巢式聚合酶链反应检测A组轮状病毒基因型的研究

目的用巢式聚合酶链反应（PCR）对A组轮状病毒常见G、P基因型进行检测。方法根据A组轮状病毒不同型别共有的VP4、VP7基因设计的引物分别用于G、P分型的第1次PCR扩增,然后用可以区分不同G型和P型的A组轮状病毒的引物进行第2次PCR扩增。对不同型别A组轮状病毒标准毒株和68例A组轮状病毒腹泻的粪便标本进行了G、P型别的检测。结果不同型别A组轮状病毒标准毒株分别扩增出不同长度片段的条带。68例被检测的A组轮状病毒腹泻粪便标本中G分型以G3为主,P分型以P8为主,其余型别少见。结论巢式PCR检测A组轮状病毒基因型的分型具有较高的灵敏度,操作简便快速,适用于临床检测。     

多重逆转录聚合酶链反应同步检测A组轮状病毒G基因型的研究

目的　为了检测A组轮状病毒VP7的基因型 ,建立一步多重逆转录聚合酶链反应 (RT PCR)同步检测A组轮状病毒G基因型技术。方法　在参照文献并分析A组轮状病毒VP7基因的基础上 ,选取了一个共用的下游引物RVG9和 6个A组轮状病毒G基因型G1、G2、G3、G4、G8和G9的特异性上游引物 ,利用多重RT PCR技术对标准株和样品进行检测。结果　进行一轮RT PCR ,即可至少同时检出 5种不同标准株混合物中的各个基因型。对纯化的A组轮状病毒标准株RNAO2 6 5进行系列稀释后 ,其检测灵敏度可达 1PFU。经对A组轮状病毒阳性的 6 0份样本进行检测 ,其中G3有 5 1例、G2有 4例 ,G1与G3混合感染 3例 ,另外尚有 2例不能分型。　结论　本研究建立的一步多重RT PCR技术对A组轮状病毒基因型研究将为临床诊断和实验研究提供一种快速、灵敏和特异的检测手段。     

荧光定量逆转录聚合酶链反应检测婴幼儿粪便A组轮状病毒

目的建立一种快速、准确、定量检测A组轮状病毒方法。方法选择轮状病毒内壳蛋白基因作为A组轮状病毒的靶序列,设计合成引物和探针;与世界卫生组织（WHO）推荐的轮状病毒胶体金法平行检测,评价荧光定量逆转录聚合酶链反应（PCR）的敏感性与重复性。收集腹泻患儿粪便样本246份,并对其进行检测分析。结果采用荧光定量逆转录PCR检测A组轮状病毒的敏感性为1.0×10^1拷贝/μL;246份粪便样本中检出A组轮状病毒68例（27.64%）;胶体金法检出A组轮状病毒抗原阳性48例（19.51%）。结论应用荧光定量逆转录PCR能够快速、准确检测A组轮状病毒,适合于大样本检测。     

荧光定量逆转录聚合酶链反应检测婴幼儿粪便A组轮状病毒

目的建立一种快速、准确、定量检测A组轮状病毒方法。方法选择轮状病毒内壳蛋白基因作为A组轮状病毒的靶序列,设计合成引物和探针;与世界卫生组织(WHO)推荐的轮状病毒胶体金法平行检测,评价荧光定量逆转录聚合酶链反应(PCR)的敏感性与重复性。收集腹泻患儿粪便样本246份,并对其进行检测分析。结果采用荧光定量逆转录PCR检测A组轮状病毒的敏感性为1.0×101拷贝/μL;246份粪便样本中检出A组轮状病毒68例(27.64%);胶体金法检出A组轮状病毒抗原阳性48例(19.51%)。结论应用荧光定量逆转录PCR能够快速、准确检测A组轮状病毒,适合于大样本检测。     

巢式聚合酶链反应检测SEN病毒方法的建立

目的 建立用于SEN病毒（SENV）检测的巢式聚合酶链反应（nPCR）方法。方法 选择SENV各亚型间高度保守的5′端非编码区（5′－NCR）序列设计2对特异性引物,建立可同时检测SENV所有亚型的nPCR方法。对173例慢性乙型肝炎（CHB）患血清和96份正常人血清进行SENV检测,并随机选择3份PCR阳性产物进行克隆测序。结果 倍比稀释实验表明该方法的终检稀释度为10^3。PCR产物克隆测序结果显示：各分离株与Genbank收录的SENV序列相应区段同源性为95％－96％。CHB患SENV感染率为86．1％,正常人为85．1％,二差异无显性（χ^2=0.381,P=0.537)。结论 该方法敏感、特异且简便经济,适于开展SENV的流行病学研究。     

巢式聚合酶链反应快速检测贝氏柯克斯体的研究

目的 建立特异敏感的快速检测贝氏柯克斯体的分子生物学方法。方法 采用巢式聚合酶链反应（ＰＣＲ）方法,进行实验室模拟检测。结果 以贝氏柯克斯体ｃｏｍｌ基因（编码２７０００蛋白）为靶标设计了２对引物;该引物特异性实验表明仅贝氏柯克斯体特异性 段可以扩增出来,其余相关立克次体均扩不出;敏感性测试结果可检测出１．５ｆｇdisplay structure     

聚合酶链反应在轮状病毒感染诊断和研究中的应用

聚合酶链反应在轮状病毒感染诊断和研究中的应用于化泓（南昌大学食品科学与工程系，南昌３３００４７）本文主要介绍聚合酶链反应（ＰＣＲ）的特点及其在轮状病毒（ＨＲＶ）感染诊断和研究中的应用情况。１ＰＣＲ的特点１．１敏感性高据Ｇｅｎｔｓｃｈ［１］报道，ＰＣＲ...     

新生儿轮状病毒无症状感染的聚合酶链反应研究

选用与 A 组人类轮状病毒(Human Romvirus,HRV)编码 VP7蛋白的第9基因(或8)两个保守序列互补的引物,建立检测 A 组 HRV dsRNA 的聚合酶链反应技术,扩增产物片段约342bp。经逆转录—聚合酶链反应(RT—PCT)检测18例无腹泻症状新生儿89份粪便标本,并与聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)方法进行比较,结果前者检出 HRV 核酸54份(60.7%),而后者则检出35份(39.3%),PCR 结果可能比较接近新生儿排泌轮状病毒的实际情况。     

型特异性引物巢式PCR快速检测HBV基因型及其临床意义

目的　应用型特异性引物巢式PCR检测HBV基因型并初步了解山东地区HBV基因型的分布状况。方法　随机选择山东地区HBVDNA阳性患者共 178例 ,其中无症状携带者 (ASC) 5 3例 ,慢性活动性肝炎 (CH) (包括轻、中、重度 ) 87例 ,肝硬化(LC) 38例 ,先通过外引物进行第一轮PCR ,然后 ,将 6对型特异性引物分到两个反应体系 (MixA和MixB)中分别对第一轮扩增产物进行第二轮PCR ,根据阳性结果判断出样本的基因型。结果　C基因型 85例 (47.8% ) ,B基因型 6 3例 (35 .4 % ) ,B C混合基因型 30例 (16 .8% )。C基因型在活动性肝病 (CH及LC)中占优势 ,而ASC组则是以B基因型为主 ,差异有显著性 (P <0 .0 1)。C基因组中HBeAg阳性率、HBVDNA定量及ALT水平均较B基因组为高 (P <0 .0 0 1或P <0 .0 0 5 ) ,而抗HBe阳性率则在B基因型组显著升高 (P <0 .0 0 5 )。结论　山东地区存在C、B及B C混合基因型 ,并以C基因型为主。型特异性引物巢式PCR敏感性高 ,特异性强 ,可以快捷准确地检测HBV基因型。     

用改良的巢式逆转录聚合酶链反应技术检测血中CK20mRNA

目的：建立一种简便、快速的检测血中微量大肠癌细胞CK20 mRNA的方法。方法：用改良的巢式逆转录聚合酶链反应技术检测血中大肠癌标准细胞株VoLo的CK20mRNA。结果：浓度分别为1、10、100、1000个／mL的大肠癌标准细胞株LoVo的每份标本，均扩增出了符合所设计片段大小的303bp的目的产物条带。结论：用改良的巢式逆转录聚合酶链反应技术检测血中微量存在的大肠癌细胞CK20 mRNA具有简便、快速、灵敏的优点，可以大力地推广于临床。     

天津地区住院腹泻儿童轮状病毒的检测及其毒株型别分析

目的 了解天津地区5岁以下住院腹泻患儿A组RV的感染情况及其型别特点.方法 收集天津市儿童医院2008年5月至2009年4月837份住院腹泻患儿的粪便标本,用胶体金免疫层析法快速检测A组RV抗原,将检测阳性的标本进行细胞培养,产生细胞病变(CPE)后,提取病毒RNA,RT-PCR扩增病毒VP7基因,并将PCR产物阳性标本测序,证实其VP7(G)血清型.同时收集其临床相关资料.结果 837份标本RV抗原阳性率为26.3%(220/837);90.5%(199/220)的RV腹泻发生在24月龄以下患儿;发病高峰时间主要集中在2008年10月至2009年4月;208份接种的RV抗原阳性标本中,病毒分离后用PCR鉴定阳性95份,对其中35份电泳较好的PCR产物阳性标本作序列分析,除1份为G9型、2份为G3型外,其余均为RV G1型.结论 RV是天津地区婴幼儿腹泻的重要病原,流行的基因型以G1为主.     

巢式聚合酶链反应技术在流感嗜血杆菌b型检测中的应用

目的评价巢式聚合酶链反应（nested—PCR）技术在b型流感嗜血杆菌（Hib）检测中的应用价值，估计氨苄西林耐药Hi中b型的比率。方法对2000-2003年北京、上海、广州细菌监测项目中，呼吸道感染儿童鼻咽部分离培养的899株Hi，用E试验法检测氨苄西林耐药情况后，用nested-PCR与玻片凝集法对氨苄西林耐药菌株进行b型检测。结果检出74株氨苄西林耐药Hi。nested—PCR与玻片凝集法检测Hib的结果一致，74株氨苄西林耐药Hi中有2株为Hib，约占2．7％。结论nested—PCR b型荚膜检测方法可作为玻片凝集法的一个重要补充。3地4年内呼吸道感染的儿童鼻咽部携带的氨苄西林耐药Hi中，Hib的比率处于相对较低的水平。     

聚合酶链反应检测解脲脲原体的研究

鉴于临床迫切需要建立特异、敏感、快速的实验诊断方法，从解脲脲原体（ＵＵ）基因组保守区域选择一对寡聚核甘酸引物建立检测ＵＵ的聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术，扩增产物片段为１８６ｂｐ，同时采用ＰＣＲ法和培养法对５２份孕妇宫颈分泌物检测。结果ＰＣＲ检出率（７５％）明显高于培养法检出率（２９％），经统计学配对计数资料χ￣２检验有显著性差异（Ｐ＜０．０２５）。研究表明：ＰＣＲ具有特异、敏感、快速等优点，是临床检测ＵＵ切实可行的方法。     

Rapid differentiation of VGII/AFLP6 genotype within Cryptococcus gattii by polymerase chain reaction

VGII/AFLP6 genotype, also considered to be a cryptic species within Cryptococcus gattii, is an emerging pathogen and always related to higher incidence of C. gattii infection. Here, a polymerase chain reaction-based method with specific primers was developed to rapid differentiation of this emerging pathogen.     

聚合酶链反应限制性片段长度多态性检测维生素D受体基因型

目的建立一种简便、实用、准确的人维生素Ｄ受体（ＶＤＲ）基因型的检测方法，以利于ＶＤＲ基因变异在骨质疏松研究中的应用。方法采用聚合酶链反应（ＰＣＲ）特异性扩增ＶＤＲ基因序列，扩增产物用限制性内切酶ＢｓｍⅠ酶切，琼脂糖凝胶电泳后，观察酶切位点的限制性片段长度多态性（ＲＦＬＰ）图谱。结果应用ＰＣＲＲＦＬＰ法检测了１１０名健康汉族人ＶＤＲ基因型，ｂｂ、Ｂｂ、ＢＢ基因型分布频率分别是９４％（１０３例）、６％（７例）、０。结论该方法简便、准确、重复性好，适用于一般实验室及流行病学调查。     

聚合酶链反应限制性片段长度多态性检测载脂蛋白E基因型

目的建立一种简便、准确、实用的人载脂蛋白Ｅ（ａｐｏＥ）基因型的检测方法。方法应用聚合酶链反应（ＰＣＲ）特异性扩增ａｐｏＥ基因含编码１１２位和１５８位氨基酸的基因序列，扩增产物用限制性内切酶ＨｈａⅠ酶切，聚丙烯酰胺凝胶电泳后，观察酶切位点的限制性片段长度多态性（ＲＦＩＰ）图谱。结果运用ＰＣＲ－ＲＦＬＰ法检测了１１３名健康人ａｐｏＥ基因型，频率分别为ε３／３６９．０％，ε３／２１６．８％，ε４／３１１．５％，ε４／２１．８％，ε４／４０．９％；ε２、ε３和ε４等位基因频率分别是９．３％、８３．２％和７．５％。结论该方法简单、快速、准确，对人体无害，适合于一般实验室开展及大规模人群调查     

应用聚合酶链反应检测真菌性角膜炎

目的:探讨应用聚合酶链反应(PCR)快速检测临床疑似真菌性角膜炎(FK)的方法。方法:以源于医学机会性致病性真菌18srDNA保守区的一对寡核苷酸序列B2F(5'-ACTTTCGTAGGATAG-3')和B4R(5'-TGATCGTCTTCGATAAATA-3')为通用引物,对临床疑似FK的标本进行PCR,并与培养进行对比。结果:在687bp处出现DNA扩增带者为阳性。30份临床标本的真菌培养率为23.3%,而经扩增阳性率为50%。结论:真菌通用引物PCR反应检测真菌性角膜溃疡有较好的敏感性和特异性。