佛手茎尖玻璃化超低温保存和植株再生

目的 为佛手种质资源的保存提供一条新途径.方法 对佛手茎尖进行了玻璃化超低温保存,并对保存后的茎尖进行微嫁接试验,获得再生植株.结果 佛手茎尖在含5%DMSO和5%蔗糖的MS培养基上预培养48h后,切取3～4 mm的茎尖,室温(25℃)下装载液(60%PVS_2)预处理30 min,0℃下玻璃化液PVS_2处理80 min,投入液氮保存24 h后取出,在40℃水浴快速化冻,室温下分别用1.2 mol/L蔗糖和MT基本培养基洗涤2次,每次10 min.保存后的茎尖经TTC法检测,成活率达81.25%;将茎尖嫁接到黑暗培养基的砧木上,再生率可达52.94%,且再生植株生长和分化正常,经PCR检测不含黄龙病病原.结论 玻璃化超低温保存方法可用于佛手种质资源保存.     

罗汉果试管苗茎尖玻璃化法超低温保存及植株再生

目的 为罗汉果Siraitia grosvenorii种质资源的保存提供一条新途径.方法 以继代15d生长健壮的罗汉果试管苗0.8～1cm长嫩梢进行预培养,剥取2～3 mm茎尖,25℃下60%PVS_2装载,再用100%PVS_2在0℃脱水处理,更换新鲜100%PVS_2后投入液氮保存24 h,化冻,用MS+1.2 mol/L蔗糖的液体培养基洗涤,滤纸吸干后接种于MS+1.0 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA+0.1mg/L GA_3+0.8%琼脂粉+45 g/L蔗糖的恢复培养基上,25℃暗培养7 d,转入正常光下培养.再生苗生根培养基为1/2 MS+0.2 mg/L NAA+30 g/L蔗糖.结果 嫩梢于MS+0.7 mol/L蔗糖的培养基上预培养3 d,茎尖装载40 min,脱水50 min,液氮保存后于40℃水浴中快速化冻,洗涤40 min,恢复培养1周时存活率最高可达100%,30 d时再生率最高可达78.33%.再生苗转入生根培养基可形成完整植株.结论 罗汉果种质资源的玻璃化法超低温保存操作简单、成活率高、再生植株正常.     

皖贝母茎尖玻璃化法超低温保存研究

目的:建立皖贝母茎尖超低温保存体系.方法:采用玻璃化法超低温保存技术,4℃低温预处理1周,2～3mm的茎尖经0.4 mol·L-1蔗糖MS液体培养液预处理3d,60％ PVS2装载20 min,100％ PVS2冰浴脱水60 min,换入新鲜的0℃PVS2溶液后迅速投入液氮保存,40C水浴解冻1 min后用1.2 mol·L-1蔗糖培养液洗涤2次,每次10 min,接种在恢复培养基上,20℃暗培养2周,转入正常光下培养,1个月后统计再生率.利用PCR技术检测再生植株的遗传稳定性.结果与结论:TTC法检测茎尖冻存后存活率为79.9％,在恢复培养基上茎尖再生率为52.3％.从基因组DNA检测结果表明,再生植株其遗传稳定性未发生改变.     

玻璃化法超低温保存怀山药种质的技术研究

目的研究怀山药种质资源的玻璃化超低温保存技术。方法以B号怀山药带芽茎段为材料进行玻璃化超低温保存,并采用培养法检测保存后材料的成活率,从而筛选出最佳的玻璃化超低温保存技术体系。结果B号怀山药带芽茎段玻璃化超低温保存较佳的技术体系是继代生长60d的怀山药无菌苗置4℃冰箱低温锻炼7d;在无菌条件下切取1~1.5cm的带芽茎段,转至含5%蔗糖 3%甘露糖的培养基内,置4℃冰箱预培养2d;用60%的PVS1(22%甘油 13%乙二醇 13%聚乙二醇 10%二甲基亚砜)在0℃处理60min,再用100%的PVS1在0℃条件下处理60min,随即迅速投入液氮;保存24h后,在37℃水浴中快速化冻,用含7%蔗糖的MS培养液洗涤4次,每次停留10min;转至再生培养基(MS KT2mg/L NAA0.02mg/L)再培养,成活率可达75%以上,再生苗与常温苗形态指标差异不大。结论本试验成功地建立了怀山药种质资源玻璃化法超低温保存的技术体系,为怀山药种质资源的长期保存提供了一条有效途径。     

麻花秦艽休眠芽的玻璃化超低温保存及植株再生

目的:采用玻璃化超低温技术保存濒危药用植物麻花秦艽的休眠芽。方法:以休眠芽作试材,研究休眠芽大小、不同的预处理方法、装载时间和玻璃化保护液等因素对休眠芽超低温保存效果的影响。结果:10～11 mm大小的休眠芽在含有0.3 mol/L、0.5 mol/L、0.7 mol/L蔗糖的MS培养基中暗培养各1 d,在装载液(2 mol/L甘油+0.4 mol/L蔗糖)中20℃处理20 min,于玻璃化保护液PVS2(30%甘油+15%乙二醇+15%二甲基亚砜+0.4mol/L蔗糖)中0℃处理40 min,换新鲜PVS2保护液并迅速投入液氮,液氮中保存24 h后,在40℃水浴中解冻2～3 min,用含1.2 mol/L蔗糖的1/2MS无机盐液体培养基洗涤2次,每次10 min,无菌滤纸吸干后接种到恢复培养基中,在22℃条件下暗培养1周后转入正常条件培养,再生率高达83.3%。结论:建立了高效的麻花秦艽休眠芽玻璃化超低温保存技术体系。     

野葛种质的玻璃化法超低温保存

野葛的玻璃化法超低温保存技术实验结果表明:采用无菌苗置4℃冰箱低温锻炼5 d;在无菌条件下切取1.5 cm的带芽茎段,转至含5%二甲基亚砜 5%蔗糖的培养基内,置4℃冰箱预培养1 d;用60%的PVS2(30%甘油 15%乙二醇 15%二甲基亚砜 0.4 mol/L蔗糖)和100%的PVS2分别在0℃条件下过渡和脱水各30 min,随即投入液氮;保存24 h后,在40℃水浴中快速化冻90 s,用含1.2 mol/L蔗糖的MS培养液洗涤2次,每次停留10min;转至再生培养基MS BA2 mg/L NAA1 mg/L暗处培养7 d后再置于光下培养,成活率可达57%-58%。所获再生苗与常温苗形态差异不大。     

湖北麦冬茎尖离体培养技术研究

目的探讨湖北麦冬种质改良的途径。方法利用茎尖分生组织离体培养技术再生植株。结果茎尖外植体愈伤组织诱导,不定芽分化与增殖的适宜培养基为MS BA(1.0~2.0)mg/L IBA(0.1~0.3)mg/L;生根适宜培养基为1/2MS NAA0.1或IBA0.1~0.3或IAA0.3。结论初步试验湖北麦冬茎尖再生植株生产性状优于当地品种。     

黄独微型块茎胚性愈伤组织超低温保存及遗传稳定性研究

目的 对影响黄独Dioscorea bulbifera微型块茎胚性愈伤组织小滴玻璃化法超低温保存的多种因素进行探讨,并从形态学、生理学、DNA量以及光合特性参数和叶绿素荧光参数等方面对其冻后再生苗的遗传稳定性进行检测。方法 采用微型块茎及其胚性愈伤组织进行诱导,小滴玻璃化法超低温保存,通过检测包括总叶绿素量、可溶性蛋白量、可溶性总糖量以及超氧化物歧化酶和过氧化物酶活性等植物生理指标,并采用流式细胞术的方法对遗传稳定性进行考察。结果 最佳的黄独微型块茎胚性愈伤组织超低温保存条件:室温下将黄独微型块茎胚性愈伤组织块转入MS+2 mg/L KT+0.5 mg/L NAA+0.5 mg/L 2,4-D+0.3 mol/L蔗糖的培养基中预培养1 d。预培养后的胚性愈伤组织块在(25±1)℃下转入装载液(MS+2 mol/L甘油+0.4 mol/L蔗糖,pH 5.8)中处理20 min,再用100% PVS2于0 ℃脱水40 min。脱水后将材料转入铝箔条上的PVS2小滴中,液氮冰冻后迅速将材料转入冷冻管中(装满液氮)。投入液氮罐保持1 d后,取出铝箔条,浸入37 ℃洗涤液(MS+2 mg/L KT+0.5 mg/L NAA+0.5 mg/L 2,4-D+1.2 mol/L蔗糖,pH 5.8)中,胚性愈伤组织块脱落后,室温下再用新鲜洗涤液对其洗涤3次,每次10 min。洗涤后的材料接入分化培养基(MS+2 mg/L KT+0.5 mg/L NAA+30 g/L蔗糖+5 g/L琼脂粉)中,暗培养2 d后转到12 h/d的光周期中培养,细胞存活率达89%以上。黄独微型块茎胚性愈伤组织小滴玻璃化法超低温保存后的再生苗与胚性愈伤组织常温再生苗在形态指标和生理指标等方面均无显著性差异(P> 0.05),两者的DNA量也未发生显著变化(P> 0.05)。结论 建立了黄独微型块茎胚性愈伤组织小滴玻璃化法超低温保存的技术体系,其再生植株经检测无遗传变异,为薯蓣属植物种质资源的长期保存提供了理论依据和技术基础。     

植物生长抑制剂对短瓣石竹离体保存的影响

目的:建立一种能延长短瓣石竹种质资源离体保存时间的方法。方法:以短瓣石竹无菌苗为材料,研究了无机盐、PP333、CCC、ABA、甘露醇及蔗糖对短瓣石竹无菌苗离体保存的影响,并进行再生苗与继代苗形态指标的比较。结果:短瓣石竹无菌苗在3种无机盐(MS、 1/2 MS、1/4 MS)浓度培养基上的离体保存时间无显著差异,培养90 d后植株叶片开始逐渐枯黄掉落,存活率达到80%;添加蔗糖浓度为25～30 g/L的无菌苗长势较好,植株健壮,叶片嫩绿,保存时间长达100 d;四种植物生长抑制剂均能抑制植株的生长,具有壮苗的作用,其中PP333的壮苗效果最佳,且植株长势良好。结论:在1/2 MS+1.0～1.5 mg/L PP333+25 g/L蔗糖培养基上,无菌苗能保存120 d,植株恢复培养生长正常,成活率达90%以上,适合短瓣石竹无菌苗的离体保存。     

黄独的茎尖培养和病毒检测

目的 以黄独为试材,研究不同因素对黄独茎尖培养的影响,以期找到适合黄独茎尖分化成苗的培养基和脱毒检测方法 .方法 采用植物组织培养的方法 进行茎尖培养,采用症状学法、指示植物法和RT-PCR法对茎尖脱毒植株进行病毒检测.结果 黄独茎尖的最佳消毒方式是先用70%酒精消毒30 s,再用0.1%HgCl_2消毒12 min;在37℃中热处理7 d后再切离0.5 mm茎尖效果较佳.茎尖再生芽增殖的最佳培养基是MS+KT 2 mg/L+NAA 0.5mg/L;黄独茎尖再生芽的最适生根培养基为1/2MS+NAA 0.5 mg/L;黄独脱毒苗最好的移栽基质为珍珠岩-蛭石(2∶1);RT-PCR法是检测黄独马铃薯Y病毒(PVY)感染的主要方法 ,通过病毒学检测,其平均脱毒率为86.5%.结论 首次建立了黄独茎尖脱毒培养的体系,为黄独脱毒苗的快速繁殖及工厂化生产奠定了技术基础.     

赶黄草的转录组测序及分析

目的获得赶黄草Penthorum chinense转录基因参考序列和表达量信息,探索赶黄草药用活性成分生物合成的遗传基础,为赶黄草的重要功能基因研究提供参考。方法采用Illumina Hi Seq 2000高通量测序技术,对赶黄草进行转录组测序,对获得的数据进行过滤组装,对得到的unigene进行比对注释,同时对本研究获得赶黄草活性成分合成相关代谢通路基因进行分析。结果共获得了40 005 442条有效的短读序,通过de novo拼接得到42 306个unigene,开放阅读框(ORF)分析共计得到518个ORF,其中75个ORF具有转录因子结构域。通过KEGG分析,检测到33、32、59、68个unigene分别参与黄酮类生物合成、固醇类生物合成、萜类骨架生物合成和羧酸代谢。结论本研究发现的这些基因对赶黄草遗传改良和药用活性物质的生物合成路径相关基因研究有着重要意义。     

椪柑柠檬苦素-UDP-葡萄糖基转移酶基因的克隆、分析及表达

目的克隆中药橘核主要来源品种椪柑Citrus reticulata的柠檬苦素-UDP-葡萄糖基转移酶(limonoid-UDP-glucosyl transferase gene,LGT)基因,并进行生物信息学及表达分析为橘核有效成分合成及调控机制研究提供基础。方法克隆获得LGT序列,通过生物信息学对该基因蛋白的特征进行分析,构建LGT与相关物种LGT的系统进化树,利用RT-PCR分析橘皮、橘肉以及橘核中LGT基因表达量,并进行分析和比较。结果测序所得椪柑LGT序列全长为1 530 bp,具有1 509 bp的完整开放阅读框,编码502个氨基酸。并对其蛋白二级、三级结构进行了分析和预测。基因表达分析结果发现椪柑LGT基因在橘核中表达量最低,其次为橘皮,表达量最高为橘肉。结论成功克隆、分析并表达了椪柑LGT基因,为橘核中柠檬苦素类物质合成及调控机制研究提供基础。     

白芷香豆素储库型贴剂的研制及其体外评价

目的制备白芷香豆素储库型贴剂,考察其体外释药特性和离体皮肤渗透性,筛选有效的透皮吸收促进剂,提高白芷香豆素的透皮吸收速率。方法选取羟丙甲纤维素为储库介质,以乙烯-醋酸乙烯共聚物膜为控释膜,制备白芷香豆素储库型透皮贴剂。用Franz扩散池进行乳猪离体皮肤渗透实验,用HPLC测定欧前胡素量,考察凝胶用量、药物用量、促渗剂对药物透皮速率的影响,并对优选的贴剂进行体外释放研究。结果最佳处方为1%羟丙基甲基纤维素(HPMC)、1%白芷香豆素、3%肉豆蔻酸异丙酯、3%氮酮;由该处方制得的贴剂稳态透皮速率(Js)达到0.713μg/(cm2·h),体外释放速率接近零级。结论储库型白芷香豆素贴剂有较高的经皮渗透速率,体外释药完全,有望成为新型的透皮制剂。     

白花蛇舌草黄酮类成分大鼠在体肠吸收研究

目的考察白花蛇舌草醇提物中5种黄酮类成分在大鼠肠道的吸收特性。方法采用大鼠在体单向肠灌流模型,运用HPLC-DAD法测定肠灌流液中芦丁、异槲皮苷、槲皮苷、槲皮素和山柰酚,计算各黄酮类成分在大鼠小肠的吸收参数。结果白花蛇舌草黄酮类成分在大鼠肠道的有效渗透系数(Peff)均较小;白花蛇舌草总黄酮质量浓度为0.5~4.0 g/L时,吸收速率常数(Ka)、Peff值差异无显著性;在2.0 g/L下,芦丁、异槲皮苷、槲皮苷、槲皮素和山柰酚的Ka分别为0.011 3、0.015 4、0.010 2、0.030 5、0.027 5 min-1;芦丁和异槲皮苷在不同肠段的Ka顺序分别为回肠十二指肠空肠≈结肠,空肠十二指肠回肠≈结肠。结论白花蛇舌草中5种黄酮类成分吸收均呈一级动力学过程,提示为被动扩散吸收;各黄酮成分之间的吸收有差异性,黄酮苷类成分的Ka值小于黄酮苷元;各黄酮成分在不同肠段均有吸收,芦丁和异槲皮苷的最佳吸收部位分别为回肠和空肠。     

复方丹参双相胶囊体内外评价研究

目的 对比研究复方丹参双相胶囊(Fufang Danshen Biphasic Capsules,FDBC)与复方丹参胶囊(Fufang Danshen Capsules,FDC),证实复方丹参双相胶囊可降低冰片挥发损失且不会影响其他有效成分的体内外释药行为。方法 采用GC法测定FDBC与FDC处于高温、高湿、光照及加速实验条件后冰片的含量;以pH 1.2盐酸溶液、pH 4.5醋酸缓冲液、pH 6.8磷酸盐缓冲液和纯水为溶出介质,采用小杯法测定FDBC和FDC中丹参酮Ⅱ_A、丹酚酸B、三七皂苷R₁、人参皂苷Rg₁和人参皂苷Rb₁在不同时间点的累积溶出率,绘制溶出曲线;采用盐酸异丙肾上腺素(isoprenalinehydrochloride,ISO)制备大鼠急性心肌缺血模型,预防给药7 d后监测大鼠心电图ST段变化,HE染色观察心肌组织病理损伤,并利用试剂盒测定大鼠血清中肌酸激酶(creatine kinase,CK)、乳酸脱氢酶(lactic dehydrogenase,LDH)、心肌肌钙蛋白-T(c...     

大黄-黄芪组分自微乳的制备及在体肠吸收特性研究

目的 研究大黄-黄芪多组分自微乳的处方与制备工艺,评价制剂质量,并考察其大鼠肠吸收特性。方法 通过溶解度实验、油相与乳化剂和助乳化剂配伍实验及伪三元相图的绘制,筛选出最优处方组成;并从自微乳的外观、形态、粒径、稳定性等方面对自微乳进行评价。通过大鼠在体单向肠灌流实验考察自微乳的肠吸收特性。结果 自微乳处方中油相为辛酸癸酸单双甘油酯、乳化剂为聚氧乙烯蓖麻油35、助乳化剂为乙二醇。在微乳形成区选择各辅料用量,采用适宜方法加入大黄总蒽醌及黄芪总皂苷制得的组分自微乳,外观均一透明,加水分散后形成黄色乳光的微乳液,透射电镜显微镜（transmission electron microscopy,TEM）下观察到微乳分散均匀,无黏连,呈大小均一圆球形乳滴;平均粒径为（33.01±0.12）nm、多分散指数（polydispersion index,PDI）为0.10±0.02、电位为（-10.10±1.00）m V;自微乳中大黄总蒽醌和黄芪总皂苷质量分数分别为6.29、8.80 mg/g。自微乳中大黄总蒽醌在十二指肠、空肠段的吸收速率常数（Ka）及表观吸收系数（Papp）较回肠段均有显著提高;黄芪...     

苗药血人参提取物水凝胶的制备及促创面愈合体内外研究

目的 制备一种载苗药血人参Indigofera stachyodes提取物的聚乙烯醇（PVA）/木质素（Lig）/壳聚糖（CS）水凝胶并探究其促创面愈合机制。方法 在单因素考察的基础上,正交试验优选处方工艺并对其进行质量评价和体外生物评价,通过建立大鼠全层皮肤损伤模型,评价其促创愈合效果。结果 携载提取物的PVA/Lig/CS水凝胶的最优处方和制备工艺为PVA用量7.0 g、CS用量4.0 g、Lig用量0.5 g、冻融循环次数4次,每次冻结6 h。该凝胶具有多孔网状结构、良好的溶胀性、保湿性及一定的机械强度,同时具有良好的生物相容性、抑菌性以及有效抑制巨噬细胞细胞迁移,且抑制作用可能与时间呈正比。该水凝胶的体内药效学研究显示,其促创面愈合作用可能与减少创面组织炎性细胞浸润,促进巨噬细胞向M2型极化、增加毛血细管生成和纤维组织形成有关。结论 制备的载血人参提取物的PVA/Lig/CS水凝胶剂制备工艺简单、稳定可行、具有良好的缓释性能,且对全层皮肤损伤具较好的治疗效果。     

人参bZIP基因家族生物信息学分析

目的 通过人参bZIP基因家族生物信息学分析,为人参功能基因开发利用提供理论依据。方法 运用PlantTFDB数据库预测人参基因组中b ZIP基因;通过ExPASy网站得到人参bZIP基因家族信息和特征;使用MEME网站对PgbZIP基因家族保守基因序列进行分析;运用MEGA软件建立PgbZIP基因家族系统进化关系;利用TBtools软件进行PgbZIP表达分析。结果 人参基因组中含有157个bZIP基因家族成员,其中152个定位在细胞核,其余5个分别定位在叶绿体和内质网,相对分子质量在14 009.93～83 440.38,等电点在4.53～10.05,氨基酸数目在120～760 aa,除PgbZIP157以外,均为亲水蛋白。PgbZIP131在干旱胁迫下的表达量为83.47;PgbZIP99在根和盐胁迫条件下表达量均最高,分别为119.82和117.86;PgbZIP117在叶中表达量为48.54;花中PgbZIP106表达量最高为79.55;成熟果实中表达量最高是PgbZIP118,为119.32;PgbZIP101在未成熟果实中的表达量最高,且为65.32。结论 推测PgbZI...     

怀山药内生真菌厚孢镰刀菌的次生代谢产物研究

目的研究怀山药内生真菌厚孢镰刀菌Fusarium chlamydosporum的次生代谢产物。方法利用硅胶、凝胶等色谱技术进行分离纯化,通过波谱技术分析鉴定化合物结构。结果从厚孢镰刀菌的甲醇提取物中分离得到8个化合物,分别鉴定为过氧麦角甾醇(1)、麦角甾-4,22-二烯-3-酮(2)、邻苯二甲酸二丁酯(3)、邻苯二甲酸二异丁酯(4)、烟酸(5)、琥珀酸(6)、戊二酸(7)和Nb-乙酰基色胺(8)。结论所有化合物均为厚孢镰刀菌中首次分离得到。     

不同比例甘草配伍祖师麻抗大鼠佐剂性关节炎的实验研究

目的 观察不同比例甘草配伍祖师麻对大鼠佐剂性关节炎（AA）模型的治疗作用,筛选两者配伍比例,探讨其配伍意义。方法 采用足跖皮内注射弗氏完全佐剂制备AA模型,将140只模型大鼠随机分成14组：模型组,雷公藤多苷片组,祖师麻低、中、高剂量组,甘草低、中、高剂量组,祖师麻-甘草（3：1）低、中、高剂量组,祖师麻-甘草（3：2）低、中、高剂量组,另取10只正常大鼠为对照组,给药组大鼠造模前2 d开始ig给药,连续给药31 d,观察各组大鼠体质量变化,计算足肿胀度、关节炎指数（AI）,采用ELISA法检测大鼠血清炎症细胞因子肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白细胞介素-1β（IL-1β）的水平,观察大鼠膝关节组织病理变化,通过免疫组化法测定大鼠膝关节滑膜组织中血管内皮生长因子（VEGF）、巨噬细胞游走抑制因子（MIF）的表达。结果 与模型组比较,祖师麻组、祖师麻甘草配伍组能够明显抑制AA大鼠体质量减轻的趋势,对抗AA大鼠足肿胀度及AI的增加,降低异常升高的血清TNF-α、IL-1β水平,改善关节病理组织变化,减少滑膜组织VEGF、MIF的表达,其中以祖师麻-甘草（3：2）配伍组效果最优。结论 祖师麻甘草配伍后,对AA大鼠各项指标改善作用显著,作用优于单用祖师麻,其最佳配伍比例为祖师麻-甘草（3：2）。调节血清炎症细胞因子TNF-α、IL-1β及滑膜组织VEGF、MIF的表达,可能是祖师麻甘草配伍治疗类风湿性关节炎机制之一。