肾移植后诱导活化高表达CD25的CD4~+ CD25~(high)调节性T细胞的表型特点与免疫调节功能

目的 探讨肾移植受者活化并表达不同强度CD25的CD4细胞的表型特征和功能特点.方法依据CD25的表达水平,应用流式细胞仪将9例行初次亲属活体肾移植受者的外周血CD4~+ T细胞分为CD25~-、CD25高表达(CD25~(high))和CD25低表达(CD25~(low))3群,并比较3群细胞叉头翼状螺旋转录因子(FoxP3)、细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4(CTLA-4)表达强度.经免疫磁珠法和CD4~+ CD25~+调节性T细胞分选试剂盒分选得到受者外周血CD4~+ CD25~-、CD4~+ CD25~(high) T细胞,分别作为反应细胞,以Co~(60)γ射线照射灭活的供者外周血单个核细胞(PBMC)作为刺激细胞,建立体外单向混合淋巴细胞培养系统.采用半定量RT-PCR检测系统中IL-2 mRNA的表达.结果 在肾移植术后受者3群细胞中,FoxP3的表达以CD4~+ CD25~(high)细胞最高(93.7%±3.58%),其次是CD4~+CD25~(high)细胞(16.4%±6.8%),CD4~+ CD25~-细胞最低(1.8%±1.1%),三者间差异均有统计学意义(P<0.01);CTLA-4表达以CD4~- CD25~(high)细胞最高(80.8%±7.9%),其次是CD4~- CD25~(low)细胞(22.9%±6.5%),CD4~- CD25~-细胞最低(4.1%±2.4%),三者间差异均有统计学意义(P<0.01).在混合淋巴细胞培养中,CD4~- CD25~(high)细胞受移植抗原刺激后不表达IL-2 mRNA;按照1:2比例加入CD4~- CD25~(high)细胞后,CD4~-细胞表达的IL-2 mRNA平均被抑制了60%.结论 肾移植受者所有活化T细胞的表面均有CD25表达,高表达CD25的细胞群具有调节性T细胞的表型特点,为CD4~+ CD25~(high)曲调节性T细胞.     

调节性T细胞与器官移植免疫耐受的研究进展

CD4、CD25和叉头翼状螺旋转录因子(FoxP3)阳性(CD4~+ CD25~+FoxP3~+)的调节性T细胞(Treg)是具有免疫调节功能的T细胞亚群,在移植后诱导和维持免疫耐受方面发挥重要作用.在移植物发生排斥反应时,CD4~+ CD25~+ FoxP3~+ Treg的数量增加.因此可将其用于预测移植物的转归及判断移植受者的免疫状态.联合监测效应性T细胞(Teff)与Treg间的平衡有助于更好地判断移植受者的免疫状态.由于不同免疫抑制剂对CD4~+ CD25~+ FoxP3~+ Treg的影响不同,所以免疫抑制剂对诱导移植免疫耐受的潜在作用应引起重视.     

乙型肝炎患者外周血和肝组织FoxP3的检测及其意义

目的探讨乙型肝炎患者外周血和肝组织浸润淋巴细胞中FoxP3的表达及其意义。方法分别用流式细胞仪分析、时实定量RT-PCR和免疫组化法检测急性乙型肝炎(AHB)、慢性乙型肝炎(CHB)、慢性重症乙型肝炎(CSHB)和正常人(对照)的外周血和(或)肝组织中FoxP3的表达水平。结果FoxP3mRNA和蛋白均较特异地在CD4 CD25 调节性T细胞内表达,外周血CD4 T细胞的FoxP3mRNA表达水平与CD4 CD25 调节性T细胞频率检测结果一致。CSHB患者外周血CD4 T细胞FoxP3mRNA的相对表达值(0.199±0.174)显著高于AHB患者(0.053±0.017,P<0.05)、CHB患者(0.059±0.053,P<0.05)和正常人对照(0.056±0.021,P<0.05);CSHB患者肝组织浸润FoxP3 细胞数(32.4±13.5/lpf)显著高于CHB患者(10.0±8.6/lpf,P<0.01)和正常人对照(0.6±0.5/lpf,P<0.01),并在肝组织中伴有大量CD8 、CD4 细胞浸润。CHB患者肝组织浸润淋巴细胞中FoxP3 细胞和CD8 、CD4 T细胞的数量较正常人也有显著增高(P<0.05),但显著低于CSHB患者(P<0.01)。结论慢性乙型肝炎患者FoxP3的表达水平与病情轻重有关,肝组织浸润淋巴细胞中FoxP3 细胞增高可能是机体调节过度免疫反应的一种机制。     

抗CD25单克隆抗体对肾移植受者CD4~+ CD25~(high)调节性T细胞的影响

目的 评价抗CD25单克隆抗体对肾移植受者术后早期CD4~+ CD25~(high)调节性T细胞(CD4~+ CD25~(high)Treg)的影响.方法 2007年2-9月接受初次亲属活体供肾移植的受者41例,根据是否使用抗CD25单克隆抗体(商品名daclizumab)分为抗体组(21例)和对照组(20例).其中抗体组在肾移植术前2h及术后第14天分别给予抗CD25单抗各50mg.在移植前及移植后第13、17、60天分别留取肝素抗凝外周血15ml.应用流式细胞仪测定两组受者外周血CD4~+T细胞和CD4~+ CD25~(high)Treg比例的变化,半定量RTPCR检测CD25 mRNA的表达变化.结果 肾移植术后13、17、60d抗体组的CD25~+ T细胞占CD4~+ T细胞的比例(20%±8%、13%±7%、24%±9%)低于对照组(45%±6%、41%±5%、40%±6%),差异有统计学意义(P<0.05).抗体组术后第17天CD4~+ CD25~(high)Treg占CD4~+ T细胞的比例为4.40%±0.26%,明显低于对照组(8.56%±0.36%,P<0.01);而术后13、60d抗体组CD4~+ CD25~(high)Treg所占比例分别为7.00%±0.47%、3.75%±0.19%,与对照组(分别为8.04%±0.32%、3.66%±0.31%)比较差异无统计学意义(P>0.05).抗体组CD25 mRNA相对表达水平在给予第二次抗体前(术后第13天)为1.65±0.22,术后第17天为1.84±0.27,两者间差异无统计学意义(P>0.05).对照组术后第17天CD25 mRNA相对表达水平为1.70±0.23,与抗体组比较差异无统计学意义(P>0.05).结论 两剂共100mg抗CD25单抗仅一过性地降低CD4~+ CD25~(high)Treg,不会影响其活化扩增,无损于术后早期的免疫耐受诱导及维持.     

产后甲状腺炎妇女外周血调节性T细胞和辅助性T细胞表达水平分析

目的分析产后甲状腺炎(PPT)妇女外周血调节性T细胞和辅助性T细胞表达水平。方法连续选择2011年1月—2012年12月在我院门诊新确诊的PPT妇女(PPT组)31例,另有29例同期分娩未发生PPT的妇女为对照组。入选对象同期接受外周血调节性T细胞(CD4+CD25+Treg和CD4+CD25+Foxp3+Treg)和辅助性T细胞(CD+3、CD+4、CD+8、CD+4/CD+8)检测。结果 PPT妇女外周血CD8+表达水平明显低于对照组(P<0.01),而CD+4/CD+8比值明显高于对照组(P<0.05)。PPT妇女外周血CD4+CD25+Treg和CD4+CD25+Foxp3+Treg均明显低于对照组(P均<0.05~0.01)。结论PPT妇女存在明确的外周血调节性T细胞和辅助性T细胞异常表达。     

Nrp1~+T细胞对淋巴细胞增殖的调节作用以及对同种异体移植物的影响

目的 探讨表达神经纤毛蛋白质1(Nrp1)的T细胞(Nrp~+ T细胞)对体内外反应性淋巴细胞增殖的调节作用以及对同种异体移植物的影响.方法采用流式细胞术分选近交系C57BL/6j小鼠脾脏中的Nrp1~+ T细胞作为调节细胞,在刀豆蛋白A(Co-hA)的刺激下与标记了羧基荧光素乙酰乙酸(CFSE)的C57BL/6j小鼠脾脏单个核细胞等比例共培养5d,对比观察反应细胞的增殖情况.采用流式细胞术分选C57BL/6j小鼠脾脏的Nrp1~+T细胞、CD4~+ CD25~+ Treg细胞和CD4~+ CD25~- T细胞各1×10~6个,分别经尾静脉注入到以Balb/C小鼠作为供者,以C57BL/6j小鼠作为受者行皮肤移植的小鼠体内,另外建立供、受体均为C57BL/6j小鼠的同品系对照组(注入等体积的RPMI 1640培养基).对比观察各组移植皮肤的存活情况.结果 加入Nrp1~+ T细胞的实验组增殖指数为50.92%±2.30%,明显低于未加入调节性T细胞的对照组(90.31%±1.83%,P=0.0169).实验组移植皮肤存活时间注入Nrp1~+ T细胞者为20.66±1.1ld,注入Nrp1~- T细胞者为13.20±0.76d,注入CD4~+ CD25~+ Treg者为17.67±1.0d,均明显高于对照组(9.70±1.23d,P<0.01).结论 Nrp1作为一种新型的T细胞表面分子,在淋巴细胞增殖体系中起着重要作用;与注入CD4~+ CD25~+ Treg相比,注入Nrp1~+ T细胞可明显延长小鼠移植皮肤的存活时间.     

吞噬PUVA处理的同种异基因细胞的树突细胞对抗原特异性CD4+CD25+Foxp3+调节T细胞的体外诱导作用

目的探讨吞噬体外光化学法(PUVA)处理的同种异基因淋巴细胞的树突细胞(DC)对抗原特异性CD4+ CD25 +Foxp3+调节性T细胞的体外诱导作用。方法分离LEW大鼠骨髓细胞,经大鼠重组IL-4和GM-CSF共同诱导培养制备骨髓来源的LEW大鼠DC。分离DA大鼠脾淋巴细胞(SP),制备经PUVA处理的DA大鼠脾淋巴细胞(PUVA-SP)并用流式细胞仪检测其凋亡率。在体外将DA大鼠的PUVA-SP或SP与LEW大鼠骨髓来源的DC共同培养,得到PUVA-SPDC和SPDC,以Luminex液相芯片法检测PUVA-SPDC和SPDC培养上清中IL-10、IL-12的含量。以CFSE标记PUVA-SP,流式细胞仪检测LEW大鼠DC对DA大鼠PUVA-SP的摄取情况。将LEW大鼠CD4+25-T细胞与PUVA-SPDC或SPDC混合培养5d,流式细胞仪检测诱导形成的CD4+ CD25+ Foxp3+ T细胞,同时分离培养体系中的CD4+ CD25+ T细胞,通过混合淋巴细胞反应(MLR)检测PUVA-SPDC诱生的CD4+ CD25+ T细胞对LEW大鼠CD4+ CD25- T细胞(效应性T细胞)体外增殖的抑制作用...     

体外光化学疗法处理的调节性树突细胞对T细胞增殖的影响

目的 探讨体外光化学疗法处理的调节性树突细胞对T细胞增殖的影响.方法 获取人外周血单个核细胞(PBMC),利用白介素-4重组人粒细、巨噬细胞集落刺激因子诱导生成未成熟的树突细胞(imDC).分离获取人脾脏淋巴细胞(SP),经光化学疗法(PUVA)处理后获得PUVA-SP;将imDC与PUVA-SP共培养得到体外光化学治疗性树突细胞(ecpDC);将imDC与SP共培养得到SPDC;imDC加入10ng/ml的脂多糖(LPS),培养1d后得到DC.收集4组细胞,检测其表面抗体CD11c、CD83、CD86的表达.采用混合淋巴细胞培养的方法 检测吞噬了供者凋亡的脾淋巴细胞后的受者imDC对受者T细胞增殖的影响.结果 经PUVA处理后细胞早期凋亡率为91.33%.表面分子CD83、CD86在ecpDC的阳性表达率为分别为22.83%±5.26%、22.06%±4.37%,与在imDC的阳性表达率(分别为15.06%±0.59%、15.19%±1.83%)相近(P>0.05),但明显低于在DC的阳性表达率(分别为99.79%±0.36%、99.85%±0.19%),差异有统计学意义(P<0.01).吞噬了供者凋亡的脾淋巴细胞后的受者imDC细胞可明显抑制受者T细胞的增殖.结论 体外光化学疗法诱导的凋亡脾淋巴细胞可抑制树突细胞的成熟,并可抑制受者T淋巴细胞的增殖.     

进行期寻常型银屑病患者外周血CD4＋CD25＋调节性T细胞分析

目的 检测进行期寻常型银屑病患者外周血CD4+CD25+调节性T细胞(CD4+CD25+Treg)的水平. 方法 选择进行期寻常型银屑病住院患者56例和健康者16例,取外周抗凝全血,采用流式细胞术方法,检测外周血CD4+CD25+ Treg的水平,并统计和分析其特点和意义. 结果进行期寻常型银屑病患者外周血CD4+CD25+ Treg占CD4+淋巴细胞的比例为(2.65±0.73)%,健康对照组为(6.11±0.93)%.两组比较差异有统计学意义(P﹤0.001). 结论 CD4+CD25+ Treg水平降低可能与寻常型银屑病免疫学发病机制有关.     

辐射对肿瘤微环境中Treg细胞及其相关因子的影响

目的 检测照射后与肺腺癌A549细胞共培养的淋巴细胞中调节性T细胞(Treg细胞)及其相关细胞因子和共刺激分子表达的变化,探讨辐射对肿瘤微环境中免疫耐受机制的影响.方法 分离人外周血淋巴细胞单独培养或与肺腺癌A549细胞进行共培养一段时间后,以6 Gy X射线进行照射,继续共培养一段时间后,以流式细胞术检测淋巴细胞中CD4+CD25+、CD4+CD25+FoxP3⁺、CD4+CD25+NrP1⁺不同亚组的百分数、共刺激分子ICOS和CTLA-4的表达情况;ELISA法检测培养体系上清中IL-10、TGF-β、IL-17的分泌量.结果 与照射前后单独培养组相比,相应条件下共培养组中CD4+CD25+、CD4+CD25+FoxP3⁺、CD4+CD25+NrP1⁺、ICOS、CTLA-4、IL-10和TGF-β比例均增加(t=2.78~40.61,P<0.05).而与照射前相比,照射后单独培养组和共培养组的CD4+CD25+和CTLA-4比例增加(t=2.96、2.94、4.47、2.77,P<0.05).细胞因子IL-17的表达量在肺腺癌A549细胞和X射线分别作用下无明显变化,但共同作用后会明显增加(t=4.00、4.71,P<0.05).结论 辐射刺激肺癌细胞肿瘤微环境中的CD4+CD25+Treg细胞亚组及其相关CTLA-4和IL-17的表达,诱导肿瘤微环境中的免疫耐受作用.     

自体外周血干细胞动员时骨髓及外周血相关细胞亚群的动态变化研究

目的：探讨自体外周血干细胞动员时，恶性血液病患者的骨髓及外周血CD34^＋和T细胞亚群的动态变化特点。方法：16例拟行自体外周血干细胞移植患者，在应用化疗＋G—CSF方法动员外周血干细胞期间，以流式细胞仪测定骨髓及外周血CD34^＋和T细胞亚群动态变化情况。结果：化疗后应用G—CSF48h后，骨髓中CD34^＋细胞开始明显增加（P〈0．01），在应用G—CSF72h后，外周血中CD34^＋细胞开始明显增加（P〈0．01），96h后，两者达峰值。较未应用G—CSF时差异显著（P〈0．01）。T淋巴细胞亚群比例处于倒置状态且变化不明显（P〉0．05）。结论：恶性血液病患者在应用化疔＋G—CSF方法动员外周血干细胞时，其骨髓及外周血CD34^＋细胞逐渐增加，于96h后达高峰，T细胞亚群变化不明显。     

延迟复苏对40%血容量失血犬外周血淋巴细胞功能影响的初步研究

目的观察延迟复苏对犬40%血容量失血后淋巴细胞免疫功能的影响。方法雄性Beagle犬8只,按全身血容量的40%半小时放血完毕。伤后24 h开始液体复苏,伤后第二个24 h按失血量的3倍给予乳酸林格液,48h后给予生理需要量。记录动物72 h死亡率,采集伤前及伤后1、4、24、48、72 h的外周静脉血,检测T淋巴细胞凋亡率、增殖能力、CD3+/CD4+和CD3+/CD8+T淋巴细胞的百分率,并计算其比值。结果与伤前比较,失血性休克后1、4、24、48、72 h各点T淋巴细胞凋亡率均较伤前显著降低(均P<0.05);伤后24 h和72 h淋巴细胞增殖能力较伤前降低,但24 h和72 h之间无显著差异。伤后CD4+T细胞比例无显著变化,CD8+T细胞比例较伤前显著增加。CD4+/CD8+T淋巴细胞比例于伤后1 h开始下降,伤后4、24、48、72 h均比伤前显著降低(P<0.05);但复苏前后无显著差别。结论犬40%血容量失血导致淋巴细胞免疫功能持续抑制,延迟复苏并不能有效改善免疫功能。     

受者同系骨髓间充质干细胞对心脏移植大鼠的免疫调节作用

目的 观察静脉注射受者同系骨髓间充质干细胞(MSC)对大鼠心脏移植免疫反应的影响.方法 以20只成年雄性Lewis大鼠作为心脏供体,20只成年雄性Wistar大鼠作为受体,将其随机分为2组,每组10只,行颈部心脏移植:对照组(A组)手术后24h,经尾静脉注射3ml 0.9％氯化钠注射液;MSC处理组(B组)手术后24h,经尾静脉注射2×106个MSC(悬浮于3ml 0.9％氯化钠注射液中).术后1周,每组随机取受体大鼠4只,检测静脉血及移植物CD4+、CD8+、CD4+CD25high、CD4+CD25highfoxp3+T细胞占总淋巴细胞的比例,计算CD4+/CD8+比值.其余6只大鼠用于继续观察移植物存活时间.结果 A组大鼠移植心脏存活7.2±1.3d,B组大鼠移植心脏存活14.8±2.9d,两组间差异有统计学意义(P＜0.01).B组静脉血中CD4+/CD8+值、CD4+CD25highT细胞占总淋巴细胞的比例、CD4+CD25highFoxp3+T细胞占总淋巴细胞的比例(分别为1.18±0.07、2.51％±0.56％、2.05％±0.62％)均明显高于A组(分别为0.49±0.05、0.96％±0.19％、0.82％±0.09％),差异有统计学意义(P＜0.01).移植心脏中CD4+/CD8+值在两组间无统计学差异(P＞0.05);B组移植心脏中CD4+CD25highT细胞及CD4+CD25highFoxp3+T细胞占总淋巴细胞的比例(分别为2.74％±0.28％、2.54％±0.31％)均明显高于A组(分别为0.61％±0.06％、0.53％±0.06％),差异有统计学意义(P＜0.01).结论 静脉注射受者同系骨髓MSC可诱导大鼠心脏移植免疫耐受,延长移植心脏的存活时间.     

Alveolitis in patients with sarcoidosis]

In 20 patients with pulmonary sarcoidosis bronchoalveolar lavage (BAL) was performed. The cellular content was analysed and lymphocyte subpopulation was determined using monoclonal antibodies. The patients with more than 28% of BAL T lymphocytes are classified as patients with high intensity alveolitis (n = 8) and those with less than 28% of T lymphocytes as low intensity alveolitis (n = 12). Of the total number of BAL T lymphocytes in high intensity alveolitis CD 3+ T cells were 88.8 +/- 8.4% and in low intensity alveolitis 68.2 +/- 13.8% (p < 0.001). In high intensity alveolitis the number of CD 4+ T cells was increased and the number of CD 8+ T cells was decreased which caused the increased index CD 4:CD 8; 9.8 +/- 8.7. In low intensity alveolitis this ratio was 2.2 +/- 1.2. Effects of smoking were also analysed. In smokers the total number of BAL cells was higher 184.0 +/- 47.2 x 10(4) ml of BAL, and in nonsmokers 101.3 +/- 65.1 x 10(4) ml of BAL (p < 0.001). Smoking has no effects on the characteristics of the cellular elements and subpopulation of BAL lymphocytes in patients with sarcoidosis. In 7 patients T lymphocyte subpopulation in the peripheral blood were determined too. Patients with high intensity alveolitis had the increased index CD 4:CD 8 in the peripheral blood compared with low intensity alveolitis.     

自身免疫相关疾病患者外周血淋巴细胞亚群检测及其意义

目的探讨自身免疫相关疾病患者淋巴细胞亚群的变化特点。方法采用流式细胞术检测23例自身免疫病患者及20例正常人的外周血中T淋巴细胞（CD3＋细胞）、辅助性T细胞（CD4＋细胞）、T抑制性细胞毒细胞（CD3＋/CD8＋）、NK细胞（CD3-/CD16＋56）和NKT细胞（CD3＋/CD16＋56）,对两者百分比进行比较分析。结果患者组中T抑制性细胞毒细胞（CD3＋/CD8＋）的百分比和绝对值高于正常对照组（P〈0.05）。而患者组中CD4/CD8数值上低于正常对照组,但无明显差异。NK细胞（CD3-/CD16＋56）的百分比和绝对值明显低于对照（P〈0.01）,有显著统计学差异。结论可通过对淋巴细胞亚群的检测了解自身免疫病在其发生发展的过程中免疫系统的变化,并为采用的相关治疗提供依据。     

部分藏、回、汉族献血员HCV感染的T细胞亚群变化在肝损伤中的作用

目的 :通过对HCV感染者临床资料分析、病理检查和T淋巴细胞亚群检测 ,探讨机体免疫功能在丙型肝炎发病中的作用。方法 :收集 88例各民族献血员HCV感染者的临床资料 ,6例病情严重者作肝组织活体穿刺。采用流式细胞术检测T淋巴细胞亚群 (CD3+ 、CD4 + 、CD8+ 、CD4 + /CD8+ )的改变 ,另以 5 9例为正常对照组。结果 :各民族职业献血员感染HCV后均出现不同程度症状。病变肝组织坏死 ,CD4 + 细胞百分率下降 ,CD8+ 细胞百分率升高 ,与对照组比较 ,有显著性差异 (P <0 .0 5 )。各民族间无显著性差异 (P >0 .0 5 )。结论 :各民族献血员HCV感染者T细胞亚群发生调节适应性变化 ,造成肝组织损伤。