Expression of TAT-EGFP Fusion Protein and Verification of Its Transmem-brane Activity Into Bladder Cancer Cells and Tissues

目的 构建穿膜肽-增强型绿色荧光蛋白(TAT-EGFP)融合蛋白的原核表达系统,研究该融合蛋白在体外对人膀胱癌细胞(EJ细胞)和膀胱癌组织的跨膜作用.方法 以pEGFP-1载体为模板,设计包含TAT序列的引物,用PCR技术扩增TAT-EGFP基因,扩增产物插入载体pET30a,构建成重组质粒pET30a-TAT-EGFP.将重组质粒转入大肠杆菌BL21中,IPTG诱导TAT-EGFP融合蛋白表达.表达产物用十二烷基硫钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定,Ni-NTA Superflow Cartvidge亲和层析柱纯化融合蛋白.将融合蛋白TAT-EGFP加入培养的EJ细胞和膀胱癌组织,荧光显微镜观察TAT-EGFP融合蛋白进入EJ细胞和膀胱癌组织的情况.结果 成功构建了高表达pET30a-TAT-EGFP重组子,纯化了分子质量约为31 kD的融合蛋白TAT-EGFP.不同浓度的TAT-EGFP融合蛋白对膀胱癌细胞均无明显毒性.TAT-EGFP融合蛋白具有穿过膀胱癌细胞和膀胱癌组织的作用.结论 通过对TAT-EGFP融合蛋白表达纯化及活性分析,证实TAT的蛋白转导作用,为肽类及生物大分子药物进入组织细胞内发挥治疗作用提供了理论基础.     

融合蛋白TAT-EGFP的表达及其对膀胱癌细胞和组织的穿膜活性鉴定

目的构建穿膜肽-增强型绿色荧光蛋白(TAT-EGFP)融合蛋白的原核表达系统,研究该融合蛋白在体外对人膀胱癌细胞(EJ细胞)和膀胱癌组织的跨膜作用。方法以pEGFP-1载体为模板,设计包含TAT序列的引物,用PCR技术扩增TAT-EGFP基因,扩增产物插入载体pET30a,构建成重组质粒pET30a-TAT-EGFP。将重组质粒转入大肠杆菌BL21中,IPTG诱导TAT-EGFP融合蛋白表达。表达产物用十二烷基硫钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定,Ni-NTA Superflow Cartvidge亲和层析柱纯化融合蛋白。将融合蛋白TAT-EGFP加入培养的EJ细胞和膀胱癌组织,荧光显微镜观察TAT-EGFP融合蛋白进入EJ细胞和膀胱癌组织的情况。结果成功构建了高表达pET30a-TAT-EGFP重组子,纯化了分子质量约为31 kD的融合蛋白TAT-EGFP。不同浓度的TAT-EGFP融合蛋白对膀胱癌细胞均无明显毒性。TAT-EGFP融合蛋白具有穿过膀胱癌细胞和膀胱癌组织的作用。结论通过对TAT-EGFP融合蛋白表达纯化及活性分析,证实TAT的蛋白转导作用,为肽类及生物大分子药物进入组织细胞内发挥治疗作用提供了理论基础。     

DMSO增强原核表达TAT-EGFP（Apoptin）穿膜效应的研究

目的：构建pET15b-TAT-EGFP和pET15b-TAT-Apoptin,观察表达的融合蛋白TAT-EGFP在细胞内的定位及TAT-Apoptin的诱导Caski凋亡活性。方法：人工合成编码TAT蛋白转导区的DNA片段,插入载体pET15b后再连接EGFP和Apoptin基因,组成pET15b-TAT-EGFP（Apoptin）重组子。转化大肠杆菌,1mMIPTG诱导TAT-EGFP（Apoptin）融合蛋白表达,His亲和层析柱纯化。培养的Caski细胞经过10%DMSO处理1h后,加入融合蛋白孵育1h,观察TAT-EGFP进入细胞的情况。同时用TUNEL检测TAT-Apoptin诱导Caski凋亡的情况。结果：成功地构建了高表达pET15b-TAT-EGFP（Apoptin）重组子,纯化了分子质量约为30KD的融合蛋白TAT-EGFP和17KD的TAT-Apoptin融合蛋白,并在体外培养的Caski细胞经10%DMSO处理后证实TAT-EGFP融合蛋白穿透生物膜的能力明显增强。结论：通过对TAT-EGFP融合蛋白的表达纯化及活性分析,证实了DMSO能够增强TAT的蛋白转导作用,为肽类及生物大分子药物进入组织细胞内发挥治疗作用提供了理论基础。     

TAT-EGFP融合蛋白表达载体的构建及表达

目的:构建TAT-EGFP原核表达载体,在E.coli BL21中高效表达并纯化.方法:人工合成编码TAT蛋白转导区的DNA片段,插入载体pET28a后得到pET28a-TAT重组质粒,再连接绿色荧光蛋白(EGFP)基因,组成pET28a-TAT-EGFP重组表达子.转化大肠杆菌,IPTG诱导TAT-EGFP融合蛋白表达.表达产物用十二烷基硫钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定,组氨酸亲和层析柱纯化融合蛋白.结果及结论:成功地构建了TAT-EGFP融合蛋白的原核表达载体,在诱导后获得了高效表达并纯化,为进一步研究TAT的蛋白转导作用奠定了基础.     

TAT-NDPK-A蛋白的构建表达及穿膜初步研究

目的 构建pET-TAT-nm23-H1质粒,表达TAT-核苷二磷酸激酶A(TAT-nucleoside diphosphate kinase A,TAT-NDPK-A)融合蛋白,并研究融合蛋白穿膜进入A549细胞.方法 人工合成编码TAT蛋白转导区域的11个氨基酸序列于NDPK-A引物的上游,PCR扩增后将融合基因克隆到pET28(a)原核表达载体上,经IPTG诱导表达、镍离子树脂色谱纯化TAT-NDPK-A蛋白,Westen-blot鉴定分析重组蛋白的抗原性,将TAT-NDPK-A蛋白加入到A549细胞中,荧光免疫组化检测蛋白穿膜进入细胞内.结果 TAT序列与NDPK-A正确融合并插入pET28(a)载体上,经诱导表达纯化成功获得纯度为97%的TAT-NDPK-A蛋白,在培养的A549细胞中加入重组蛋白4 h后在细胞内检测到穿膜的蛋白.结论 构建表达TAT-NDPK-A蛋白,TAT序列能够引导重组蛋白穿过细胞膜进入细胞内,为进一步研究基因的功能奠定了基础.     

PTD-Foxp3融合蛋白的表达、纯化及其生物学功能初步研究

目的:构建带HIV-1 TAT转录因子的穿膜序列(Protein transduction domain,PTD)的pET28a-PTD-Foxp3原核表达载体,表达纯化PTD-Foxp3融合蛋白,并研究其生物学作用.方法:利用基因重组技术构建pET28a-PTD-Foxp3融合蛋白表达载体,并在大肠埃希菌Rosetta(DE3)中表达融合蛋白,经Ni2 分离柱纯化pET28a-PTD-Foxp3融合蛋白.流式细胞术检测融合蛋白穿越细胞膜进入小鼠T淋巴细胞瘤株EL-4细胞中的能力,并通过混合淋巴细胞反应初步分析融合蛋白抑制T细胞活化增殖的生物学作用.结果:成功地构建了pET28a-PTD-Foxp3融合蛋白表达载体,表达并纯化了pET28a-PTD-Foxp3融合蛋白.通过流式细胞术分析证实pET28a-PTD-Foxp3融合蛋白能有效地进入细胞内;同时经混合淋巴细胞反应证明该融合蛋白能明显抑制T细胞的活化增殖能力.结论:成功表达具有生物学活性的PTD-Foxp3融合蛋白,为进一步研究PTD-Foxp3融合蛋白免疫抑制功能和构建表达人PTD-Foxp3融合蛋白,最终应用于临床疾病的治疗奠定了基础.     

TAT／LMP-3融合蛋白的制备及其诱导成骨活性的初步研究

目的：表达并纯化具有入胞转导能力并保持骨诱导活性的重组融合蛋白TAT／LMP-3,观察融合蛋白TAT／LMP-3对人骨髓间充质干细胞的入胞转导活性和诱导其成骨分化的效能．方法：采用基因工程技术构建原核表达载体pET43．1a—TAT／LMP-3和pET43．1a—LMP-3并转化大肠杆菌BL21（DE3）,IPTG诱导融合蛋白表达,Ni—NTA树脂亲和层析柱纯化后进行初步鉴定,同时制备重组蛋白LMP-3的多克隆抗体．将融合蛋白与人骨髓间充质干细胞共孵育,Western Blot技术分析融合蛋白的入胞效应,检测成骨细胞标志性基因表达以分析重组蛋白对人骨髓间充质干细胞成骨分化的影响．结果：成功地构建了pET43．1a—TAT—LMP-3融合基因原核表达载体,获得了TAT／LMP-3的可溶性表达,纯化后融合蛋白TAT／LMP-3纯度大于90％．成功制备了TAT／LMP-3的兔源性多克隆抗体．Western Blot分析证实TAT—LMP-3融合蛋白能以浓度和时间依赖性的方式转导进入人骨髓间充质干细胞,同时,TAT／LMP-3能成功诱导人骨髓间充质干细胞成骨分化．结论：成功进行了TAT／LMP-3融合蛋白的原核表达、纯化和鉴定,构建的TAT／LMP-3融合蛋白具有入胞转导能力同时保持了骨诱导活性,为其在脊柱融合的进一步应用奠定了实验基础．     

TA-SOD融合蛋白表达载体的构建

目的:构建pET28a-TAT-SOD原核表达载体,纯化并测定其活性.方法:PCR法扩增TAT-SOD片段,插入载体pET28a后得到pET28a-TAT-SOD重组表达子,转化人肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导TAT-SOD融合蛋白表达.表达产物用SDS-PAGE电泳鉴定,组氨酸亲和层析柱纯化融合蛋白,利用SOD活性测定试剂盒测定其活性.结果:构建了高表达重组子pET28a-TAT-SOD,获得了相对分子质量约为25 000的具有活性的融合蛋白TAT-SOD,纯度达90%.纯化的蛋白浓度为700 mg/L,活性为197.54 U/L.结论:成功构建了具有活性TAT-SOD融合蛋白的表达载体.     

TAT-SOD融合蛋白表达载体的构建

目的:构建pET28a-TAT-SOD原核表达载体,纯化并测定其活性。方法:PCR法扩增TAT-SOD片段,插入载体pET28a后得到pET28a-TAT-SOD重组表达子,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导TAT-SOD融合蛋白表达。表达产物用SDS-PAGE电泳鉴定,组氨酸亲和层析柱纯化融合蛋白,利用SOD活性测定试剂盒测定其活性。结果:构建了高表达重组子pET28a-TAT-SOD,获得了相对分子质量约为25000的具有活性的融合蛋白TAT-SOD,纯度达90%。纯化的蛋白浓度为700mg/L,活性为197.54U/L。结论:成功构建了具有活性TAT-SOD融合蛋白的表达载体。     

一种基于HIV-1 TAT蛋白质转导结构域细胞内转导系统的成功改建

目的 探索本室构建的pET14b-His-TAT-Flag重组载体表达的融合蛋白在细胞中转导效率低的原因，建立高效的细胞内转导系统。方法 通过PCR方法去除原有载体中的Flag序列，在改建正确的pET14b-His-TAT重组载体基础上插入EGFP编码序列，将经酶切、DNA测序鉴定正确的pETl4b-His-TAT-EGFP质粒转化E.coli BL21（DE3）。经IPTG诱导表达、SDS-PAGE鉴定正确，再经蛋白透析、过滤处理。将His-TAT-EGFP融合蛋白加入ECV304细胞中，用荧光显微镜观察。结果 重组质粒pET14b-His-TAT融合表达载体和pET14b-His-TAT-EGFP重组载体经酶切、DNA测序鉴定证实构建成功。表达纯化出了高纯度His-TAT-EGFP融合蛋白并具有较高细胞内转导活性。结论 成功改建pET14b-His-TAT-Flag重组载体，正确构建pET14b-His-TAT-EGFP载体，His-TAT-EGFP融合蛋白高效表达。并具有明确的细胞内转导活性。     

可溶性TAT PTD-Ngb融合蛋白的原核表达、鉴定与纯化及其对皮质神经元的跨膜转导

 【目的】构建含蛋白转导域（protein transduction domain,PTD）与脑红蛋白（neuroglobin,Ngb）融合基因的表达质粒,原核表达可溶性TATPTD-Ngb,并鉴定、纯化,检测TATPTD-Ngb对皮质神经元的跨膜转导功能。【方法】提取SD大鼠脑组织总RNA,通过RT-PCR法构建编码TATPTD-Ngb的融合基因,克隆入pET28b原核表达载体,转化入大肠杆菌BL21（DE3）pLysS,诱导表达,表达产物进行SDS-PAGE、Western-blot分析及可溶性鉴定,利用所表达的目的蛋白上的6个组蛋白用Ni-NTA琼脂进行亲和层析纯化,将不同浓度纯化的融合蛋白与原代培养皮质神经元共孵育2h,用Western-blot分析融合蛋白的跨膜转导。【结果】成功构建了含有TATPTD-Ngb的原核表达载体,插入片段500bp,成功表达并纯化了可溶性TATPTD-Ngb融合蛋白,相对分子质量约为20k,Westernblot鉴定显示表达蛋白具有抗原性,并具有转导入原代培养皮质神经元的功能,随给予蛋白浓度的增高进入神经元内的融合蛋白量增高。【结论】可溶性融合蛋白TATPTD-Ngb可转导入皮 质神经元，对进一步研究Ngb的功能及蛋白转导技术的应用奠定了基础。     

细胞穿透肽核靶向运输蛋白表达载体的构建及其蛋白转导功能的研究

目的 构建基于细胞穿透肽靶向细胞核运输的蛋白表达载体，并研究其蛋白转导功能。方法 在带His标记的增强型绿色荧光蛋白（EGFP）表达载体pET14b—HE（pET14b-His-EGFP）基础上，利用点突变的方法构建依次含细胞穿透肽（CPP）、连接子、核定位信号（NLS）序列和EGFP的融合蛋白表达载体pET14b—HC（L）NE（pET14b—His—CPP—Linker-NLS—EGFP）；经酶切、测序鉴定载体构建正确后，将重组质粒转化BL21（DE3）宿主菌，经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷诱导表达后、用Ni^2＋亲和层析纯化得到融合蛋白：将融合蛋白透析、过滤除菌后加入培养的真核细胞中，荧光显微镜下观察并进行Western blot检测分析其在活细胞的蛋白转导功能。结果 酶切、测序证实载体构建成功，融合蛋白在大肠杆菌中可有效表达：蛋白转导实验可见融合蛋白可快速穿透细胞膜并进入细胞核，并且这种内化转导功能存在时间和剂量依赖效应。结论 成功构建了基于细胞穿透肽的蛋白表达运输载体，建立了可携带外源蛋白进入细胞浆及细胞核的运输系统，为研究蛋白或多肽的细胞内功能以及运输药物提供了一种经济有效的工具。     

PEP-1-EGFP融合蛋白的表达和纯化及其转导入人脐静脉内皮细胞

目的 表达并纯化融合蛋白PEP—1-EGFP以对其穿透细胞膜的能力进行研究。方法 用分子克隆技术构建出表达型载体pET15b—pep—1—EGFP，在大肠杆菌Ecoli BL21（DE3）中表达融合蛋白PEP—1—EGFP并进行Ni^2＋-树脂柱亲和层析纯化以进行融合蛋白穿透人脐静脉内皮细胞的实验。结果 经测序证实成功构建了表达型载体pET15b—pep—1—EGFP,PEP—1—EGFP融合蛋白在大肠杆菌BL21（DE3）中得到高效表达，纯化后的蛋白浓度为6．18mg／ml，蛋白产量为14．15mg／100ml菌液，SDS—PAGE和Western blotting显示纯化蛋白为融合蛋白PEP—1—EGFP，细胞膜穿透实验证实PEP—1—EGFP融合蛋白能进入人脐静脉内皮细胞。结论 PEP—1—EGFP融合蛋白的表达和纯化及其穿膜能力的研究为PEP-1携带有生物活性的大分子物质进行蛋白治疗奠定了基础。     

间日疟原虫MSP1-19基因的克隆与表达

目的:构建间日疟原虫MSP1-19(Plasmodium vivax merozoite surface protein-1-19,Pv MSP1-19)基因克隆及表达的载体.方法:将MSP1-19基因克隆入原核表达载体pET28a中,构建重组表达载体.以重组载体转化大肠埃希菌BL21,在IPTG诱导下表达重组Pv M...     

HSP-沙眼衣原体MOMP T细胞表位基因的重组、原核表达和蛋白质纯化

目的：构建热休克蛋白65（HSP65）与沙眼衣原体（C.trachomatis,Ct）主要外膜蛋白（MOMP）T细胞表位（简称ctm1）融合蛋白（简称H-ctm1）的原核表达载体,并将其表达及纯化。方法：用PCR技术获得HSP65基因和ctm1基因,并分别将其克隆入pMD18-T载体,采用酶切与连接的方法从pMD18-T载体上获得HSP65基因片段,并将其克隆入pET28a表达质粒,再用相同的方法将ctm1基因连接于HSP65基因片段的下游,从而完成H-ctm1的基因重组。用IPTG诱导转化H-ctm1表达载体的大肠杆菌,以镍金属螯合亲和层析法纯化融合蛋白质。结果：构建了HSP65与ctm1的表达载体pET28a-H-ctm1,DNA序列测定结果表明构建正确。以镍金属螯合亲和层析获得纯度为98%的融合蛋白质。结论：用分子克隆技术正确构建HSP65与Ct MOMP T细胞表位融合蛋白的表达载体,并成功表达与纯化出具有生物活性的融合蛋白。     

前列腺组织特异性启动子介导的TAT-EGFP的靶向表达

目的〓〖HTK〗构建由前列腺特异抗原（PSA）启动子介导、表达带有蛋白转导结构域序列（TAT）的增强型绿色荧光蛋白（EGFP）融合蛋白pPSA-TAT-EGFP表达载体,使TAT所携带的目的蛋白能够在靶组织中高效表达,提高其特异性及表达效率。〖HTW〗方法〓〖HTK〗以pEGFP-1载体为模板,设计包含TAT序列的引物,PCR技术扩增含有酶切位点的小片段Sal I-TAT-EGFP-Not I,经胶回收纯化,连接到T克隆载体。双酶切及测序鉴定后,提取质粒、双酶切后胶回收得到目的小片段。 含有PSA启动子的pPSA-EGFP载体经Sal I和Not I双酶切后,胶回收含有PSA启动子序列的大片段。过夜连接目的小片段与PSA启动子大片段,得到pPSA-TAT-EGFP表达载体。转化、筛选阳性克隆后酶切与测序鉴定。将构建载体分别转染前列腺癌细胞和大肠癌细胞检测其表达情况。〖HTW〗结果〓〖HTK〗成功构建pPSA-TAT-EGFP表达载体。转染结果显示其能够在前列腺癌细胞中特异性表达。〖HTW〗结论〓〖HTK〗引入了PSA组织特异性启动子的TAT所携带的目的蛋白能够在前列腺癌组织中表达。