大鼠胚胎中脑神经前体细胞培养、移植治疗大鼠PD模型

目的:研究原代培养的大鼠胚胎中脑前体细胞(mesencephalicprogenitorcells ,MPC)作为帕金森病(Parkinson’sdisease ,PD)细胞替代疗法供体的可行性。方法:PD模型大鼠19只,随机分为细胞移植组(n =9)、假移植组(n =5 )和对照组(n =5 ) ;定期测定移植前后各模型鼠阿扑吗啡诱导的旋转行为的变化,免疫组化定性供体细胞在宿主体内存活和分化的情况。结果:术后6和16周,细胞移植组阿扑吗啡诱导旋转的相对频率与术前比较有显著差异;细胞移植组术后16周时的阿扑吗啡诱导旋转的相对频率平均值与对照组对应的相对频率平均值相比也有显著差异;供体细胞能在宿主体内分化为多突起的DA能神经元。结论:原代培养的胚胎MPC可能作为PD患者细胞替代治疗的供体细胞。     

微囊化PC12细胞移植治疗帕金森病的实验研究

目的　研究治疗帕金森病的一种新方法。方法　采用免疫隔离技术－微囊技术将能分泌多巴胺的ＰＣ１２细胞包裹后,移植到帕金森病大鼠脑内,观察阿扑吗啡诱发病鼠旋转行为变化,高效液相色谱电化学法测定移植区多巴胺含量,酪氨酸羟化酶（ＴＨ）抗体免疫组织化学染色观察移植区阳性细胞表达。结果　帕金森病大鼠阿扑吗啡诱发旋转行为明显改善,不同时相点的移植区多巴胺含量较对照组明显升高,而未行微囊化的ＰＣ１２细胞移植则会有致死性肿瘤形成。移植后３月,大鼠脑内微囊完整,仍有ＴＨ阳性ＰＣ１２细胞存活。结论　微囊化ＰＣ１２细胞移植,可避免药物治疗、立体定向毁损手术、胎脑移植等方法的诸多弊端,因此是一种新的有效的治疗帕金森病的方法。     

多巴胺神经元联合中脑神经干细胞移植治疗帕金森病

目的探讨多巴胺神经元联合中脑神经干细胞移植治疗帕金森病大鼠的作用效果。方法体外分离大鼠胚胎腹侧中脑神经干细胞并行增强型绿色荧光蛋白(EGFP)修饰。分离大鼠胚胎多巴胺神经元,并用CM-Di I染料标记。构建经典的6-羟多巴胺毁损帕金森病大鼠模型。采用立体定向注射技术,将细胞移植到帕金森病大鼠纹状体区,阿朴吗啡(APO)腹腔注射诱导其偏侧旋转,评估细胞移植后运动障碍改善情况。采用免疫荧光组织化学鉴定移植细胞的定植存活、迁移及分化。结果细胞移植能显著改善帕金森病大鼠的运动障碍,以多巴胺神经元联合中脑神经干细胞移植(联合移植组)治疗最为显著,有更多的神经干细胞分化为多巴胺神经元。绝大多数移植细胞停留在移植部位,仅极少数向周围脑区迁移。结论多巴胺神经元联合神经干细胞移植治疗帕金森病大鼠可显著改善其运动障碍,其具体相关分子机制还有待进一步研究。     

微囊化PC12细胞移植后帕金森病大鼠旋转行为变化研究

目的观察微囊化PC12细胞移植后帕金森病大鼠旋转行为的变化。方法采用免疫隔离微囊技术将能分泌多巴胺的PC12细胞包裹后,移植到帕金森病大鼠脑内,观察阿扑吗啡诱发病鼠旋转行为的变化,酪氨酸羟化酶(TH)抗体免疫组化染色观察移植区阳性细胞的表达。结果帕金森病大鼠旋转行为有明显改善,由移植前(11.88±2.04)圈/min减少为移植后(3.46±1.01)圈/min。移植后3个月,大鼠脑内微囊完整,仍有TH阳性PC12细胞存活。结论微囊化PC12细胞移植可明显改善帕金森病大鼠的旋转行为。     

GFP转基因小鼠神经干细胞移植治疗大鼠帕金森病的实验研究

目的观察GFP(绿色荧光蛋白)转基因小鼠胚胎神经干细胞植入帕金森病大鼠纹状体后的存活、分化情况及治疗作用。方法建立PD模型大鼠及体外培养神经干细胞,然后将GFP转基因小鼠神经干细胞定向植入帕金森病大鼠毁损侧纹状体内,于移植后不同时间诱发旋转行为,并与对照组相比,观察症状的改善,并用酪氨酸羟化酶(TH)免疫组织化学染色方法检测移植GFP转基因小鼠神经干细胞的存活及分化状况。结果 GFP转基因小鼠神经干细胞脑内移植后,帕金森病大鼠的旋转行为明显改善。移植后2至4周时可检测到成片或散在的TH免疫阳性细胞。结论 GFP转基因小鼠神经干细胞移植至帕金森病大鼠纹状体后,可分化为多巴胺能神经元并能改善旋转症状。     

人羊膜上皮细胞移植治疗帕金森病鼠的研究

目的 观察人羊膜上皮细胞在帕金森病鼠移植后的存活情况,以及它对帕金森病鼠旋转行为的改善作用.方法 采用6-羟多巴胺立体定向纹状体注射制作帕金森病鼠模型;51只大鼠随机分三组:人羊膜上皮细胞移植组、假手术PBS对照组以及空白模型对照组.制模成功后第5周用人特异性抗体Nestin和Vimentin检测人羊膜细胞的存活情况,第10周切片观察黑质部TH阳性神经元的变化情况,高效液相色谱--电化学仪测定纹状体多巴胺(DA),高香草酸(HVA),3,4-二羟基苯乙酸(DOPAC)等浓度以及脑脊液DA的含量.结果 人羊膜上皮细胞帕金森病鼠侧脑室内移植可以存活达10周;移植组大鼠旋转数较对照组明显降低(P≤0.01);黑质部TH阳性神经元数量较对照组升高(P≤0.01),纹状体区DA、HVA和DOPAC含量较PBS对照组明显升高(P＜0.01～0.05),移植组脑脊液DA含量较PBS对照组也显著增加(P＜0.01).结论 人羊膜上皮细胞侧脑室移植可以改善帕金森病鼠的旋转行为,其机制可能与其增加纹状体区多巴胺等递质水平有关.     

微囊化PC12细胞移植治疗帕金森病的实验研究

目的 研究治疗帕金森病的一种新方法。方法 采用免疫隔离技术—微囊技术将能分泌多巴胺的PC12细胞包裹后，移植到帕金森病大鼠脑内，观察阿朴吗啡诱发病鼠旋转行为变化，高效液相色谱电化学法测定移植区多巴胺含量，酪氨酸羟化酶(TH)抗体免疫组织化学染色观察移植区阳性细胞表达。结果 帕金森病大鼠阿朴吗啡诱发旋转行为明显改善，不同时相点的移植区多巴胺含量较对照组明显升高，而未行微囊化的PC12细胞移植则会有致死性肿瘤形成。移植后3月，大鼠脑内微囊完整，仍有TH阳性PCl2细胞存活。结论 微囊化PC12细胞移植，可避免药物治疗、主体定向毁损手术、胎脑移植等方法的诸多弊端，因此是一种新的有效的治疗帕金森病的方法。     

铁离子对黑质纹状体多巴胺神经元毒性作用的实验研究

目的 探讨铁离子对黑质纹状体多巴胺神经元的毒性作用。方法 采用立体定向偏侧大鼠黑质内注入50μg FeCl3和FeCl2，4周后用阿朴吗啡诱导动物行为学变化，高效液相色谱(HPLC)检测纹状体内多巴胺、去甲肾上腺素、肾上腺素递质含量的变化，免疫组化观察黑质多巴胺神经元和胶质细胞的改变。结果 FeCL3和FeCL2均可引起注射侧纹状体内DA含量选择性降低，而NA、A含量无显著改变；注射侧黑质内DA神经元显著缺失、胶质细胞显著增生；FeCL3组阿朴吗啡诱导大鼠向同侧旋转行为，FeCL2组大鼠于术后即出现特征性自发性对侧旋转行为，阿朴吗啡不能诱发其旋转。结论 铁离子对黑质纹状体多巴胺神经元具有毒性作用，Fe^3 作用最强，胶质细胞的增生可能参与了这一毒性作用过程。     

蛋白酶体功能与帕金森病相关性实验研究

目的 观察蛋白酶体抑制剂诱导大鼠黑质多巴胺能神经元α-突触核蛋白（α-synuclein，α-Syn）的表达及聚集．探讨蛋白酶体功能在帕金森病（PD）发病中的作用机制。方法采用立体定向将蛋白酶体抑制剂Lactacystin注射至大鼠黑质部位。以免疫荧光法观察黑质区多巴胺能神经元变性缺失，并应用免疫荧光双标法观察多巴胺能神经元内蛋白聚集的包涵体及其主要成分α-Syn的表达．然后通过原位杂交分析α-Syn mRNA表达及Western印迹法检测黑质α-Syn表达量改变。结果注射Lactacystin第7天大鼠开始出现自发性活动减少．阿扑吗啡尚可诱导出旋转行为；3周后患侧黑质部位酪氨酸羟化酶（TH）阳性细胞明显减少。TH与硫磺素、硫磺素与α-Syn复合染色呈阳性。α-Syn mRNA表达量升高，蛋白表达水平增加。结论Lactacystin诱导大鼠黑质细胞α-Syn表达升高并出现蛋白聚集可能是导致PD发病的机制之一。     

SPIO、EGFP双标GDNF基因修饰中脑神经干细胞移植治疗帕金森病

目的探讨超顺磁氧化铁(SPIO)、增强型绿色荧光蛋白(EGFP)双标胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)基因修饰中脑神经干细胞(mNSCs)移植对帕金森病(PD)大鼠的治疗作用。方法将PD大鼠随机分为对照组、GFP基因修饰mNSCs移植组和GDNF基因修饰mNSCs移植组,将相应细胞移植到PD大鼠纹状体。阿朴吗啡(APO)诱导PD大鼠旋转行为评估细胞移植的治疗作用。磁共振成像、免疫荧光组织化学研究移植细胞的存活、迁移和分化。结果GDNF基因修饰mNSCs移植能显著改善APO诱导PD大鼠的异常旋转行为;大多数移植细胞停留于移植原位,移植8w后,GDNF基因修饰mNSCs移植组有更多的细胞存活并分化为多巴胺神经元。结论MR I成像可对体内移植的SPIO标记细胞进行活体示踪。GDNF基因修饰胚胎mNSCs移植可显著改善PD大鼠的运动障碍,其分子机制有待进一步研究。     

侧脑室微量注射左旋多巴治疗大鼠帕金森病

目的观察经侧脑室注射左旋多巴对帕金森病（PD）大鼠的影响。方法应用“羟基多巴胺立体定向脑内注射制备偏侧损毁的PD大鼠模型，并用阿扑吗啡（APO）皮下注射诱发大鼠向健侧旋转。将24只PD大鼠随机分为4组（n=6），经侧脑室注入生理盐水组为对照组，余3组分别经侧脑室注射浓度为0．1μg／μl、1μg／μl和5μg／μl的左旋多巴1μl，4μl／d，连续1周；观察在注射后不同时间大鼠旋转行为以及中脑黑质多巴胺能神经元数量的变化。结果经侧脑室注射1μg/μl和5μg/μl的左旋多巴后。与对照组相比，PD大鼠向健侧的旋转圈数明显减少（P〈0．01），左旋多巴效果在2h左右达到高峰，且中脑黑质多巴胺能神经元的数量也明显增多（P〈0．01）。结论经侧脑室注射适当剂量的左旋多巴可有效地改善PD大鼠的旋转行为，并增加中脑黑质多巴胺能神经元数量。     

基因修饰骨髓源性神经元样干细胞治疗帕金森大鼠的研究

目的 观察大鼠酪氨酸羟化酶(tyrosinehydroxylase,TH)修饰的骨髓基质源性神经元样干细胞(neuronoid stem cells derived from bone marrow stem cells,NdSCs-D-BMSCs)在脑室移植途径下对帕金森病(Parkinson disease,PD)大鼠的治疗作用.方法 将酶切鉴定后的新构建质粒pEGFP-C2-TH经电穿孔法转染培养第8天NdSCs-D-BMSCs,注射到PD大鼠模型右侧脑室,观察大鼠行为学变化,移植细胞在大鼠脑组织内的迁移,以及高效液相方法检测脑内DA含量.结果 质粒pEGFP-C2-TH转染NdSCs-D-BMSCs移植后10周,PD大鼠症状显著改善,DA恢复至正常水平33.0%,移植细胞可以在PD大鼠脑内存活,并出现远处迁移.结论 TH修饰的大鼠NdSCs-D-BMSCs经脑室移植对PD大鼠具有明显的治疗作用,为临床中腰椎穿刺干细胞移植的应用提供实验依据.     

微囊化牛视网膜色素上皮细胞移植治疗伴Lewy小体形成帕金森病的实验研究

目的观察微囊化牛视网膜色素上皮细胞(RPE)移植对伴Lewy小体形成帕金森病(PD)大鼠的治疗作用。方法用蛋白酶体选择性抑制剂lactacystin制作伴Lewy小体形成的PD模型;将微囊化牛RPE植入大鼠纹状体,移植分生理盐水对照组(NS)、RPE、空微囊(APA)及微囊化RPE(RPE-APA)四组;观察移植后旋转行为变化、纹状体中多巴胺(DA)和高香草酸(HVA)及酪氨酸羟化酶(TH)含量的变化。结果微囊化RPE的旋转行为在移植后第1周开始改善(改善程度为21.3%,与空微囊组相比P<0.05),第4周改善更加明显(改善程度为57.89%,与第1周相比P<0.05),并一直持续到第14周(改善程度为59.47%,与空微囊组相比P<0.05)。行为学改善的大鼠,纹状体内DA和HVA含量的变化同其行为学改善相符合。行为学有改善大鼠囊内细胞TH染色呈弱阳性,微囊周边的纹状体可见TH阳性纤维密度较空微囊组高。结论微囊化牛RPE脑内移植对伴Lewy小体形成PD大鼠有治疗作用。     

微囊化人视网膜色素上皮细胞移植治疗帕金森病的实验研究

目的 观察微囊化人视网膜色素上皮(RPE)细胞移植治疗帕金森病(PD)大鼠的疗效. 方法 采用机械分离法和酶消化法原代培养人RPE细胞,传代后用高压静电微胶囊成型装置制作海藻酸钠-多聚赖氨酸-海藻酸钠微囊化细胞,将其立体定向移植人6-羟基多巴胺(6-OHDA)所致的PD模型大鼠的右侧纹状体.实验分为模型组、裸细胞(RPE)组、空囊对照(APA)组以及微囊化细胞(APA-RPE)组.检测各组大鼠移植前后阿朴吗啡诱导的旋转行为变化和移植后8周纹状体中多巴胺(DA)的含量. 结果 APA-RPE组大鼠在移植后4周阿朴吗啡诱发的旋转次数[(6.25±1.04)r/min]开始减少,与移植前[(12.88±7.34)r/min]相比减少幅度为51.48%,至第8周[(5.87±2.03)r/min]减少更加明显,减少幅度为54.43%,差异均有统计学意义(P<0.05);与模型组[(108.14±1.89)mol/L]比较,APA-RPE组移植后8周[(342.63±28.32)mol/L]大鼠纹状体DA含量明显增加,差异有统计学意义(P<0.05),而RPE组和APA组未见明显变化. 结论 微囊化人RPE细胞对PD大鼠模型有治疗作用,可作为一种前景良好的治疗PD的方法 进一步研究.     

Therapeutic effects of intranigral transplantation of mesenchymal stem cells in rat models of Parkinson's disease

Stem cell transplantation is a promising tool for the treatment of neurodegenerative disorders, including Parkinson's disease (PD); however, the therapeutic routes and mechanisms of mechanical approaches to stem cell transplantation must be explored. This study tests the therapeutic effect of transplantation of rat bone marrow mesenchymal stem cells (MSCs) into the substantia nigra (SN) of the PD rat. 5‐Bromo‐2‐deoxyuridine‐labeled rat MSCs were transplanted into the SN of the 6‐hydroxydopamine‐injected side of PD rat brains. The behavioral changes in PD rats were examined before and 4 and 8 weeks after MSC transplantation. The expression of tyrosine hydroxylase (TH) in the SN and the striatum and the survival and differentiation of MSCs were assessed by immunohistochemical and double immunofluorescence techniques. Abnormal behavior of PD rats was significantly improved by the administration of bone marrow MSCs, and the number of TH‐positive cells in the SN and the optical density of TH‐positive fibers in the striatum were markedly increased. Transplanted MSCs can survive and migrate in the brain and differentiate into nestin‐, neuron‐specific enolase‐, and GFAP‐positive cells. Our findings suggest that transplantation of rat bone marrow MSCs into the SN of PD rats may provide therapeutic effects. © 2016 Wiley Periodicals, Inc.     

A role for tumor necrosis factor alpha in death of dopaminergic neurons following neural transplantation

Poor survival of transplanted dopaminergic (DA) neurons remains a serious obstacle to the success of cell replacement therapy as an alternative to the current treatments for Parkinson's disease (PD). We have examined the temporal release profile of an inflammatory cytokine, tumor necrosis factor-alpha (TNFalpha), following transplantation of fetal mesencephalic tissue into the rat striatum. The amounts of TNFalpha released in vivo when added to cultures of embryonic DA neurons, significantly reduced the survival of DA neurons in vitro, and this cell death could be prevented by the inclusion of an antibody to the TNFalpha receptor type 1. Inclusion of this antibody in cell suspensions during transplantation also increased the survival of transplanted fetal DA neurons by approximately 250%. Use of this therapeutic antibody approach may offer significant improvements to neural transplantation as a treatment for PD.     

Zuckerkandl's organ improves long-term survival and function of neural stem cell derived dopaminergic neurons in Parkinsonian rats

Transplantation of neural stem cells (NSC) derived dopamine (DA) neurons has emerged as an alternative approach to fetal neural cell transplantation in Parkinson's disease (PD). However, similar to fetal neural cell, survival of these neurons following transplantation is also limited due to limited striatal reinnervation (graft with dense neuronal core), limited host-graft interaction, poor axonal outgrowth, lack of continuous neurotrophic factors supply and principally an absence of cell adhesion molecules mediated appropriate developmental cues. In the present study, an attempt has been made to increase survival and function of NSC derived DA neurons, by co-grafting with Zuckerkandl's organ (a paraneural organ that expresses neurotrophic factors as well as cell adhesion molecules); to provide continuous NTF support and developmental cues to transplanted DA neurons in the rat model of PD. 24 weeks post transplantation, a significant number of surviving functional NSC derived DA neurons were observed in the co-transplanted group as evident by an increase in the number of tyrosine hydroxylase immunoreactive (TH-IR) neurons, TH-IR fiber density, TH-mRNA expression and TH-protein level at the transplantation site (striatum). Significant behavioral recovery (amphetamine induced stereotypy and locomotor activity) and neurochemical recovery (DA-D2 receptor binding and DA and DOPAC levels at the transplant site) were also observed in the NSC+ZKO co-transplanted group as compared to the NSC or ZKO alone transplanted group. In vivo results were further substantiated by in vitro studies, which suggest that ZKO increases the NSC derived DA neuronal survival, differentiation, DA release and neurite outgrowth as well as protects against 6-OHDA toxicity in co-culture condition. The present study suggests that long-term and continuous NTF support provided by ZKO to the transplanted NSC derived DA neurons, helped in their better survival, axonal arborization and integration with host cells, leading to long-term functional restoration in the rat model of PD.     

经阿魏酸钠定向诱导的骨髓间充质干细胞在脑缺血大鼠体内移植研究

目的探讨经阿魏酸钠定向诱导的人骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSC)体内移植后在局灶性脑缺血大鼠脑内的存活及分布状况。方法分离、培养人MSC,经阿魏酸钠定向诱导后用于移植。复制大鼠局灶性大脑中动脉栓塞模型,实验组经股静脉注入诱导后CM-DiI标记的MSC,对照组注入等体积的生理盐水。2周后取脑组织行冰冻切片,荧光显微镜下观察移植细胞在脑组织中的存活及分布状况,同时检测神经元标志物NSE的表达。结果 MSC经阿魏酸钠诱导24h后,细胞逐渐圆缩并伸出突触,呈现神经细胞样形态,CD29表达阳性,CD34表达阴性。实验组大鼠脑内可见CM-DiI标记的MSC,主要分布在缺血侧损伤灶;同时可检测到细胞表面表达神经元标志物NSE。结论 MSC经阿魏酸钠诱导后向神经细胞分化,诱导分化的细胞能在脑缺血大鼠脑内存活,且主要分布在缺血侧损伤区,并仍保留已分化神经细胞的特性。