人类膀胱移行上皮细胞的体外培养与鉴定

背景:移行上皮细胞的分离方法有酶消化法、组织块法及刮削法3种。目的:探讨培养人类膀胱移行上皮细胞和其传代的最佳方法。方法:培养人类膀胱移行上皮细胞,观察细胞在MEM-F12和KSFM培养基中的生长增殖以及形态变化。免疫荧光染色观察上皮细胞特异性蛋白标记AE1及仅在尿路上皮组织中特异表达的尿空斑蛋白Uroplakin III,以鉴定膀胱移行上皮细胞。分别利用4步胰蛋白酶消化法和组织块再植法对细胞进行传代培养。结果与结论:①细胞在MEM-F12培养基中较KSFM培养基中爬出及融合均快,生长状态良好。②细胞免疫荧光鉴定证实为移行上皮细胞。③胰蛋白酶消化传代细胞,传代第18~24h贴壁,贴壁后无法继续生长,60~72h后细胞开始凋亡;组织块再种传代细胞生长稳定迅速,24~48h细胞开始爬出,第10~16天达到80%融合,传至第4代后开始出现衰退。说明以DMEM-F12培养基进行组织块培养法和组织块再种法是人类膀胱移行上皮细胞原代培养和传代培养经济有效的方法。     

体外构建尿路上皮细胞-胶原膜的组织工程复合物

目的:将培养扩增的猪膀胱移行上皮细胞接种到聚乙烯醇改良的牛Ⅰ型胶原膜上,观察体外构建用于新膀胱黏膜移行上皮化改造的组织工程复合物的可行性。方法:实验于2005-03/05在广东省人民医院医学研究中心完成。①猪膀胱移行上皮细胞的原代及传代培养。②测定膀胱移行上皮细胞在胶原膜浸提液中增殖率:取第2,3代细胞用角化细胞无血清培养基将细胞制成悬液,分为对照组(正常角化细胞无血清培养基)和实验组(浸提液)进行培养,分别于第1,3,7天,采用四甲基偶氮唑盐法观察细胞增值率(实验组A490值/对照组A490值×100%),并参照美国药典中细胞相对增殖率与细胞毒性分级的关系对材料进行毒性评级。③通过组织学观察和扫描电镜观察,了解细胞在胶原膜支架上的黏附和生长情况。结果:①猪膀胱移行上皮细胞可在体外培养至第9代。②第1,3,7天实验组细胞相对增殖率分别为:94.59%,100.95%和82.42%,与对照组(100%)比较差异无显著性(P>0.05)。胶原膜细胞毒性为Ⅰ级(无细胞毒性)。③细胞在胶原膜上黏附、生长和增殖良好。结论:该方法可成功培养扩增猪膀胱移行上皮细胞,胶原膜与膀胱移行上皮细胞生物相容性良好。该细胞可与胶原膜复合构建成可移植的组织工程膀胱黏膜替代物,有望用于新膀胱的移行上皮改造。     

体外构建尿路上皮细胞-胶原膜的组织工程复合物

目的：将培养扩增的猪膀胱移行上皮细胞接种到聚乙烯醇改良的牛Ⅰ型胶原膜上，观察体外构建用于新膀胱黏膜移行上皮化改造的组织工程复合物的可行性。 方法：实验于2005-03／05在广东省人民医院医学研究中心完成。①猪膀胱移行上皮细胞的原代及传代培养。②测定膀胱移行上皮细胞在胶原膜浸提液中增殖率：取第2，3代细胞用角化细胞无血清培养基将细胞制成悬液，分为对照组（正常角化细胞无血清培养基）和实验组（浸提液）进行培养，分别于第1，3，7天，采用四甲基偶氮唑盐法观察细胞增值率（实验组A490值／对照组A490值&;#215;100％），并参照美国药典中细胞相对增殖率与细胞毒性分级的关系对材料进行毒性评级。③通过组织学观察和扫描电镜观察，了解细胞在胶原膜支架上的黏附和生长情况。 结果：①猪膀胱移行上皮细胞可在体外培养至第9代。②第1，3，7天实验组细胞相对增殖率分别为：94．59％，100．95％和82．42％，与对照组（100％）比较差异无显著性（P〉0．05）。胶原膜细胞毒性为Ⅰ级（无细胞毒性）。③细胞在胶原膜上黏附、生长和增殖良好。 结论：该方法可成功培养扩增猪膀胱移行上皮细胞，胶原膜与膀胱移行上皮细胞生物相容性良好。该细胞可与胶原膜复合构建成可移植的组织工程膀胱黏膜替代物，有望用于新膀胱的移行上皮改造。     

兔尿道上皮细胞的体外连续培养

背景:尿道损伤后的瘢痕挛缩或缺损可导致狭窄,寻找理想的修复替代材料已成为研究热点.目的:探索尿道黏膜上皮细胞体外培养的技术和方法,为进一步采用组织工程技术构建尿道黏膜组织奠定基础.设计、时间及地点:单一样本观察,于2005-04/2007-02在解放军总医院泌尿外科完成.材料:健康成年雄性新西兰雄兔6只,体质量3.0～3.5kg;实验用Dispase Ⅱ为美国Gibco公司产品.方法:取雄性新西兰兔尿道黏膜组织,分离上皮采用Dispase Ⅱ工作液,上皮细胞间的分离采用混合消化酶(1.25g/L胰蛋白酶与0.2g/L乙二胺四乙酸等体积混合)消化,以差速贴壁法排除成纤维细胞.使用DMEM与F123:1混合培养液加体积分数为0.1的胎牛血清,对上皮细胞进行原代单纯培养和传代培养;取第2～6代细胞进行上皮细胞的免疫组织化学染色,以正常尿道黏膜组织石蜡切片为阳性对照组,以成纤维细胞铺片为阴性对照组.主要观察指标:①利用倒置相差显微镜动态观察细胞形态、生长、增殖情况.②采用活细胞荧光染色法观察细胞存活状态.③以扫描电镜观察细胞超微结构.④采用免疫组织化学染色行细胞鉴定.结果:①原代培养3-5d细胞逐渐生长融合成片,如铺路石状,细胞大小均一.生长期内均为单一的上皮细胞,无成纤维细胞混杂生长,细胞可传9-10代.②第4～6代细胞在免疫荧光染色和超微结构观察中显示良好形态.③免疫组织化学证实角蛋白染色阳性.结论:应用组织工程技术,成功培养尿道上皮种子细胞.结果表明,细胞生长状态良好,增殖较快.经特异性免疫组织化学及形态学鉴定为纯化的尿道上皮细胞.     

大鼠胰腺间质细胞体外培养过程及其形态学特征

目的:对胰腺间质细胞进行原代及传代培养,观察其形态学的变化。以探索一种简单稳定的获取及培养胰腺间质细胞的方法。方法:用机械剪切加胰蛋白酶消化的方法制备SD大鼠胰腺单细胞悬液,取新生SD大鼠1只麻醉断髓处死,体积分数0.75的乙醇浸泡消毒,无菌条件下取出胰腺组织,去除红细胞,剪切,加入胰蛋白酶消化,消化终止后细胞筛过滤,收集滤过的细胞悬液离心,弃上清液,重复1次。收集获得的单个胰腺间质细胞。接种于含体积分数0.1的胎牛血清、0.05g/L的亚胺培南的DMEM/F-12(1∶1)培养基,培养48h后换液,弃上清及悬浮细胞,继续培养48h后,换用含1×10-5mol/L阿糖胞苷的完全培养基培养24h,再换正常培养基继续培养,在培养细胞达到80%～90%的细胞汇合时,按1∶3进行传代培养。测定细胞生长曲线及贴壁率,原代细胞及传代细胞用双硫腙染色,鉴定有无胰腺β细胞。结果:①原代细胞及传代细胞形态学观察:原代培养换液前,显微镜下可见细胞大小不等,悬浮,有较多细胞碎片。48h首次全量换液后,悬浮细胞减少,经3次换液可基本去除。加用阿糖胞苷培养24h,大量细胞相继死亡。至第10-14天,培养细胞明显增加,基本铺满瓶底,以星形、梭形为主,细胞呈放射状或漩涡状生长,部分区域呈灶状。传至第5代细胞出现老化。②细胞生长曲线:细胞从传代后第2天,数量即开始增加,第4天增加幅度最大,至第6天细胞数量最大,以后数量略有下降。传代培养对数增殖期为2-4d,对数增殖期结束后,第6天细胞生长缓慢,进入平台期。③细胞的贴壁率:传代细胞培养2h已有部分细胞贴壁;培养4h贴壁细胞接近50%;培养10h贴壁达79%;培养12h细胞全部贴壁,而且部分细胞开始分裂增殖,细胞形态与原代细胞基本相似。④胰腺β细胞的化学鉴定:对胰腺组织分离所得单个细胞、原代培养细胞及传代培养细胞分别用双硫腙染色。培养前细胞染色,可见少量腥红色细胞,随着培养时间延长腥红色细胞逐渐减少,在原代培养10～14d,腥红色细胞消失,传代培养细胞染色未见腥红色细胞。结论:细胞培养12h全部贴壁,传代培养对数增殖期为2-4d,第6天细胞进入平台期。原代培养胰腺间质细胞形态多样,主要呈梭形,少数呈三角形或星形,贴壁爬行生长,第1周增殖较慢,随后增殖加速,细胞团块多见,偶可见大的圆形细胞生长,核大,胞浆内颗粒多。传代培养,细胞能迅速贴壁生长,细胞形态逐渐均一,主要为梭形、三角形细胞,呈集落样生长,双硫腙染色阴性;但细胞培养至第5代,胞浆颗粒增多,细胞增殖减慢,大部分细胞逐渐老化死亡。     

猪膀胱移行上皮细胞培养及其在纤维蛋白凝胶表面生长的评价

目的：探讨猪正常尿路上皮细胞分离、培养、扩增技术；观察利用纤维蛋白胶作为组织工程支架的可行性。 方法：实验于2005-04／07在广东省人民医院医学研究中心完成。①采用酶消化法及无血清培养系统体外原代培养膀胱移行上皮细胞。②将体外扩增的膀胱上皮细胞以相同密度分别接种于普通培养板（对照组）和纤维蛋白凝胶包被的培养板（实验组），于接种后4d比较两组细胞克隆形成情况。③再将膀胱移行上皮细胞接种于纤维蛋白凝胶包被的培养板，在不同融合度（70％，100％）时将细胞消化传代，以相同的密度再次接种于纤维蛋白包被的培养板，比较生长于纤维蛋白凝胶表面的、不同融合度的细胞传代后的克隆形成情况。④取对数生长期膀胱移行上皮细胞，以相同密度接种于96孔板，以含不同浓度抑肽酶（0，37．5，75，150，300klU／mL）的keratinocyte-SFM培养，4d后以四甲基偶氮唑盐法观察比较移行上皮细胞生长情况（不含抑肽酶者为对照组）。 结果：①移行上皮细胞生长良好，多次传代后仍扩增迅速。②膀胱移行上皮细胞在培养板和纤维蛋白凝胶表面均生长良好。4d后细胞克隆形成率在纤维蛋白凝胶表面和培普通培养板无明显差异[（8．67&;#177;1．45）％，（9．33&;#177;1．76）％，P〉0．05]。③生长于纤维蛋白凝胶表面的细胞传代后仍有较强的增殖能力，且70％融合组传代细胞克隆形成率显著高于100％组[（18．2&;#177;1．08）％，（12．8&;#177;1．35）％，P〈0．05]。④抑肽酶在300klU／mL时对细胞生长有显著抑制作用；而在其他浓度时则不明显。 结论：①该法培养猪膀胱上皮细胞迅速可靠，多次传代后仍有较强的增殖能力。②细胞在纤维蛋白凝胶表面生长良好，传代后仍然有较强的增殖能力。③纤维蛋白凝胶具有作为泌尿系腔道组织工程支架的潜在运用价值。     

猪膀胱移行上皮细胞培养及其在纤维蛋白凝胶表面生长的评价

目的:探讨猪正常尿路上皮细胞分离、培养、扩增技术;观察利用纤维蛋白胶作为组织工程支架的可行性。方法:实验于2005-04/07在广东省人民医院医学研究中心完成。①采用酶消化法及无血清培养系统体外原代培养膀胱移行上皮细胞。②将体外扩增的膀胱上皮细胞以相同密度分别接种于普通培养板(对照组)和纤维蛋白凝胶包被的培养板(实验组),于接种后4d比较两组细胞克隆形成情况。③再将膀胱移行上皮细胞接种于纤维蛋白凝胶包被的培养板,在不同融合度(70%,100%)时将细胞消化传代,以相同的密度再次接种于纤维蛋白包被的培养板,比较生长于纤维蛋白凝胶表面的、不同融合度的细胞传代后的克隆形成情况。④取对数生长期膀胱移行上皮细胞,以相同密度接种于96孔板,以含不同浓度抑肽酶(0,37.5,75,150,300kIU/mL)的keratinocyte-SFM培养,4d后以四甲基偶氮唑盐法观察比较移行上皮细胞生长情况(不含抑肽酶者为对照组)。结果:①移行上皮细胞生长良好,多次传代后仍扩增迅速。②膀胱移行上皮细胞在培养板和纤维蛋白凝胶表面均生长良好,4d后细胞克隆形成率在纤维蛋白凝胶表面和培普通培养板无明显差异[(8.67±1.45)%,(9.33±1.76)%,P>0.05]。③生长于纤维蛋白凝胶表面的细胞传代后仍有较强的增殖能力,且70%融合组传代细胞克隆形成率显著高于100%组[(18.2±1.08)%,(12.8±1.35)%,P<0.05]。④抑肽酶在300kIU/mL时对细胞生长有显著抑制作用;而在其他浓度时则不明显。结论:①该法培养猪膀胱上皮细胞迅速可靠,多次传代后仍有较强的增殖能力。②细胞在纤维蛋白凝胶表面生长良好,传代后仍然有较强的增殖能力。③纤维蛋白凝胶具有作为泌尿系腔道组织工程支架的潜在运用价值。     

膀胱脱细胞基质片的制备及其与尿路上皮细胞的联合培养

目的:将培养扩增的猪膀胱移行上皮细胞接种到自制的膀胱脱细胞基质(BAM)片上,探讨此法体外构建用于新膀胱黏膜移行上皮化改造的组织工程复合物的可行性.方法:取新鲜猪膀胱制备BAM片,将原代猪膀胱移行上皮细胞进行体外培养、扩增后接种到BAM片上,培养成多层细胞结构的组织工程复合物.通过组织学观察,了解所制备的BAM结构及细胞在BAM片支架上的黏附及生长情况.结果:此法制备的BAM片具有较完整的胶原结构.细胞在BAM片上黏附、生长和增殖良好,可形成多层细胞的组织工程复合物.结论:该方法可成功培养猪膀胱移行上皮细胞.制备的BAM片生物相容性良好.膀胱移行上皮细胞与BAM片联合培养构建成具有多层细胞的组织工程膀胱黏膜替代物,有望用于新膀胱的移行上皮重建.     

大鼠胰腺间质细胞体外培养过程及其形态学特征

目的：对胰腺间质细胞进行原代及传代培养，观察其形态学的变化。以探索一种简单稳定的获取及培养胰腺间质细胞的方法。方法：用机械剪切加胰蛋白酶消化的方法制备SD大鼠胰腺单细胞悬液，取新生SD大鼠1只麻醉断髓处死，体积分数0．75的乙醇浸泡消毒，无菌条件下取出胰腺组织，去除红细胞，剪切，加入胰蛋白酶消化，消化终止后细胞筛过滤，收集滤过的细胞悬液离心，弃上清液，重复1次。收集获得的单个胰腺间质细胞。接种丁含体积分数0．1的胎牛血清、0．05g/L的砸胺培南的DMEM／F—12（1：1）培养基，培养48h后换液，弃上清及悬浮细胞，继续培养48h后，换用含1&;#215;10^-5mol／L阿糖胞苷的完全培养基培养24h，再换正常培养基继续培养，在培养细胞达到80％～90％的细胞汇合时，按1：3进行传代培养。测定细胞生长曲线及贴壁率，原代细胞及传代细胞用双硫腙染色，鉴定有无胰腺β细胞。结果：①原代细胞及传代细胞形态学观察：原代培养换液前，显微镜下可见细胞大小不等，悬浮，有较多细胞碎片。48h首次全量换液后，悬浮细胞减少，经3次换液可基本去除。加用阿糖胞苷培养24h，大量细胞相继死亡。至第10—14天，培养细胞明显增加，基本铺满瓶底，以星形、梭形为主，细胞呈放射状或漩涡状生长，部分区域呈灶状。传至第5代细胞出现老化。②细胞生长曲线：细胞从传代后第2天，数量即开始增加，第4天增加幅度最大，至第6天细胞数茸最大，以后数量略有下降。传代培养对数增殖期为2—4d，对数增殖期结束后，第6天细胞生长缓慢，进入平台期。③细胞的贴壁率：传代细胞培养2h已有部分细胞贴壁；培养4h贴壁细胞接近50％；培养10h贴壁达79％；培养12h细胞全部贴壁，而且部分细胞开始分裂增殖，细胞形态与原代细胞基本相似。④胰腺β细胞的化学鉴定：对胰腺组织分离所得单个细胞、原代培养细胞及传代培养细胞分别用双硫腙染色，培养前细胞染色，可见少量腥红色细胞，随着培养时间延长腥红色细胞逐渐减少，在原代培养10～14d，腥红色细胞消失，传代培养细胞染色未见腥红色细胞。结论：细胞培养12h全部贴壁，传代培养对数增殖期为2—4d，第6天细胞进入平台期。原代培养胰腺间质细胞形态多样，主要呈梭形，少数呈三角形或星形，贴壁爬行生长，第1周增殖较慢，随后增殖加速，细胞团块多见，偶可见大的圆形细胞生长，核大，胞浆内颗粒多。传代培养，细胞能迅速贴壁生长，细胞形态逐渐均一，主要为梭形、三角形细胞，呈集落样生长，双硫腙染色阴性；但细胞培养至第5代，胞浆颗粒增多，细胞增殖减慢，大部分细胞逐渐老化死亡。     

犬阴道上皮细胞和平滑肌细胞可在体外长期稳定培养

背景：体外分离培养获得足够活性良好的种子细胞是构建阴道组织工程的关键。文献报道阴道上皮细胞体外纯化培养和传代较为困难，尤其是体外长期培养犬等大动物的阴道种子细胞尚未见报道。目的：建立体外稳定培养犬阴道上皮细胞和平滑肌细胞方法。方法：获取犬小块阴道组织，机械分离阴道黏膜上皮，Dispase 酶和胰蛋白酶分步消化收集上皮细胞，接种于无血清角化细胞培养液中培养和传代；机械分离阴道平滑肌组织后采用Ⅱ型胶原酶消化获得平滑肌细胞，在含体积分数10%胎牛血清的 DMEM 培养液中连续培养传代。动态观察上皮细胞和平滑肌细胞生长增殖情况，分别采用特异性抗体行细胞免疫化学染色鉴定。结果与结论：原代培养的上皮细胞24-36 h后开始贴壁铺展，四五天后呈对数生长，七八天可达70%融合，为单一的上皮细胞，呈典型铺路石样，未见成纤维细胞混杂。每四五天可传代1次，连续传代六七次，细胞免疫化学染色角蛋白AEl/AE3抗体阳性。平滑肌细胞原代培养24 h后贴壁呈梭形，此后呈对数生长，4 d后融合呈典型的“峰和谷”样，每三四天可传代1次，连续传代七八次，细胞免疫化学染色示α-肌动蛋白染色阳性。结果证实，犬阴道上皮细胞和平滑肌细胞可在体外长期稳定培养，可为体外构建组织工程化阴道提供足够的种子细胞。