神经植入对大段组织工程骨成骨影响的早期实验研究

目的 研究在组织工程骨内植入神经束对大段组织工程骨成骨的影响以及初步探讨促进成骨的机制.方法 48只新西兰大白兔,随机分为4组:A组,单纯组织工程骨组;B组,组织工程骨+运动神经束植入组(股神经肌支);C组,组织工程骨+感觉神经束植入组(隐神经);D组,组织工程骨+感觉、运动神经束联合植入组.每只动物均在右侧股骨制备长1.5 cm的节段性骨与骨膜缺损,钢板固定后在骨缺损处分别植入四种方法制备的组织工程骨.术后4、8、12周行大体观察、X线观察、新生骨组织定量观察成骨效果,降钙素基因相关肽(CGRP)及S-100蛋白的免疫组化染色观察其在组织工程骨内的分布,并行半定量分析.结果 在组织工程骨内植入感觉神经后,比单纯组织工程骨和运动神经束植入的修复效果均有明显提高.而在组织工程骨中植入运动神经与单纯组织工程骨修复效果无明显差异,感觉神经植入与感觉、运动联合植入的成骨效果无明显差异.免疫组化染色显示神经肽类物质CGRP、S-100在C组与D组中的表达高于A组与B组,差异有统计学意义.结论 在组织工程骨内植入感觉神经在早期可促进成骨,而植入运动神经未见促进作用, 其机制可能是植入的感觉神经在组织工程骨内分泌神经肽所致.     

神经植入对大段组织工程骨成骨效果的一年观察

目的 观察在组织工程骨内植入神经束后大段组织工程骨的长期成骨效果.方法 新西兰大白兔64只,随机分为四组:A组,单纯组织工程骨组;B组,运动神经束植入组(股神经肌支);C组,感觉神经束植入组(隐神经);D组,感觉、运动神经束联合植入组.每只动物均在左侧股骨制作长1.5 cm的段缺性骨与骨膜缺损,钢板固定后在骨缺损处分别植入四种方法制备的组织工程骨.术后1、3、6、12个月行大体观察、X线和组织学定量观察成骨情况. 结果 术后1、3、6个月时,在组织工程骨内植入感觉神经或联合植入两种神经后,比单纯组织工程骨和运动神经束植入的修复效果均有明显提高.术后12个月时,各组骨再生情况基本一致,但新生骨组织出现一定程度的吸收,其外观较正常股骨细,新生骨组织与兔股骨牢固愈合,并开始塑形且出现髓腔再通. 结论 在组织工程骨内植入感觉神经可促进成骨,而植入运动神经未见促进作用;组织工程骨可以修复兔大段骨缺损;该实验新生骨组织的吸收可能与模型的制作方法有关.     

组织工程骨神经化构建的组织学研究

[目的]通过观察不同神经束植入组织工程骨后组织学的变化,探讨组织工程骨神经化构建的效果.[方法]将新西兰大白兔的骨髓基质干细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs )进行诱导分化为成骨细胞,与β-磷酸三钙(β-tricalcium phosphate,β-TCP)复合制作组织工程骨,分别将不同类型神经束植入组织工程骨,进行以下分组:A组,组织工程骨组; B组,感觉神经束植入组; C组,运动神经束植入组; D组,血管束(含有自主神经)植入组; E组,感觉、运动神经束联合植入组.分别用于修复兔股骨1.5 cm大段骨缺损;各组分别在12周进行组织学的Masson染色,降钙素基因相关肽(calcitonin gene-related peptide,CGRP)的免疫组织化学检测,并进行统计学分析,以比较骨缺损修复情况.[结果]在观察期内,有感觉神经植入的组别和血管束植入的组别在组织学上具有明显骨化作用,而运动神经束植入却没有明显的促进作用.[结论]感觉神经束和血管束具有明显的促组织工程骨成骨作用,可以作为组织工程骨神经化构建的一种方法.     

血管束、感觉神经束植入组织工程骨修复大段骨缺损的成骨研究

目的 观察血管束、感觉神经柬植入组织工程骨修复兔股骨大段骨缺损的成骨特点,探讨其对骨修复的影响. 方法 36只新西兰大白兔均制备左侧股骨干1.5 cm节段性骨缺损模型,随机分为三组(n=12),组织工程骨组(A组):自体骨髓基质干细胞复合β-磷酸三钙构建组织工程骨植入骨缺损;血管束植入组(B组):组织工程骨与血管束同时植入骨缺损;感觉神经束植入组(C组):组织工程骨与感觉神经束同时植入骨缺损.各组动物术后1、3、6个月行X线检查及影像学评分,同时每组各处死4只动物行大体及组织学观察.结果 影像学评分显示各时间点B组与C组的成骨优于A组,差异有统计学意义(P<0.05);B、C组间成骨差异无统计学意义(P>0.05).组织学观察显示新生骨多出现在血管周围,成骨方式以软骨内成骨为主. 结论血管束、感觉神经束植入组织工程骨的方法能更好地促进组织工程骨成骨及大段骨缺损修复.     

神经肽在血管神经化组织工程骨中的分布

目的 观察在组织工程骨内植入血管、神经束对大段组织工程骨成骨的]响,并探讨神经肽类物质在其中的分布.方法 36只新西兰大白兔,随机分为3组:A组,单纯组织工程骨组;B组,血管束植入组(股血管束);C组,感觉神经束植入组(隐神经柬).每只兔均在右侧股骨制造长1.5 cm的段缺性骨与骨膜缺损,钢板固定后植入3种方法制备的组织工程骨.术后4、8、12周行大体观察、X线观察、新生骨组织定量观察成骨效果,神经肽Y(NPY)及降钙素基因相关肽(CGRP)的免疫组织化学染色观察其在组织工程骨内的分布,并行半定量分析.结果 在组织工程骨内植入血管、神经后,比单纯组织工程骨的修复效果有提高,术后12周新生骨小梁占骨缺损面积的平均百分数分别为(48.67±4.21)%、(75.13±5.75)%、(73.44±2.99)%.对新生骨的组织学染色半定量分析显示3组间差异有统计学意义(F=105.735,P＜0.01),免疫组织化学染色显示神经肽类物质NPY、CGRP在B组与C组中的表达高于A组,差异有统计学意义(F=30.509及16.475,P＜0.01).结论 在组织工程骨内植人血管、神经束在早期可促进成骨,其机制可能是植入的血管、神经束在组织工程骨内发芽并分泌神经肽所致.     

单纯血管束、神经束分别植入组织工程骨修复兔骨缺损对降钙素基因相关肽和神经肽Y表达的影响

目的 比较单纯血管、神经束分别植入组织工程骨修复兔骨缺损对神经肽降钙素基因相关肽(calcitonin gene related peptide,CGRP)和神经肽Y(neuropeptide Y,NPY)表达影响. 方法 36只新西兰大白兔,随机平均分为3组:A组为组织工程骨+股血管束植入,B组为组织工程骨+感觉神经束植入,C组为单纯组织工程骨.每只动物均在右侧股骨制作长1.5 cm的段缺性骨与骨膜缺损,钢板固定后分别用以上方法修复大段骨缺损.术后3、6、12个月行免疫组化染色检测修复骨段内的CGRP和NPY的表达,并采用图像分析软件行半定量分析. 结果 CGRP和NPY的表达量在A、B、C 3组均随时间推移而增多(P=0.000),在3个月时A组较B组多(P=0.000),但在6个月和12个月时A组和B组的表达量无明显差异(P>0.05).A、B两组在3、6、12个月时的表达最均较C组多(P=0.000). 结论 与单纯神经束植入组相比,单纯血管束植入组织工程骨修复兔骨缺损在术后3个月可以明显促进CGRP和NPY表达,但后期两组对神经肽表达的影响作用无明显差异.     

组织工程骨神经化构建及其修复兔大段骨缺损的实验研究

目的构建功能化组织工程骨是目前骨组织工程研究过渡到临床应用的重要方向。通过组织工程骨的神经化构建,在体内外实验的基础上探讨神经因素在骨组织工程中的作用。方法5～6月龄健康新西兰大白兔54只,雌雄不限,体重2～3kg,从骨髓中分离培养BMSCs;制备兔外周感觉神经匀浆和运动神经匀浆,按1∶10(V/V)加入LG-DMEM培养基,培养第2代BMSCs。对照组以LG-DMEM培养基培养。通过MTT实验、ALP染色和Ⅰ型胶原免疫细胞化学染色鉴定,观察感觉、运动神经匀浆在体外对BMSCs增殖和成骨分化的影响。将体外经成骨诱导的BMSCs复合β磷酸三钙(βtricalcium phosphate,β-TCP)制备组织工程骨,植入兔体内修复15mm股骨与骨膜缺损。将兔随机分为3组,每组18只,A组在β-TCP生物支架材料的侧槽中植入感觉神经束,B组植入运动神经束,C组为单纯组织工程骨;分别于术后4、8、12周通过X线片、骨密度检测和免疫组织化学染色观察神经化组织工程骨的成骨效应。结果MTT法检测示,各组吸光度(A)值随培养时间延长均逐渐增加,从6d开始,感觉神经组和运动神经组的A值均低于对照组(P0.01);8d和10d时,感觉神经组A值低于运动神经组(P0.05)。培养7d后,感觉神经组和运动神经组ALP染色阳性细胞数均明显少于对照组;培养14d后,感觉神经组和运动神经组的细胞未见Ⅰ型胶原阳性表达,对照组的细胞Ⅰ型胶原表达呈阳性。兔大段骨缺损修复区的术后X线片及Yang评分提示,随着时间延长,各组Yang评分逐步升高,8周后A组评分高于B、C组(P0.01),B、C组间差异无统计学意义(P0.05)。术后12周骨密度检测显示A组骨缺损修复良好,骨密度值高于B、C组(P0.01),B、C组间差异无统计学意义(P0.05)。术后12周组织工程骨成骨局部的免疫组织化学染色显示,S-100在A组表达量较高,B组表达量较少,C组偶见表达;降钙素基因相关肽在A组表达量高,B、C组表达量较少。结论感觉、运动神经匀浆抑制BMSCs增殖和成骨分化,神经化组织工程骨的成骨和塑形与感觉神经作用更为密切。     

植入感觉神经束和血管束的组织工程骨修复兔股骨缺损对神经激肽1受体和血管活性肠肽受体1表达的影响

目的研究植入了感觉神经束和血管束的组织工程骨修复兔股骨缺损对神经激肽1受体(neurokinin1receptor,NK1R)和血管活性肠肽受体1(vasoactive intestinal peptide type1receptor,VIPR1)表达的影响。方法 5月龄健康新西兰大白兔54只,抽取髂骨红骨髓,全骨髓贴壁筛选法分离、培养BMSCs。取第3代BMSCs成骨诱导培养7d后,与β磷酸三钙支架复合培养制备组织工程骨。将54只兔制备单侧股骨1.5cm缺损模型,随机分成3组(n=18),分别在修复缺损的组织工程骨侧槽中植入感觉神经束(A组)、股血管束(B组),以及空白对照(C组)。术后4、8、12周各组分别处死6只兔,对修复骨段进行大体观察、X线片检查成骨情况,提取总RNA行实时荧光定量PCR检测NK1R mRNA和VIPR1mRNA的表达情况,并行免疫组织化学染色检测NK1R和VIPR1的表达情况。结果大体观察和X线片检查均显示A、B组成骨情况优于C组。各组X线片评分随时间延长逐渐升高。术后4周B组X线片评分高于A、C组(P0.05),A、C组间差异无统计学意义(P0.05);术后8、12周A、B组X线片评分高于C组(P0.05);A、B组间差异无统计学意义(P0.05)。实时荧光定量PCR检测示各组NK1R mRNA和VIPR1mRNA的表达量均于术后8周达峰值,各时间点间表达量差异均有统计学意义(P0.05);各时间点A、B组NK1R mRNA和VIPR1mRNA表达均高于C组(P0.05),B组高于A组(P0.05)。免疫组织化学染色显示,各组NK1R和VIPR1的阳性表达均在术后8周最强,且A、B组的表达强于C组。结论血管束植入法可以替代感觉神经束植入法构建血管、神经化组织工程骨,并能促进神经肽受体的表达,避免因感觉神经束植入导致支配区的感觉缺失,是一种较理想的复合组织工程骨构建方法 。     

骨髓基质干细胞联合血管束植入构筑血管化组织工程骨修复兔大段骨缺损

目的 研究兔骨髓基质干细胞(BMSCs)联合动静脉血管束植入异种脱蛋白松质骨(XDCB)构筑血管化组织工程骨修复兔桡骨中远段完全骨膜骨缺损的能力. 方法 从兔髂嵴捕骨髓培养制备兔BMSCs,将第5代BMSCs种植于多孔XDCB,并进行成骨诱导2周制备组织工程骨,手术中分离兔桡动、静脉血管束.动物模型为制备24只兔舣侧桡骨中远段完全骨膜骨缺损1.5 cm共48侧,分4组修复(n=12),A组为空白未治疗组,B组为单纯材料+血管束植入组(XDCB+VB),C组为组织工程骨组(XDCB+BMSCs),D组为组织工程骨+血管束植入组(XDCB+BMSCs+VB),符组交叉配对.分别于术后4、8、12周行X线片、大体解剖、组织切片、生物力学等检查,观察各组骨缺损修复效能及移植物血管化情况.结果 D组骨缺损修复效能(术后12周新骨面积比2.02%±0.16%)及血管化情况(术后12周血管面积比6.89%±0.32%)优于C组(1.50%±0.28%和3.17%±0.19%),而C组又优于B组(1.59%±0.19%和6.52%±0.23%),A组骨缺损未修复,各组结果差异有统计学意义(P<0.05).结论 BMSCs联合动静脉血管束植入构筑的血管化组织工程骨能促进成骨过程和新生骨的血管化,显著提高组织工程骨修复大段骨缺损的能力.     

骨髓基质干细胞与生物衍生骨复合修复山羊胫骨缺损的影像学研究

目的探讨骨髓基质干细胞(MSCs)与生物衍生骨复合修复山羊胫骨的长段骨-骨膜缺损,以及修复负重骨缺损的可行性. 方法将18只12月龄健康杂种青山羊(雌雄不限),制备成双侧胫骨中段20 mm骨-骨膜缺损模型,常规钢板螺钉固定;MSCs与生物衍生骨于体外复合培养;对同一只山羊将复合物植入右侧胫骨缺损处作为实验组,以单纯材料植入左侧胫骨缺损处作为对照组,空白组不植入任何材料;在8、12、16和24周各时间点分别行标本的大体观察、X线片观察和骨密度测试,比较其修复骨缺损的能力. 结果大体观察、X线片和骨密度测试显示:实验组8周骨缺损部分修复,12、16周骨缺损完全修复,8、12和16周其骨密度较对照组高,差异有统计学意义(P＜0.05);24周实验组与对照组骨密度差异无统计学意义;空白组骨缺损未修复. 结论组织工程骨早期修复骨缺损能力较强,且较单纯材料成骨量大、迅速,能够对负重骨缺损进行有效的修复.     

种植脂肪干细胞的去细胞神经修复坐骨神经缺损的实验研究

目的 探讨脂肪干细胞(ADSCs)应用于组织工程化外周神经修复大鼠坐骨神经缺损的效果.方法 48只体重200～220 g的雌性F344大鼠随机分成6组,每组8只,分别用下面6种不同的实验组修复15 mm长坐骨神经缺损.A组:种植ADSCs的去细胞神经;B组:种植诱导ADSCs的去细胞神经;C组:种植许旺细胞(SCs)的去细胞神经;D组:去细胞神经;E组:自体神经移植;F组:空白对照.通过神经电生理检测、荧光金逆行示踪、组织学检测和坐骨神经功能指数测定评价各组修复神经缺损的效果.结果 术后12周,F组未见桥接物,A组和B组的神经电生理等各项指标均分别优于D组(P＜0.05或P＜0.01),与C组和E组间差异无统计学意义(P＞0.05).结论 初步结果显示ADSCs及诱导后ADSCs作为种子细胞,与去细胞神经构建的组织工程化外周神经移植体,能够修复外周神经缺损.     

Comparative study of different surgical procedures using sensory nerves or neurons for delaying atrophy of denervated skeletal muscle

To observe the effect of sensory components on muscle atrophy, 4 surgical procedures applying sensory nerves or neurons to the denervated muscle were conducted in a rat model: sensory nerve implantation (group B), sensory motor nerve crossover (group C), dorsal root ganglia implantation (group D), and implantation of preganglionically avulsed sensory nerve (group E). Rats with complete denervation served as controls (group A). The degree of muscle atrophy was evaluated after surgery by fibrillation potential amplitude, muscle wet weight, muscle fiber cross-sectional area, collagen content, and protein content. Compared with group A, the results in groups B, D, and E were superior 1 month after surgery and the results in groups B, C, and E were superior 3 months after surgery. Implantation of normal or preganglionically avulsed sensory nerve delayed atrophy. Dorsal root ganglia implantation only had a short-term trophic influence. In the animal model setting, sensory motor nerve crossover is effective only after it is maintained for at least 3 months.     

血管束、感觉神经束植入组织工程骨降钙素基因相关肽和受体的时空分布

目的 探讨单纯血管束、感觉神经束分别植入组织工程骨修复兔骨缺损对降钙素基因相关肽(CGRP)及受体(CGRPR-1)表达的影响.方法 54只新西兰兔按随机数字表法分为三组(n=18):感觉神经束植入组(A组)、血管束植入组(B组)、单纯组织工程骨对照组(C组),于术后4、8、12周分别处死18只动物,对修复骨段行Masson染色观察骨形成与改建过程,同时行免疫组化染色检测修复骨段内CGRP及CGRPR-1的表达,并提取总RNA行Real-time PCR检测CGRP及CGRPR-1的表达情况.结果 各时间点A组和B组CGRP、CGRPR-1 mRNA的表达均高于C组,且A组表达高于B组,差异均有统计学意义(P<0.05);随时间延长,组织工程骨内CGRP及CGRPR-1 mRNA呈先增高后逐渐降低趋势,8周时mRNA高于4周和12周,4周时mRNA在3个检测时间点中最低,差异均有统计学意义(P<0.05);组织工程骨内新生骨质边缘、骨膜、血管周围均有CGRP阳性表达,分布均匀;CGRPR-1于成骨细胞周围表达较多.结论 植入感觉神经柬和血管束均能促进神经肽分泌,植入血管束分泌更多.     

Experimental investigation into reparative osteogenesis with fibrin adhesive

Summary An experimental investigation was carried out in order to evaluate the effects of fibrin adhesive on the reparative osteogenesis of bone grafts in the short, medium, and long term. Sixty fully developed New Zealand White rabbits under general anesthesia were grafted with homologous bone tissue in the proximal third of each tibias. Fibrin adhesive was used in one hind limb only. The animals were killed at a predetermined time. Both tibias were removed and subjected to radiographic and histologic analyses. The reparative process was observed and the differences between the fibrin adhesive-treated grafts and the reference group in the first few weeks were determined. No substantial difference was detected in the reparative osteogenetic process of the graft in the animals killed after 2 months.     

Experimental investigation into reparative osteogenesis with fibrin adhesive

An experimental investigation was carried out in order to evaluate the effects of fibrin adhesive on the reparative osteogenesis of bone grafts in the short, medium, and long term. Sixty fully developed New Zealand White rabbits under general anesthesia were grafted with homologous bone tissue in the proximal third of each tibias. Fibrin adhesive was used in one hind limb only. The animals were killed at a predetermined time. Both tibias were removed and subjected to radiographic and histologic analyses. The reparative process was observed and the differences between the fibrin adhesive-treated grafts and the reference group in the first few weeks were determined. No substantial difference was detected in the reparative osteogenetic process of the graft in the animals killed after 2 months.