小肠黏膜下层:一种可降解的天然生物支架材料

将小肠去除浆膜层、肌层及黏膜层,以及一系列加工和消毒处理后,可获得一种不含细胞的细胞外基质小肠黏膜下层,在组织修复方面具有3大方面突出的生物学优势。组织相容性:小肠黏膜下层具有良     

脂肪基质干细胞复合小肠黏膜下层治疗家兔生长板缺损

背景：小肠黏膜下层具有良好的生物相容性,与其主要的胶原成分在进化上的高度保守性及其快速降解性有关。目的：观察经体外成软骨诱导的脂肪基质干细胞-小肠黏膜下层复合物用于治疗家兔胫骨近端内侧生长板缺损的疗效。方法：36只新西兰大耳白兔随机分为3组,均造成右侧胫骨近端内侧生长板50%的缺损。空白组不植入填充物,小肠黏膜下层支架组缺损填充空白小肠黏膜下层支架材料,脂肪基质干细胞-小肠黏膜下层组填充在体外进行成软骨诱导14d的脂肪基质干细胞-小肠黏膜下层复合物。结果与结论：X射线片测量结果：16周时胫骨近端关节面成角差值,空白组〉小肠黏膜下层支架组〉脂肪基质干细胞-小肠黏膜下层组（P均〈0.05）。胫骨长度差值空白组〉小肠黏膜下层支架组〉脂肪基质干细胞-小肠黏膜下层组（P均〈0.05）。苏木精-伊红染色显示：16周时,空白组生长板骨桥未被吸收,生长板外侧闭合,小肠黏膜下层支架组生长板缺损内骨桥致密,生长板软骨中断,生长板外侧闭合;脂肪基质干细胞-小肠黏膜下层组生长板为软骨性修复,软骨呈柱状排列,生长板未闭合。提示,体外成软骨诱导分化后的脂肪基质干细胞-小肠黏膜下层复合物,用于治疗家兔胫骨近端生长板缺损,有效避免了肢体的成角和短缩畸形,并且能够修复生长板软骨。     

脂肪基质干细胞复合小肠黏膜下层治疗家兔生长板缺损

背景:小肠黏膜下层具有良好的生物相容性,与其主要的胶原成分在进化上的高度保守性及其快速降解性有关.目的:观察经体外成软骨诱导的脂肪基质干细胞-小肠黏膜下层复合物用于治疗家兔胫骨近端内侧生长板缺损的疗效.方法:36只新西兰大耳白兔随机分为3组,均造成右侧胫骨近端内侧生长板50%的缺损.空白组不植入填充物,小肠黏膜下层支架组缺损填充空白小肠黏膜下层支架材料,脂肪基质干细胞-小肠黏膜下层组填充在体外进行成软骨诱导14 d的脂肪基质干细胞-小肠黏膜下层复合物.结果与结论:X射线片测量结果:16周时胫骨近端关节面成角差值,空白组>小肠黏膜下层支架组>脂肪基质干细胞-小肠黏膜下层组(P均 < 0.05).胫骨长度差值空白组>小肠黏膜下层支架组>脂肪基质干细胞-小肠黏膜下层组(P均 < 0.05).苏木精-伊红染色显示:16周时,空白组生长板骨桥未被吸收,生长板外侧闭合,小肠黏膜下层支架组生长板缺损内骨桥致密,生长板软骨中断,生长板外侧闭合;脂肪基质干细胞-小肠黏膜下层组生长板为软骨性修复,软骨呈柱状排列,生长板未闭合.提示,体外成软骨诱导分化后的脂肪基质干细胞-小肠黏膜下层复合物,用于治疗家兔胫骨近端生长板缺损,有效避免了肢体的成角和短缩畸形,并且能够修复生长板软骨.     

脂肪基质干细胞小肠黏膜下层双面复合的体外成软骨诱导

背景:使用体外构建的组织工程软骨治疗软骨损伤是目前的研究热点,料与支架材料的选择仍有较多问题尚待解决.目的:观察脂肪基质干细胞-小肠黏膜下层复合物在体外经成软骨诱导培养基诱导分化的效果.方法:将第3代脂肪基质干细胞接种于复水后的小肠黏膜下层双面,入成软骨诱导培养基,体外诱导培养7 d和14 d后,用实时荧光定量RT-PCR检测Ⅱ型胶原mRNA,疫组织化学染色检测Ⅱ型胶原蛋白,苯胺蓝染色观察细胞外基质,描电镜观察体外成软骨诱导14 d后细胞在支架材料上的生长状况.结果与结论:Ⅱ型胶原mRNA实时荧光定量RT-PCR检测提示,外成软骨诱导后7,4 d的脂肪基质干细胞-小肠黏膜下层复合物Ⅱ型胶原mRNA的标化值与未诱导的脂肪基质干细胞-小肠黏膜下层复合物差异有显著性意义(P < 0.05),导 14 d与诱导7 d相比,异亦有显著性意义(P < 0.05).脂肪基质干细胞-小肠黏膜下层复合物成软骨诱导后14 d,型胶原免疫组织化学染色为阳性,苯胺蓝染色可见基质异染,诱导的复合物Ⅱ型胶原免疫组织化学染色为阴性.扫描电镜检测显示诱导14 d时,胞长满支架材料的双面.提示脂肪基质干细胞复合至小肠黏膜下层后,体外经成软骨诱导培养基成软骨诱导后,够向成软骨细胞分化.     

脂肪基质干细胞小肠黏膜下层双面复合的体外成软骨诱导

背景：使用体外构建的组织工程软骨治疗软骨损伤是目前的研究热点,材料与支架材料的选择仍有较多问题尚待解决。目的：观察脂肪基质干细胞-小肠黏膜下层复合物在体外经成软骨诱导培养基诱导分化的效果。方法：将第3代脂肪基质干细胞接种于复水后的小肠黏膜下层双面,加入成软骨诱导培养基,于体外诱导培养7d和14d后,使用实时荧光定量RT-PCR检测Ⅱ型胶原mRNA,免疫组织化学染色检测Ⅱ型胶原蛋白,甲苯胺蓝染色观察细胞外基质,扫描电镜观察体外成软骨诱导14d后细胞在支架材料上的生长状况。结果与结论：Ⅱ型胶原mRNA实时荧光定量RT-PCR检测提示,体外成软骨诱导后7,14d的脂肪基质干细胞-小肠黏膜下层复合物Ⅱ型胶原mRNA的标化值与未诱导的脂肪基质干细胞-小肠黏膜下层复合物差异有显著性意义（P〈0.05）,诱导14d与诱导7d相比,差异亦有显著性意义（P〈0.05）。脂肪基质干细胞-小肠黏膜下层复合物成软骨诱导后14d,Ⅱ型胶原免疫组织化学染色为阳性,甲苯胺蓝染色可见基质异染,未诱导的复合物Ⅱ型胶原免疫组织化学染色为阴性。扫描电镜检测显示诱导14d时,细胞长满支架材料的双面。提示脂肪基质干细胞复合至小肠黏膜下层后,在体外经成软骨诱导培养基成软骨诱导后,能够向成软骨细胞分化。     

猪脂肪干细胞与脱细胞真皮基质的生物相容性

背景:脱细胞真皮基质已广泛应用于器官或组织缺损的修补。目的:观察猪脂肪源性干细胞与脱细胞真皮基质的相容性。方法:酶消化法原代培养猪脂肪源性干细胞,利用流式细胞仪和多向诱导分化方法鉴定脂肪干细胞,将其与脱细胞真皮基质共培养。结果与结论:实验成功培养出猪脂肪源性干细胞,流式细胞仪检测结果显示阳性表达CD44和CD105,不表达CD34和CD45;在诱导培养基条件下,可向脂肪细胞、成骨细胞分化。苏木精-伊红染色及扫描电镜发现干细胞能在脱细胞真皮基质表面黏附生长。脂肪源性干细胞与脱细胞真皮基质具有良好的相容性,将两者体外复合培养后,有望将复合物植入体内进行缺损组织、器官的修复。     

猪脂肪干细胞与脱细胞真皮基质的生物相容性

背景：脱细胞真皮基质已广泛应用于器官或组织缺损的修补。目的：观察猪脂肪源性干细胞与脱细胞真皮基质的相容性。方法：酶消化法原代培养猪脂肪源性干细胞,利用流式细胞仪和多向诱导分化方法鉴定脂肪干细胞,将其与脱细胞真皮基质共培养。结果与结论：实验成功培养出猪脂肪源性干细胞,流式细胞仪检测结果显示阳性表达CD44和CD105,不表达CD34和CD45;在诱导培养基条件下,可向脂肪细胞、成骨细胞分化。苏木精-伊红染色及扫描电镜发现干细胞能在脱细胞真皮基质表面黏附生长。脂肪源性干细胞与脱细胞真皮基质具有良好的相容性,将两者体外复合培养后,有望将复合物植入体内进行缺损组织、器官的修复。     

脱细胞异体真皮基质与人脂肪干细胞的生物相容性

背景:脱细胞异体真皮基质具有优良的生物相容性和组织细胞诱导功能.目的:评价人脂肪干细胞与脱细胞异体真皮基质的生物相容性.方法:取健康成年人吸脂术后的脂肪组织分离脂肪干细胞,并行原代与传代培养,传至第3 代,将细胞与脱细胞异体真皮基质联合体外培养3,7 d,倒置相差显微镜和扫描电镜观察细胞在支架材料上的黏附、生长及增殖情况,并计算细胞在材料上的黏附率;XTT比色法检测细胞的生长增殖情况.结果与结论:脂肪干细胞在支架材料上分布均匀,24 h内细胞开始伸展、黏附,二三天完全伸展变形,以梭形为主,呈网状排列;随着培养时间延长,支架上的细胞逐渐增多;人脂肪干细胞细胞与脱细胞异体真皮基质混合培养后平均黏附率为95.03%,并保持正常的生长增殖速度,表明支架对细胞具有良好的黏附性;脱细胞异体真皮基质材料与人脂肪干细胞复合后相容性良好.     

兔软骨基质支架与脂肪干细胞的生物相容性

背景:软骨基质主要为Ⅱ型胶原和葡萄糖胺聚糖,它是软骨细胞分化和发育的先天环境,能促进干细胞向软骨细胞分化。目的:观察兔软骨基质支架与同种异体脂肪干细胞在体外的生物相容性。设计、时间及地点:观察实验,于2007-12/2008-05在遵义医学院珠海校区中心实验室完成。材料:取兔新鲜耳郭软骨组织在蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟的保护下利用低渗透压和TritonX-100脱去细胞成分制备软骨基质。脂肪干细胞由新西兰大白兔颈部脂肪组织经剪碎、Ⅰ型胶原酶消化并离心后获得。方法:将2×l07L-1的脂肪干细胞悬液0.2mL滴在软骨基质支架表面,置于37℃、体积分数为0.05CO2饱和湿度的培养箱中静置4h后加入含体积分数为0.1胎牛血清的DMEM培养液培养。主要观察指标:采用倒置相差显微镜、扫描电镜观察细胞在支架上的黏附、生长及增殖情况,同时计算细胞黏附率,并采用二甲氧唑黄比色法检测细胞增殖趋势。结果:扫描电镜和倒置显微镜观察到脂肪干细胞在软骨基质支架上黏附和变形,其黏附率为93.7%;苏木精-伊红染色见细胞向支架深层生长;二甲氧唑黄比色法测定细胞生长曲线表明细胞在支架上有增殖的趋势。结论:兔软骨脱细胞基质与同种异体脂肪干细胞在体外具有良好的生物相容性。     

免软骨基质支架与脂肪干细胞的生物相容性

背景:软骨基质主要为II型胶原和葡萄糖胺聚糖,它是软骨细胞分化和发育的先天环境,能促进干细胞向软骨细胞分化.目的:观察兔软骨基质支架与同种异体脂肪干细胞在体外的生物相容性.设计、时间及地点:观察实验.于2007-12/2008-05在遵义医学院珠海校区中心实验室完成.材料:取兔新鲜耳郭软骨组织在蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟的保护下利用低渗透压和Triton X-100脱去细胞成分制备软骨基质.脂肪干细胞由新西兰大白兔颈部脂肪组织经剪碎、I型胶原酶消化并离心后获得.方法:将2×107L-1的脂肪干细胞悬液0.2mL滴在软骨基质支架表面,置于37℃、体积分数为0.05CO2饱和湿度的培养箱中静置4 h后加入含体积分数为0.1胎牛血清的DMEM培养液培养.主要观察指标:采用倒置相差显微镜、扫描电镜观察细胞在支架上的黏附、生长及增殖情况,同时计算细胞黏附率,并采用二甲氧唑黄比色法榆测细胞增殖趋势.结果:扫描电镜和倒置显微镜观察到脂肪干细胞在软骨基质支架上黏附和变形,其黏附率为93.7%;苏木精～伊红染色见细胞向支架深层生长:二甲氧唑黄比色法测定细胞生长曲线表明细胞在支架上有增殖的趋势.结论:兔软骨脱细胞基质与同种异体脂肪干细胞在体外具有良好的生物相容性.     

半月板纤维软骨细胞与小肠黏膜下层的组织相容性

目的:观察小肠黏膜下层与半月板纤维软骨细胞的组织相容性,评价其作为组织工程半月板支架材料的可行性及应用价值。方法:实验于2005-06/12在华中科技大学同济医学院附属协和医院骨科实验室完成。①物理和化学方法处理猪小肠黏膜下层支架材料。②体外复合培养兔半月板纤维软骨细胞与小肠黏膜下层。③通过苏木精-伊红染色观察小肠黏膜下层的组织学结构表现;倒置相差显微镜观察细胞生长及与生物材料附着的情况;扫描电镜观察半月板纤维软骨细胞与小肠黏膜下层复合情况。结果:①小肠黏膜下层组织学检查:经物理方法处理后的小肠黏膜下层表面有大量残留的细胞碎屑;化学方法处理后的小肠黏膜下层表面没有残留的细胞碎屑,胶原纤维未受损。②细胞生长及附着情况:相差显微镜观察,复合培养第1～4天时细胞增殖不明显,第5天有较多细胞直接贴附于材料边缘,第7天有大量细胞向材料边缘聚集,细胞形态多为梭形或多角形,连成一片。③细胞与支架复合情况:扫描电镜观察,单纯小肠黏膜下层支架材料可见黏膜表面较粗糙,孔隙较多,大小不一。半月板纤维软骨细胞与小肠黏膜下层复合培养7d可见细胞间通过突起相互连接附着在材料表面,细胞在小肠黏膜下层支架材料上生长、黏附、增殖良好,并分泌大量的细胞外基质成分。结论:小肠黏膜下层具有良好的组织相容性,可以用作组织工程半月板的支架材料。     

Influence of mesenchymal stem cells on stomach tissue engineering using small intestinal submucosa

Small intestinal submucosa (SIS) is a biodegradable collagen‐rich matrix containing functional growth factors. We have previously reported encouraging outcomes for regeneration of an artificial defect in the rodent stomach using SIS grafts, although the muscular layer was diminutive. In this study, we investigated the feasibility of SIS in conjunction with mesenchymal stem cells (MSCs) for regeneration of the gastrointestinal tract. MSCs from the bone marrow of green fluorescence protein (GFP)‐transgenic Sprague–Dawley (SD) rats were isolated and expanded ex vivo. A 1 cm whole‐layer stomach defect in SD rats was repaired using: a plain SIS graft without MSCs (group 1, control); a plain SIS graft followed by intravenous injection of MSCs (group 2); a SIS graft co‐cultured with MSCs (group 3); or a SIS sandwich containing an MSC sheet (group 4). Pharmacological, electrophysiological and immunohistochemical examination was performed to evaluate the regenerated stomach tissue. Contractility in response to a muscarinic receptor agonist, a nitric oxide precursor or electrical field stimulation was observed in all groups. SIS grafts seeded with MSCs (groups 3 and 4) appeared to support improved regeneration compared with SIS grafts not seeded with MSCs (groups 1 and 2), by enabling the development of well‐structured smooth muscle layers of significantly increased length. GFP expression was detected in the regenerated interstitial tissue, with fibroblast‐like cells in the seeded‐SIS groups. SIS potently induced pharmacological and electrophysiological regeneration of the digestive tract, and seeded MSCs provided an enriched environment that supported tissue regeneration by the SIS graft in the engineered stomach. © 2013 The Authors. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine published by John Wiley & Sons, Ltd.     

骨髓间充质干细胞与小肠黏膜下层复合构建组织工程骨膜

背景:用骨膜修复骨缺损,已被大量实验所证实。但其来源有限,限制了临床大量应用。因此,应用组织工程学的原理和方法构建人工骨膜,值得进一步探索和研究。目的:将经成骨诱导的兔骨髓来源的间充质干细胞与猪小肠黏膜下层复合构建组织工程骨膜。方法:取健康新西兰幼兔骨髓,密度梯度离心法分离骨髓间充质干细胞并进行体外扩增培养、成骨诱导分化及鉴定。将诱导分化的骨髓间充质干细胞与猪小肠黏膜下层复合构建组织工程骨膜。观察细胞在生物材料上附着、生长、增殖及细胞分泌细胞外基质情况。结果与结论:经成骨诱导的兔骨髓间充质干细胞在猪小肠黏膜下层上黏附、增殖速度加快,并能长入材料的孔隙内,分泌大量的细胞外基质成分,骨膜厚度随复合培养时间的延长而增加,类似生物骨膜。说明将经成骨诱导的骨髓间充质干细胞与小肠黏膜下层复合可以构建具有生理功能的组织工程骨膜。     

骨髓间充质干细胞与小肠黏膜下层复合构建组织工程骨膜

背景：用骨膜修复骨缺损,已被大量实验所证实。但其来源有限,限制了临床大量应用。因此,应用组织工程学的原理和方法构建人工骨膜,值得进一步探索和研究。目的：将经成骨诱导的兔骨髓来源的间充质干细胞与猪小肠黏膜下层复合构建组织工程骨膜。方法：取健康新西兰幼兔骨髓,密度梯度离心法分离骨髓间充质干细胞并进行体外扩增培养、成骨诱导分化及鉴定。将诱导分化的骨髓间充质干细胞与猪小肠黏膜下层复合构建组织工程骨膜。观察细胞在生物材料上附着、生长、增殖及细胞分泌细胞外基质情况。结果与结论：经成骨诱导的兔骨髓间充质干细胞在猪小肠黏膜下层上黏附、增殖速度加快,并能长入材料的孔隙内,分泌大量的细胞外基质成分,骨膜厚度随复合培养时间的延长而增加,类似生物骨膜。说明将经成骨诱导的骨髓间充质干细胞与小肠黏膜下层复合可以构建具有生理功能的组织工程骨膜。     

猪小肠黏膜下层与兔骨髓间充质干细胞的体外复合培养

背景：小肠黏膜下层细胞外基质材料免疫原性低,具有良好生物相容性,是构建单一结构工程化组织的较好支架材料。目的：观察体外兔骨髓问充质干细胞与猪小肠黏膜下层复合培养的生物相容性。方法：采用密度梯度离心法结合贴壁法分离纯化培养兔骨髓间充质干细胞,在其接种前用红色免疫荧光标记,然后将第2代已标记的兔骨髓间充质干细胞接种在猪小肠黏膜下层上。结果与结论：①组织学观察：骨髓间充质干细胞与小肠黏膜下层上复合培养1周时细胞旱单层生长,荧光显微镜下观察标记的骨髓间充质干细胞显示均匀红色荧光,复合培养2周细胞呈多层生长,并显示更密集的红色荧光。②扫描电镜观察：复合培养2d,骨髓间充质干细胞黏附于材料表面并伸展：复合培养1周,小肠黏膜下层被骨髓间充质干细胞分泌的胶原覆盖;2周后细胞在材料上已大量增殖形成融合,细胞连接紧密,细胞分泌大量基质,并分层。表明小肠黏膜下层与骨髓间充质千细胞具有良好的相容性。     

猪小肠黏膜下层支架复合兔骨髓间充质干细胞构建组织工程骨膜对T淋巴细胞增殖的影响

背景:小肠黏膜下层为无细胞胶原层.含有多种生长因子,主要由Ⅰ、Ⅲ型纤维胶原蛋白构成,与骨膜相似.目的;观察猪小肠黏膜下层支架构建兔组织工程骨膜对兔外周血T淋巴细胞增殖的影响,探讨兔组织工程骨膜的免疫学特性.设计、时间及地点:体外细胞学对比观察,于2005-09/2007-03在兰州大学附属第二医院骨科研究所完成.材料:健康家猪小肠,出生20 d的新西兰纯种兔4只.方法:采用沉淀法以猪小肠黏膜下层作为支架材料,复合培养兔骨髓间充质干细胞成骨诱导细胞构建兔组织工程骨膜.分离兔外周血T淋巴细胞作为单向混合淋巴细胞反应中的效应细胞.实验分3个刺激组:成骨诱导细胞组(间充质干细胞成骨诱导14 d)、组织工程骨膜组(间充质干细胞成骨诱导14 d复合小肠黏膜下层支架)、单纯小肠黏膜下层组(单纯小肠黏膜下层支架),分别加入单相混合淋巴细胞反应液中.主要观察指标:MTT法体外检测各组对外周血T淋巴细胞增殖水平的影响.结果:成骨诱导细胞组、组织工程骨膜组、单纯小肠黏膜下层组的淋巴细胞增殖抑制率分别为(11±3)%,(23±5)%,(48±10)%.成骨诱导细胞组和组织工程骨膜组淋巴细胞增殖抑制率低于单纯小肠黏膜下层组,差异有显著性意义(P<0.01),成骨诱导细胞组与兔组织工程骨膜组比较差异无显著性意义(P>0.05).结论:构建的组织工程骨膜可抑制兔外周血T淋巴细胞增殖,组织工程骨膜与单纯间充质干细胞成骨诱导细胞同样具有调节免疫作用.