶组织,并可满足移植所需的细胞数量,提高移植细胞的存活率。 目的：验证白细胞介素1β在低氧环境下体外诱导中脑源性神经干细胞的分化。 方法：分离孕12 d胎鼠中脑组织,培养神经干细胞、传代并鉴定。将鉴定后传代培养的中脑源性神经干细胞按分组接种于含体积分数10%胎牛血清的DMEM/F12培养基和含体积分数10%胎牛血清的DMEM/ F12+白细胞介素1β培养基;分别置于常氧(体积分数21%O₂)和低氧(体积分数3%O₂)环境下诱导分化,诱导分化9-11 d后行小鼠抗大鼠酪氨酸羟化酶免疫细胞化学染色,检测酪氨酸羟化酶及神经元特异性烯醇化酶阳性细胞率。 结果与结论：与常氧组比较,低氧组尤其是低氧+白细胞介素1β组中酪氨酸羟化酶阳性神经元的突起数目更多,且长度更为延长。孕12 d胚鼠腹侧中脑组织可以在体外培养传代、并能诱导分化成多巴胺能神经元;在低氧环境或低氧+白细胞介素1β诱导下,分化率均高于常氧组,其表型更成熟。说明在低氧或低氧和白细胞介素1β诱导下,可明显促进中脑源性干细胞分化为形态及功能成熟的多巴胺能神经元。     

基质细胞衍生因子1对内源性神经干细胞的趋化迁移作用

背景：目前研究表明,基质细胞衍生因子1在参与趋化迁移内源性神经干细胞中起着非常重要的作用,但其具体迁移机制尚不明确。目的：观察外源性基质细胞衍生因子1 对大鼠内源性神经干细胞的趋化迁移作用及海马区神经干细胞的激活增殖情况。方法：通过向SD大鼠海马区上大脑皮质内注射外源性基质细胞衍生因子1(注射量为5 μL,质量浓度为500 μg/L)建立动物模型,于3,7,14,21 d后灌注取脑,通过石蜡切片免疫组织化学检测大鼠皮质内注射区及海马区nestin阳性细胞表达情况,并设实验对照组与空白对照组。结果与结论：石蜡切片免疫组织化学显示：实验组注射区周围及海马区nestin表达阳性细胞的数量随时间推移逐渐增多,3,7 d时注射区及海马区nestin表达阳性细胞少量表达,14 d时注射区及海马区nestin表达阳性细胞进一步增多,并向注射区形成明显的迁移趋势,21 d时注射区及海马区nestin表达阳性细胞更多。实验对照组及空白实验组未见上述表现。结果表明外源性基质细胞衍生因子1 可能诱导海马区神经干细胞的增殖分化,参与内源性神经干细胞的趋化迁移过程。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程全文链接：