人类膀胱移行上皮细胞的体外培养与鉴定

背景:移行上皮细胞的分离方法有酶消化法、组织块法及刮削法3种。目的:探讨培养人类膀胱移行上皮细胞和其传代的最佳方法。方法:培养人类膀胱移行上皮细胞,观察细胞在MEM-F12和KSFM培养基中的生长增殖以及形态变化。免疫荧光染色观察上皮细胞特异性蛋白标记AE1及仅在尿路上皮组织中特异表达的尿空斑蛋白Uroplakin III,以鉴定膀胱移行上皮细胞。分别利用4步胰蛋白酶消化法和组织块再植法对细胞进行传代培养。结果与结论:①细胞在MEM-F12培养基中较KSFM培养基中爬出及融合均快,生长状态良好。②细胞免疫荧光鉴定证实为移行上皮细胞。③胰蛋白酶消化传代细胞,传代第18~24h贴壁,贴壁后无法继续生长,60~72h后细胞开始凋亡;组织块再种传代细胞生长稳定迅速,24~48h细胞开始爬出,第10~16天达到80%融合,传至第4代后开始出现衰退。说明以DMEM-F12培养基进行组织块培养法和组织块再种法是人类膀胱移行上皮细胞原代培养和传代培养经济有效的方法。     

膀胱移行上皮细胞癌的声像图表现

膀胱移行上皮细胞癌的声像图表现青海省人民医院（８１０００７）刘英，李国兰，陈文奎本文分析了经腹部超声显像和膀胱镜检查诊断的１８例膀胱肿瘤。１２例经手术和病理证实的膀胱移行上皮细胞癌１～ＩＩＩ级。并且有ＣＴ及膀胱造影检查对照资料。６例因年龄大及体弱多种...     

膀胱上皮细胞的体外原代培养方法

背景:国内外获得原代人正常膀胱上皮细胞的方法包括酶消化培养法、刮削培养法、组织块培养法,这些方法各有优缺点,培养基中成分多不易把握,效率不高。目的:分析人膀胱上皮细胞原代培养的最佳方法。方法:在同一实验条件下,采用酶消化培养法、刮削培养法、组织块培养法3种不同的原代细胞培养方法培养人正常膀胱黏膜膀胱上皮细胞。结果与结论:酶消化培养法、刮削培养法、组织块培养法各组膀胱上皮细胞培养成功率分别为13.3%,26.7%,86.7%,3组间比较差异有非常显著性意义(P<0.001)。3组培养的人膀胱上皮细胞角蛋白AE1/AE3荧光染色均呈阳性。说明组织块培养法是一种简单,短期内可扩增出较多纯净的膀胱上皮细胞的原代培养方法。     

猪膀胱移行上皮细胞培养及其在纤维蛋白凝胶表面生长的评价

目的：探讨猪正常尿路上皮细胞分离、培养、扩增技术；观察利用纤维蛋白胶作为组织工程支架的可行性。 方法：实验于2005-04／07在广东省人民医院医学研究中心完成。①采用酶消化法及无血清培养系统体外原代培养膀胱移行上皮细胞。②将体外扩增的膀胱上皮细胞以相同密度分别接种于普通培养板（对照组）和纤维蛋白凝胶包被的培养板（实验组），于接种后4d比较两组细胞克隆形成情况。③再将膀胱移行上皮细胞接种于纤维蛋白凝胶包被的培养板，在不同融合度（70％，100％）时将细胞消化传代，以相同的密度再次接种于纤维蛋白包被的培养板，比较生长于纤维蛋白凝胶表面的、不同融合度的细胞传代后的克隆形成情况。④取对数生长期膀胱移行上皮细胞，以相同密度接种于96孔板，以含不同浓度抑肽酶（0，37．5，75，150，300klU／mL）的keratinocyte-SFM培养，4d后以四甲基偶氮唑盐法观察比较移行上皮细胞生长情况（不含抑肽酶者为对照组）。 结果：①移行上皮细胞生长良好，多次传代后仍扩增迅速。②膀胱移行上皮细胞在培养板和纤维蛋白凝胶表面均生长良好。4d后细胞克隆形成率在纤维蛋白凝胶表面和培普通培养板无明显差异[（8．67&;#177;1．45）％，（9．33&;#177;1．76）％，P〉0．05]。③生长于纤维蛋白凝胶表面的细胞传代后仍有较强的增殖能力，且70％融合组传代细胞克隆形成率显著高于100％组[（18．2&;#177;1．08）％，（12．8&;#177;1．35）％，P〈0．05]。④抑肽酶在300klU／mL时对细胞生长有显著抑制作用；而在其他浓度时则不明显。 结论：①该法培养猪膀胱上皮细胞迅速可靠，多次传代后仍有较强的增殖能力。②细胞在纤维蛋白凝胶表面生长良好，传代后仍然有较强的增殖能力。③纤维蛋白凝胶具有作为泌尿系腔道组织工程支架的潜在运用价值。     

猪膀胱移行上皮细胞培养及其在纤维蛋白凝胶表面生长的评价

目的:探讨猪正常尿路上皮细胞分离、培养、扩增技术;观察利用纤维蛋白胶作为组织工程支架的可行性。方法:实验于2005-04/07在广东省人民医院医学研究中心完成。①采用酶消化法及无血清培养系统体外原代培养膀胱移行上皮细胞。②将体外扩增的膀胱上皮细胞以相同密度分别接种于普通培养板(对照组)和纤维蛋白凝胶包被的培养板(实验组),于接种后4d比较两组细胞克隆形成情况。③再将膀胱移行上皮细胞接种于纤维蛋白凝胶包被的培养板,在不同融合度(70%,100%)时将细胞消化传代,以相同的密度再次接种于纤维蛋白包被的培养板,比较生长于纤维蛋白凝胶表面的、不同融合度的细胞传代后的克隆形成情况。④取对数生长期膀胱移行上皮细胞,以相同密度接种于96孔板,以含不同浓度抑肽酶(0,37.5,75,150,300kIU/mL)的keratinocyte-SFM培养,4d后以四甲基偶氮唑盐法观察比较移行上皮细胞生长情况(不含抑肽酶者为对照组)。结果:①移行上皮细胞生长良好,多次传代后仍扩增迅速。②膀胱移行上皮细胞在培养板和纤维蛋白凝胶表面均生长良好,4d后细胞克隆形成率在纤维蛋白凝胶表面和培普通培养板无明显差异[(8.67±1.45)%,(9.33±1.76)%,P>0.05]。③生长于纤维蛋白凝胶表面的细胞传代后仍有较强的增殖能力,且70%融合组传代细胞克隆形成率显著高于100%组[(18.2±1.08)%,(12.8±1.35)%,P<0.05]。④抑肽酶在300kIU/mL时对细胞生长有显著抑制作用;而在其他浓度时则不明显。结论:①该法培养猪膀胱上皮细胞迅速可靠,多次传代后仍有较强的增殖能力。②细胞在纤维蛋白凝胶表面生长良好,传代后仍然有较强的增殖能力。③纤维蛋白凝胶具有作为泌尿系腔道组织工程支架的潜在运用价值。     

兔气管纤毛上皮细胞原代培养的生物学特性及其体外生长规律

目的:建立兔气管纤毛上皮细胞原代培养模型,观察其体外培养条件下的生物学特性并确定其体外生长规律。方法:实验于2005-03/07在解放军第四军医大学唐都中心实验室完成。①纤毛上皮细胞提取及培养:日本大耳兔20只,利用酶消化法分离获取兔气管纤毛上皮细胞,无血清生长因子培养基(成分:DMEM:Ham’sF12为1∶1,并加入以下激素及生长因子:10mg/L胰岛素、5mg/L转铁蛋白、20μg/L甲状腺素、0.4mg/L氢化可的松、7.5mg/L内皮细胞生长支持物、25μg/L表皮生长因子、1mmol/L-谷氨酰胺,100IU/mL青霉素,50mg/L链霉素)体外培养。②细胞纯度及鉴定:用抗角蛋白单克隆抗体进行SP法免疫细胞化学反应,二氨基联苯胺显色阳性为上皮细胞。扫描电镜观察细胞表面结构。结果:①气管上皮细胞的分离:低温消化加刷洗法获得的气管上皮细酶胞数量较多,呈圆形,较大,悬浮旋转。②气管上皮细胞生长状态和形态特征:皿接种细胞24h后,贴壁率约为60%,细胞增大,并进入分裂套相。五六天后细胞增殖旺盛,部分无纤毛上皮细胞汇合呈多角形铺路石样相嵌生长,在相差显微镜下放大200～400倍清晰可见纤毛呈海葵样向心摆动活跃,第3周纤毛逐渐消失成遗迹,细胞凋亡。③纤毛细胞的电镜观察:见纤毛由细胞顶膜伸出,大部分集结成束,除纤毛外,还可有稠密的较细短的微绒毛由细胞顶膜伸出。④气道上皮细胞的免疫细胞化学鉴定:抗角蛋白单克隆抗体免疫组织化学染色阳性,细胞达(91±3)%。结论:酶消化法分离、无血清生长因子培养基培养,以建立兔气管纤毛可上皮细胞的原代培养模型,具有成为气管组织工程种子细胞的应用价值。     

尿纤维连接蛋白在膀胱移行上皮细胞癌患者中的应用

目的探讨尿纤维连接蛋白（Fibronectin，Fn）在膀胱移行上皮细胞癌患者辅助诊断、疗效评估及术后复发监测中的应用价值。方法采用ELISA法检测膀胱移行上皮细胞癌术前患者、其他泌尿生殖系统疾病患者和健康人的尿Fn含量，比较各组人群之间尿Fn含量的差异。对膀胱移行上皮细胞癌患者术后尿Fn含量进行检测，分析术后与术前尿Fn含量之间是否存在差异．并对其中10例术后患者进行随访，测定术后不同时期尿Fn含量。结果43例膀胱移行上皮细胞癌术前患者尿Fn含量明显高于30例健康人（P=0．018）及36例其他泌尿生殖系统疾病患者（P=0．027）：膀胱移行上皮细胞癌患者术后尿Fn含量明显低于术前（P=0．035）；3例随访患者在出现膀胱移行上皮细胞癌复发的同时出现尿Fn含量明显升高。结论尿Fn在膀胱移行上皮细胞癌患者辅助诊断、疗效评估及术后复发监测中有重要价值。     

尿纤维连接蛋白在膀胱移行上皮细胞癌患者中的应用

目的探讨尿纤维连接蛋白（Fibronectin，Fn）在膀胱移行上皮细胞癌患者辅助诊断、疗效评估及术后复发监测中的应用价值。方法采用ELISA法检测膀胱移行上皮细胞癌术前患者、其他泌尿生殖系统疾病患者和健康人的尿Fn含量，比较各组人群之间尿Fn含量的差异。对膀胱移行上皮细胞癌患者术后尿Fn含量进行检测，分析术后与术前尿Fn含量之间是否存在差异．并对其中10例术后患者进行随访，测定术后不同时期尿Fn含量。结果43例膀胱移行上皮细胞癌术前患者尿Fn含量明显高于30例健康人（P=0．018）及36例其他泌尿生殖系统疾病患者（P=0．027）：膀胱移行上皮细胞癌患者术后尿Fn含量明显低于术前（P=0．035）；3例随访患者在出现膀胱移行上皮细胞癌复发的同时出现尿Fn含量明显升高。结论尿Fn在膀胱移行上皮细胞癌患者辅助诊断、疗效评估及术后复发监测中有重要价值。     

系统性红斑狼疮小鼠胸腺上皮细胞的体外培养

目的培养符合实验要求的系统性红斑狼疮小鼠胸腺上皮细胞。方法剪切、胶原酶消化自发性系统性红斑狼疮小鼠(BXSB小鼠)胸腺,进行原代培养,胰蛋白酶消化法传代培养,光镜、免疫细胞化学染色进行细胞鉴定。结果经剪切、胶原酶消化的BXSB胸腺植块,在体外培养2～3天后,可见上皮样细胞从植块长出,8～15天后胸腺上皮细胞在培养瓶底部长满,细胞间通过胞浆突起连接成网孔结构。当原代培养的细胞长满瓶壁的90%左右时可传代,角蛋白染色阳性细胞纯度达95%以上。结论剪切、胶原酶消化法简便易行,可获得符合实验要求的BXSB小鼠胸腺上皮细胞,建立了稳定的系统性红斑狼疮模型鼠胸腺上皮细胞培养体系。     

膀胱前列腺移行上皮细胞癌伴局部腺癌2例

膀胱前列腺尿道部移行上皮细胞伴局部腺癌较为罕见，我院本年度收治2例，现报告如下： 例1：患者，男，65岁，因尿频、排尿困难2年余，加重并血尿2个月余，于2004年2月住院。查体：贫血貌，淋巴结无肿大，心、肺、腹部未见异常，留置尿管见淡红色血尿。     

兔尿道上皮细胞的体外连续培养

背景:尿道损伤后的瘢痕挛缩或缺损可导致狭窄,寻找理想的修复替代材料已成为研究热点.目的:探索尿道黏膜上皮细胞体外培养的技术和方法,为进一步采用组织工程技术构建尿道黏膜组织奠定基础.设计、时间及地点:单一样本观察,于2005-04/2007-02在解放军总医院泌尿外科完成.材料:健康成年雄性新西兰雄兔6只,体质量3.0～3.5kg;实验用Dispase Ⅱ为美国Gibco公司产品.方法:取雄性新西兰兔尿道黏膜组织,分离上皮采用Dispase Ⅱ工作液,上皮细胞间的分离采用混合消化酶(1.25g/L胰蛋白酶与0.2g/L乙二胺四乙酸等体积混合)消化,以差速贴壁法排除成纤维细胞.使用DMEM与F123:1混合培养液加体积分数为0.1的胎牛血清,对上皮细胞进行原代单纯培养和传代培养;取第2～6代细胞进行上皮细胞的免疫组织化学染色,以正常尿道黏膜组织石蜡切片为阳性对照组,以成纤维细胞铺片为阴性对照组.主要观察指标:①利用倒置相差显微镜动态观察细胞形态、生长、增殖情况.②采用活细胞荧光染色法观察细胞存活状态.③以扫描电镜观察细胞超微结构.④采用免疫组织化学染色行细胞鉴定.结果:①原代培养3-5d细胞逐渐生长融合成片,如铺路石状,细胞大小均一.生长期内均为单一的上皮细胞,无成纤维细胞混杂生长,细胞可传9-10代.②第4～6代细胞在免疫荧光染色和超微结构观察中显示良好形态.③免疫组织化学证实角蛋白染色阳性.结论:应用组织工程技术,成功培养尿道上皮种子细胞.结果表明,细胞生长状态良好,增殖较快.经特异性免疫组织化学及形态学鉴定为纯化的尿道上皮细胞.     

人支气管上皮细胞的体外培养

背景:人支气管上皮细胞培养在呼吸系统疾病研究中应用越来越广泛.目的:探索美国典型培养物保藏中心人支气管上皮细胞体外培养方法的可行性.方法:对人支气管上皮细胞培养条件进行反复摸索,最终确定应用含体积分数20%胎牛血清的DMEM/F12培养基进行培养.结果与结论:实验培养的人支气管上皮细胞扁平,呈多边形,长满后呈"铺路石"样分布,经免疫组化检测发现培养的细胞表达上皮细胞标志物细胞角蛋白.在支气管扩张症患者痰液上清刺激下,细胞表达的核因子κB、肿瘤坏死因子α和白细胞介素8明显增强,证实培养的人支气管上皮细胞获得成功.提示不必拘泥于美国典型培养物保藏中心推荐的培养条件,改进的培养方法简便易行,有应用价值.     

兔角膜缘上皮干细胞体外扩增及生物学鉴定

背景：角膜缘干细胞体外培养的关键在于建立稳定的体外培养体系,包括角膜缘干细胞的定位、培养条件、载体选择和鉴别方法等。目的：探索兔角膜缘上皮干细胞体外扩增方法,并对其生物学特性进行鉴定。方法：采用兔角膜缘组织块培养法,以人羊膜为载体,在体外进行兔角膜缘上皮干细胞原代和传代培养。倒置显微镜观察其体外生长特征;苏木精-伊红染色以及扫描电镜观察其形态;AE5和P63单克隆抗体免疫组织化学染色鉴定其蛋白表达。结果与结论：采用组织块培养法可在体外获得角膜缘上皮干细胞,能成功传代培养且保持较高增殖潜能。培养于去上皮羊膜上的干细胞可融合成片,呈＂拉网＂现象。原代角膜缘上皮干细胞AE5单克隆抗体染色阳性率低于5%,P63染色阳性达90%;随传代次数增加AE5染色阳性率增高,P63染色阳性率降低。结果显示兔角膜缘组织块培养法可以在体外成功获得角膜缘上皮干细胞,原代和传代细胞均具有干细胞特性,以羊膜为载体培养可形成角膜移植片。     

兔角膜缘上皮干细胞体外扩增及生物学鉴定

背景:角膜缘干细胞体外培养的关键在于建立稳定的体外培养体系,包括角膜缘干细胞的定位、培养条件、载体选择和鉴别方法等.目的:探索兔角膜缘上皮干细胞体外扩增方法,并对其生物学特性进行鉴定.方法:采用兔角膜缘组织块培养法,以人羊膜为载体,在体外进行兔角膜缘上皮干细胞原代和传代培养.倒置显微镜观察其体外生长特征;苏木精-伊红染色以及扫描电镜观察其形态;AE5和P63单克隆抗体免疫组织化学染色鉴定其蛋白表达.结果与结论:采用组织块培养法可在体外获得角膜缘上皮干细胞,能成功传代培养且保持较高增殖潜能.培养于去上皮羊膜上的干细胞可融合成片,呈"拉网"现象.原代角膜缘上皮干细胞AE5单克隆抗体染色阳性率低于5%,P63染色阳性达90%;随传代次数增加AE5染色阳性率增高,P63染色阳性率降低.结果显示兔角膜缘组织块培养法可以在体外成功获得角膜缘上皮干细胞,原代和传代细胞均具有干细胞特性,以羊膜为载体培养可形成角膜移植片.

Abstract：

BACKGROUND: How to establish a stable in vitro culture system, including location of corneal limbal epithelial stem cells, in vitro sample harvest, in vitro culture, vector selection, as well as identification methods, play a key role in corneal limbal epithelial stem cells culture. OBJECTIVE: To culture the isolated rabbit corneal limbal epithelial stem cells and to identify the biological properties of cultured cells. METHODS: The primary rabbit cornel limbal epithelial stem cells were isolated and cultured with tissue inoculation using human amniotic membrane as vector. The growth features of cells were observed under an inverted microscope. The morphology of cells was observed by hematoxylin-eosin staining and a scanning electron microscope. Furthermore, the monoclonal antibody AE5 and P63 two-step immunohistochemical staining were used to identify limbal epithelial stem cell protein expression. RESULTS AND CONCLUSION: The rabbit corneal limbal epithelial stem cells could be successfully cultured and maintained a relatively high value-added potential in vitro. Rabbit corneal limbal epithelial stem cells cultured on the amniotic membrane pull netted cellular layer. The AE5 monoclonal antibody positive rate of primary cultured cells was about 5% and P63 monoclonal antibody positive up to 90%. AE5-positive rate increased and P63-positive rate decreased with the increase in the number of subculture. The rabbit limbal epithelial stem cells can be successful culture and amplified on human amniotic membrane in vitro by limbal tissue culture method. The cultured cells maintain the characteristics of corneal epithelial cells. The rabbit corneal limbal epithelial stem cells can form grafts on the amniotic membrane.     

兔膀胱脱细胞基质负载大鼠毛囊干细胞的体外培养

背景：组织工程学的兴起为泌尿系组织或器官的修复和重建开辟了新的途径,膀胱脱细胞基质是较好的泌尿系组织工程修复的替代材料。目的：构建毛囊干细胞与异种膀胱脱细胞基质为支架的细胞支架复合物,体外培养观察细胞在支架上的生长状态。方法：制备新西兰兔膀胱脱细胞基质,通过扫描电镜和Masson染色检测材料脱细胞效果,采用二次沉淀法将第3代毛囊干细胞静态接种于膀胱脱细胞基质表面,倒置显微镜下观察细胞生长状态,并绘制细胞生长曲线,组织学检测和扫描电镜观察细胞在材料表面的生长状况。结果与结论：制备的膀胱脱细胞基质为白色半透明膜状,扫描电镜下观察为纤维网状结构,未见细胞残留。Masson染色提示膀胱脱细胞基质为胶原结构,无明显细胞残留。细胞材料体外复合培养48 h后倒置显微镜下观察膀胱脱细胞基质周围毛囊干细胞生长状态良好,1周后扫描电镜下观察毛囊干细胞伸展、黏附于支架表面。结果可见毛囊干细胞与膀胱脱细胞基质体外培养具有良好的生物相容性。     

人膀胱癌干细胞存在于EMA-细胞亚群

背景:肿瘤干细胞假说认为肿瘤克隆性生长由肿瘤组织中一小部分具有干细胞特性的细胞维持.近年来几种实体瘤肿瘤干细胞陆续被分离出来,但至今未发现证实膀胱癌干细胞客观存在及其分离和鉴定有效方法的报道.目的:验证膀胱癌干细胞存在的可能性及EMA作为膀胱癌干细胞表面标志的可能性.设计:观察对比实验.单位:天津泌尿外科研究所,天津医科大学第二医院.材料:实验于2006-03/2007-07在国家"二一一"工程重点实验室天津市泌尿外科研究所肿瘤免疫室完成.9例膀胱组织标本来源于天津医科大学第二医院,符合低恶潜能膀胱乳头状泌尿上皮肿瘤及低分级乳头状泌尿上皮癌的诊断标准.另外40例用于免疫组织化学实验的低恶性膀胱移行上皮细胞癌及10例正常膀胱上皮均来自天津医科大学第二医院泌尿外科.留取标本前均签署知情同意书.方法:①通过DNA芯片技术比较正常泌尿上皮和膀胱癌基因表达的差异,以初步判断膀胱癌干细胞存在的可能性.②应用免疫组织化学方法检测干细胞相关基因Bmi-1和EZH2在低恶性膀胱移行上皮细胞癌组织中的表达情况.③观察27个潜在标志在正常和低恶性膀胱移行上皮细胞癌组织中的阳性定位情况.④通过免疫磁珠细胞分选系统获得EMA-亚群,分析其克隆形成、自我更新和增殖能力.主要观察指标:①正常泌尿上皮和膀胱癌基因表达的差异.②Bmi-1及EZH2蛋白在低度恶性膀胱移行上皮细胞癌与正常膀胱上皮中的表达差异.③克隆形成实验结果.结果:①发现了268个差异表达基因(包括Bmi-1和EZH2),Bmi-1和EZH2过表达于低度恶性膀胱移行上皮细胞癌.②除了EMA,其他26种可能的膀胱癌干细胞表面标志在分离膀胱癌干细胞方面没有应用价值.③EMA-位于正常泌尿上皮和膀胱癌癌组织的基底细胞层(可能的干细胞位置),EMA-亚群具有克隆形成、自我更新和增殖能力.结论:实验肯定了膀胱癌干细胞的存在,EMA- 可能是它的表面标志物.