姜黄素对人正常肝细胞角蛋白1和内质网蛋白19表达的影响

目的应用双向凝胶电泳、质谱技术和蛋白免疫印迹研究姜黄素(Curcumin,CUR)对人正常肝细胞蛋白质组的影响。方法随机将人正常肝细胞L-02分成两组,对照组不作任何处理,姜黄素组以25μmol.L-1姜黄素处理L-02细胞24 h。用双向凝胶电泳建立姜黄素组和对照组的双向凝胶电泳图谱,并用Image Master 2D Platinum 6.0软件进行差异蛋白质组分析,所获得的明显差异蛋白质用MALDI-TOF-MS进行鉴定分析,最后用蛋白免疫印迹法进行验证。结果姜黄素作用于人正常肝细胞后,有2个蛋白质的表达发生明显变化,角蛋白1与内质网蛋白19表达均上调。结论上调角蛋白1和内质网蛋白19可能是姜黄素抗肿瘤、抗氧化作用的机制之一。     

重组hFGF-10腺病毒对HaCat细胞影响的蛋白质组学研究

研究重组腺病毒导入人成纤维细胞生长因子10 (hFGF-10) 对HaCat细胞蛋白质组的影响, 由鉴定的差异蛋白质推测hFGF-10对HaCat细胞作用的可能机制。采用双向凝胶电泳结合串联飞行时间质谱技术, 对空载体腺病毒Ad感染细胞和重组腺病毒rAd-hFGF-10感染细胞的总蛋白图谱上的差异蛋白点进行鉴定, 并通过半定量RT-PCR和Western blotting在转录和翻译水平对差异蛋白进行确证。结果显示, 获得了蛋白质分离效果较好的双向凝胶电泳图谱, 鉴定了4种与细胞凋亡、细胞骨架调控、蛋白质降解等相关的差异蛋白质, 并在转录和翻译水平确证了差异蛋白质VDAC2在导入目的基因hFGF-10的HaCat细胞中表达上调, 提示VDAC2可能在hFGF-10的生物学功能中发挥作用。     

膀胱癌BIU-87细胞羟基喜树碱耐药的蛋白质组学研究

目的研究与膀胱癌BIU-87细胞羟基喜树碱（HCPT）耐药相关的蛋白质。方法应用二维凝胶电泳（two-dimensionalelectrophoresis，2-DE）和基质辅助激光解吸电离一串行飞行时间质谱（matrix-assistedlaserdesorption-ionizationtimeofflighttandemmassspectrometry，MALDI-TOF-TOF）寻找羟基喜树碱耐药的膀胱癌BIU-87细胞与非耐药细胞的差异表达蛋白质。结果通过对2组细胞总蛋白质二维凝胶电脉图谱进行分析，找到差异蛋白质点12个；通过质谱分析，12个蛋白质均得到鉴定。这些蛋白质包括热休克蛋白27、细胞角蛋白8、nm23蛋白等。结论通过蛋白质组学技术，发现了膀胱癌羟基喜树碱耐药细胞和非耐药细胞之间差异表达蛋白质12个，这些差异蛋白质可能参与膀胱癌细胞羟基喜树碱耐药的过程。     

双向凝胶电泳分析糖尿病大鼠肝脏蛋白质表达

目的用双向凝胶电泳分析糖尿病大鼠肝脏蛋白质表达,探讨糖尿病引起肝脏生物化学改变的机制。方法采用链脲佐菌素(STZ)诱发Wistar大鼠产生高血糖,建立1型糖尿病大鼠模型。用固相pH梯度双向凝胶电泳(2D-PAGE)分离糖尿病大鼠与正常肝脏的蛋白质表达图谱。考马斯亮蓝染色凝胶后,用Image Master2D Platinum软件进行图像分析。结果图像分析测得2块胶的匹配率达66%,在等电点pH3~10、分子量14.0~75.4kD范围内分离得糖尿病大鼠肝脏的蛋白点大约950个,正常大鼠的蛋白点大约1069个,其中至少51个蛋白点在两种肝脏间有2倍以上量变。结论糖尿病引起肝脏蛋白质表达发生变化,糖尿病大鼠肝脏蛋白质表达的研究有助于探讨糖尿病并发症的发生机制。     

三氯乙烯诱导人L-02肝细胞适应性反应的差异蛋白质组学分析

目的研究三氯乙烯(TCE)诱导L-02肝细胞的适应性反应及蛋白质表达改变。方法利用噻唑蓝(MTT)比色法,以0.5%二甲基亚砜(DMSO)作为溶剂对照组,确定对细胞增殖无明显作用的1μmo.lL-1TCE作为TCE诱导L-02肝细胞适应性反应的预刺激浓度,预刺激时间12 h,预刺激后再刺激浓度(适应组)为30μmo.lL-1TCE,刺激时间24 h。然后选取0,1,30和1+30μmo.lL-1TCE(1μmo.lL-1TCE预刺激12 h后,再次接受30μmo.lL-1TCE刺激24 h)4组平行进行双向凝胶电泳分离细胞总蛋白,银染显色,图像分析后,挑选差异蛋白进行基质辅助激光解吸电离飞行时间串联质谱鉴定。结果1μmo.lL-1TCE预刺激L-02肝细胞后,能降低30μmo.lL-1TCE攻击产生的细胞毒性。与单独用30μmo.lL-1TCE攻击相比,细胞增殖能力增加明显,细胞死亡减少。分析比较4组二维电泳图谱,发现15个蛋白质斑点表达发生改变,对其中5个差异较明显的蛋白点进行质谱分析鉴定,分别为Ku 86自体抗原相关蛋白1、透明质酸蛋白(hyaluronan)介导细胞运动受体、谷胱甘肽转移酶ω1、白细胞弹性蛋白酶抑制剂和空泡ATP合酶亚单位B。结论TCE可诱导L-02肝细胞产生适应性反应,引起L-02肝细胞蛋白表达改变,差异蛋白大多参与机体保护。     

商陆皂苷甲作用于子宫内膜异位症大鼠腹腔巨噬细胞蛋白质组的差异分析

目的研究商陆皂苷甲作用于子宫内膜异位症大鼠腹腔巨噬细胞蛋白质组的差异,鉴定差异表达的蛋白质。方法采用自体移植法建立子宫内膜异位症大鼠模型。造模成功后取腹腔巨噬细胞,商陆皂苷甲作用24 h后,采用双向凝胶电泳技术分离巨噬细胞总蛋白,并获得药物组、模型组和空白对照组蛋白质组图谱,PDQuest软件分析确认三组细胞的差异蛋白质,最后运用串联飞行时间质谱（MALDI-TOF-TOF MS）鉴定差异蛋白点。结果 M2型丙酮酸激酶、磷酸酰肌醇转移蛋白和热休克蛋白8在子宫内膜异位症大鼠腹腔巨噬细胞中高表达,而磷酸甘油醛脱氢酶表达减少。商陆皂苷甲能抑制造模引起的M2型丙酮酸激酶等四种蛋白的表达变化。结论利用蛋白质组学技术,研究商陆皂苷甲作用于子宫内膜异位症大鼠腹腔巨噬细胞后蛋白表达差异,为探索子宫内膜异位症的发病机制和商陆皂苷甲的作用机制提供新的线索和依据。     

蜕皮甾酮对胰岛素抵抗HepG_2细胞的蛋白质组学研究

目的用比较蛋白质组学策略筛选蜕皮甾酮干预胰岛素抵抗HepG2细胞前后的差异表达蛋白,为寻找胰岛素增敏药物作用靶点提供新的实验依据。方法将HepG2细胞置于5×10-7mol.L-1胰岛素培养液中诱导16h,观察高胰岛素对HepG2细胞葡萄糖消耗量的影响,确定模型建立后,加入含蜕皮甾酮10-5mol.L-1培养液继续孵育24h,继续观察蜕皮甾酮对胰岛素抵抗模型细胞葡萄糖消耗量的影响;并用裂解液提取干预前后细胞的蛋白质,以双向电泳技术对干预前后差异表达蛋白进行筛选,差异表达蛋白再经MAL-DI-TOF-MS质谱分析,MS-Fit数据库鉴定。结果与模型组比较,蜕皮甾酮干预组找到53个差异蛋白点,其中35个蛋白点表达上调,18个蛋白点表达下调,鉴定了其中6个蛋白。结论蜕皮甾酮胰岛素增敏作用靶点涉及多种与胰岛素抵抗相关的蛋白质和激酶,为后续靶蛋白的筛选及其功能研究奠定了基础。     

Protein expressions in macrophage-derived foam cells：comparative analysis by two-dimensional gel electrophoresis

目的:研究氧化低密度脂蛋白诱导的U937泡沫细胞中蛋白质组的差异表达。方法:泡沫细胞模型由人类单核细胞系白血病U937细胞经氧化低密度脂蛋白诱导而成,将对照U937细胞与U937泡沫细胞的蛋白提取物分别进行双向凝胶电泳(2-DE)分离,凝胶经银染后,于PDquest 2-DE图像分析软件中进行图像处理,利用ExPASy蛋白质组学网站中U937细胞的蛋白表达谱信息,对所得的U937泡沫细胞2-DE图谱作进一步鉴定。结果:通过对2-DE蛋白图谱的分析,共150点与参考胶相匹配(匹配率:75％),与U937细胞图谱相比,泡沫细胞中有37个蛋白点表达量有显著性变化(P<0.05),与对照U937细胞相比,在U937泡沫细胞中28个蛋白点表达量上调,9个点表达量下调,其中,8个U937细胞中表达的蛋白点,在U937泡沫细胞中未检测到;而11个在泡沫细胞中表达的蛋白点,未在对照U937细胞中表达。结论:本研究首次建立经氧化低密度脂蛋白诱导的U937泡沫细胞的蛋白差异表达谱,从而提供了对动脉粥样硬化病理过程中巨噬源性泡沫细胞功能性分析研究的新思路。     

甲基苯丙胺对体外培养SH-SY5Y细胞线粒体膜电位、超微结构及Mfn1、Fis1蛋白表达的影响

目的评估甲基苯丙胺(METH)对体外培养的SHSY5Y细胞线粒体膜电位(MMP)、线粒体超微结构及Mfn1、Fis1蛋白表达的影响。方法 SH-SY5Y细胞中加入METH(0. 0、1. 0、1. 5、2. 0 mmol·L~(-1)),培养3、6、12、24 h; JC~(-1)法检测SH-SY5Y细胞MMP;透射电镜观察SH-SY5Y细胞线粒体超微结构; Western blot检测Mfn1、Fis1蛋白表达。结果METH作用SH-SY5Y细胞3、6、12、24 h,与对照组比较,METH组细胞MMP红绿荧光比值明显降低(P <0. 05),Mfn1蛋白表达降低(P <0. 05),Fis1蛋白表达升高(P <0. 05); METH作用SH-SY5Y细胞24 h时,透射电镜观察见未处理组细胞线粒体呈椭圆形棒状双层膜结构,线粒体嵴正常、清晰,METH组细胞线粒体椭圆形棒状结构被分裂成小球状结构,并发现线粒体自噬小体及自噬溶酶体。结论METH可引起SH-SY5Y细胞MMP下降、线粒体超微结构改变及Mfn1、Fis1蛋白表达水平改变,其改变可能参与METH致神经细胞损伤的发病机制。     

心肾综合征阳虚水泛证与气虚血瘀证患者血清蛋白质组学研究

目的 建立心肾综合征(CRS)阳虚水泛证、CRS气虚血瘀证及健康对照的血清蛋白质组表达图谱,初步鉴定其差异表达的蛋白质.方法 选择CRS患者35例,其中阳虚水泛证组20例;气虚血瘀证组15例.另选健康者12例作为对照.各组血清去除白蛋白,测定血清蛋白浓度.以双向凝胶电泳分离各组血清蛋白质,考马斯亮蓝染色,扫描凝胶成像后,用PDQuest软件对各组血清蛋白质组表达图谱进行差异分析,选定差异点进行基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(Matrix-assisteD Laser DesorptioN/ioNizatioN-Time of Flight-Mass SpeCtrometry,MALDI-TOF-MS)分析,MasCot软件搜索MSDB和SWISS-PROT数据库鉴定蛋白质.结果 初步建立CRS阳虚水泛证、CRS气虚血瘀证及健康对照组3组血清蛋白质表达图谱,分别获得蛋白质点95、87 和79 个;13 个蛋白质点在3 组血清中呈现差异表达;初步鉴定其中的11 个蛋白质分别为:生长分化因子15 前体、N 末端B 型钠尿肽、高敏C 反应蛋白、半乳凝素3、肾损伤分子-1、白细胞介素-18、促肾上腺髓质素、髓过氧化物酶、胱抑素C、脂联素、骨保护素.结论 得到鉴定的11 个蛋白质可能与心肾综合征阳虚水泛证、CRS 气虚血瘀证发生发展密切相关,但其具体机制有待进一步研 究.     

Proteome studies on liver tissue in a phenobarbital-induced rat model

Many drugs may affect the activity of cytochrome P450 (CYP), which is a major source of adverse drug interactions (ADR). Phenobarbital (PB) is the typical inducer of cytochrome P450. The aim of our study was to determine the changes in the cytosolic proteins expression in rat liver at a protein level following induction of cytochrome P450. Firstly, we made a phenobarbital-induced cytochrome P450 rat model. The total cytosolic proteins were then extracted from rat liver tissue and separated by 2-D gel electrophoresis (2-DE). Differentially expressed spots were identified by MALDI-TOF/TOF tandem mass spectrometry followed by database searching. Eight differentially expressed proteins were identified and these proteins were found to be involved in protein degradation, oxidative stress, energy metabolism, biotransformation, and the synthesis of quinolinic acid (QUIN). These findings should provide useful information for research into the regulation of cytochrome P450 gene expression, drug metabolism and drug interaction.     

Tubuloside B from Cistanche salsa rescues the PC12 neuronal cells from 1-methyl-4-phenylpyridinium ion-induced apoptosis and oxidative stress

The neuroprotective effects of tubuloside B, one of the phenylethanoids isolated from the Chinese herbal medicine Cistanche salsa, on 1-methyl-4-phenylpyridinium ion (MPP +)-induced apoptosis and oxidative stress in PC12 neuronal cells were investigated. PC12 cells treated with MPP + underwent apoptotic death as determined by MTT assay, flow cytometry and DNA agarose gel electrophoresis; intracellular accumulation of reactive oxygen species (ROS) was measured by DCFH-DA staining with laser scanning confocal microscopy (LSCM). Simultaneous treatment with tubuloside B markedly attenuated MPP +-induced cytotoxicity, DNA fragmentation, and intracellular accumulation of ROS. These results strongly indicate that tubuloside B prevents MPP +-induced apoptosis and oxidative stress. Tubuloside B may be applied as an antiparkinsonian agent.     

Toxicity and differential protein analysis following destruxin A treatment of Spodoptera litura (Lepidoptera: Noctuidae) SL-1 cells

The cytotoxicity of a destruxin A (DA) treatment of Spodoptera litura SL-1 cells was investigated. An MTT assay showed that DA was highly toxic to SL-1 cells in a concentration- and time-dependent manner. The IC₅₀ values of DA, after 24 h and 48 h of treatment, were 17.86 μg/mL and 7.80 μg/mL, respectively. Under inverted phase contrast microscopy (IPCM), it was found that prolonged treatment with DA could induce cell rounding, cellular membrane shrinking, formation of apoptotic bodies, vacuole appearance and cytoplasm leak out. Apoptosis induced by DA was further confirmed by fluorescence microscopy (FM) and flow cytometry (FCM) studies. SL-1 cells entered early apoptosis following a treatment with 2.5 μg/mL DA and entered late apoptosis following a treatment with increasing concentrations of DA. Furthermore, two-dimensional gel electrophoresis (2-DE) analysis was used to identify 22 proteins which were differentially expressed (≥2-fold difference) between control cells and DA-treated cells, and the expression level of these proteins was significantly different between the treated and untreated cells. Our results suggest that these differentially expressed proteins may help explain the diverse biological effects caused by the destruxin A treatment of cells; additionally, some of the identified proteins may have roles in SL-1 cellular proliferation and apoptosis.     

Ⅰ期非小细胞肺癌相关血清差异表达蛋白的研究

目的:寻找Ⅰ期非小细胞肺癌(NSCLC)与健康人血清的差异表达蛋白.方法:收集天津市胸科医院经手术、病理证实的6例Ⅰ期NSCLC患者血清,等量混合后设为肺癌组;同期15例健康体检血清,等量混合后设为健康对照组.利用双向凝胶电泳(2-DE)和基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)分离、筛选和鉴定2组间的差异表达蛋白.结果:成功获得了2组的双向凝胶电泳图谱,PDquest软件分析显示,2组间差异大于2倍的蛋白质点共有128个,质谱鉴定后确定了10种蛋白质,其中7种表达量上调,分别为α1-酸性糖蛋白、C1酯酶抑制物、血管紧张素原、转铁蛋白、转甲状腺素蛋白、间-α-胰蛋白酶抑制剂重链H2及无花果酶-3;3种表达量下调,分别为纤连蛋白、补体C4-A及补体C3.结论:应用2-DE及MALDI-TOF-MS在Ⅰ期NSCLC血清中鉴定出4种与肿瘤关系密切的差异表达蛋白,可作为开发NSCLC早期诊断标志物的候选蛋白.     

ONO-AE-248诱发中性粒细胞非凋亡性程序化死亡的蛋白质组学分析方法的建立

目的:建立双向电泳技术和质谱技术在探索ONO-AE-248诱发的中性粒细胞(neutrophil,PMN)非凋亡性程序化死亡的分子机理研究中的应用,为深入认识“非凋亡性程序化死亡“这种新的死亡方式提供新的有效的研究途径.方法:将采用梯度离心法分离的,人正常PMN,分为正常对照组和实验组,实验组用ONO-AE-248刺激12小时建立非凋亡性坏死模型,提取对照组和实验组全蛋白,双向电泳分离蛋白质,采用PDQuest 2-DE软件分析找出两组间差异表达的蛋白质斑点,用基质辅助激光解吸电离飞行时间串联质谱(MALDI-TOF-MS)进行鉴定.结果:双向电泳图谱显示:ONO-AE-248诱导的人PMN非凋亡性程序化细胞死亡与PMN的自发性凋亡的蛋白质组存在差异显著,质谱鉴定初步得到其中12种差异表达的蛋白质.结论:双向电泳和质谱鉴定技术可以有效的分离和分析ONO-AE-248诱发的PMN非凋亡性坏死的蛋白质组,为进一步探索“非凋亡性程序化死亡“方式提供了新的方法和途径,为丰富细胞死亡方式带来了新的前景.     

相思豆毒素中毒小鼠分子毒理的肝脏蛋白质组学研究

目的 利用蛋白质组学技术研究相思豆毒素中毒小鼠肝脏差异表达蛋白.方法 采用二维凝胶电泳分离肝脏蛋白样品,以飞行时间质谱、生物信息学分析等方法鉴定各差异表达蛋白.结果 小鼠相思豆毒素中毒后共鉴定出11个明显变化的肝脏差异表达蛋白,其中6个蛋白表达明显上调,分别为半胱氨酸蛋白酶-3、G-蛋白β亚基、乙酰辅酶A脱氢酶、胞浆天冬氨酸氨基转移酶、核转录因子抑制剂IKK-A及p53-结合蛋白Mdm4;表达明显下调的5个蛋白分别是H＋-三磷酸腺苷（H＋-ATP）合酶、微粒体核糖体蛋白L39、细胞核酸结合样蛋白、成纤维细胞生长因子-12及硫代硫酸硫转移酶.结论 小鼠相思豆毒素中毒后,发生变化的肝脏蛋白多数为具有凋亡诱导、能量代谢、增殖和分化等作用的功能性蛋白,其分子毒理涉及复杂的网络信号传导机制.     

Genomic and proteomic analyses of 1,3-dinitrobenzene-induced testicular toxicity in Sprague–Dawley rats

1,3-Dinitrobenzene (DNB) is an industrial intermediate and testicular toxicant that has been shown to target Sertoli cells. The mechanism of action of DNB in the testis, however, is unclear. To investigate global alterations in gene or protein expression during testicular toxicity, testes from rats treated orally with DNB were subjected to microarray and two-dimensional gel electrophoresis (2-DE) analyses. Histopathological abnormalities were detected in the testes of the DNB-treated rats. Microarray analysis revealed that, during early testicular toxicity, several genes involved in apoptosis, germ cell/Sertoli cell junction, and tight junction signaling pathways were differentially expressed. Based on 2-DE analysis, 36 protein spots showing significantly different expression during early testicular toxicity were selected and identified. Network analysis of the identified proteins revealed that these proteins are associated with cellular development or reproductive system diseases. Collectively, these data will help clarify the molecular mechanism underlying testicular toxicity in DNB-exposed rats.     

鼻咽癌血清蛋白质双向电泳图谱分析

目的:探讨和分析鼻咽癌(NPC)差异表达的血清蛋白质。方法:以NPC和正常血清标本为研究对象,利用双向电泳(2-DE)分离NPC和正常血清蛋白质,银染显色,Umax扫描仪获取图像,Melanie4软件分析图像,寻找鼻咽癌相关差异蛋白质。结果:建立了较稳定的NPC和正常血清蛋白质2-DE图谱,平均蛋白质点数约400个。软件分析显示2组共有11个差异蛋白质点,10个仅在NPC血清中出现,1个仅在正常血清中出现。结论:差异蛋白质的分离为NPC的相关血清蛋白质的鉴定和其他肿瘤血清蛋白质组学研究奠定了基础。     

吗啡成瘾和正常大鼠的前额叶皮质表达蛋白质组变化的初步研究

目的建立和比较吗啡成瘾与正常大鼠前额叶皮质(PFC)蛋白质双向电泳图谱,寻找和鉴定吗啡成瘾大鼠PFC中的差异蛋白表达谱。方法以固相pH梯度等电聚焦为第一向和垂直SDS-PAGE为第二向,分别对正常对照大鼠和吗啡成瘾大鼠的PFC蛋白质样品进行二维分离,2-DE图谱经ImageMaster 2D Platinumv5.0软件分析,选取4个差异蛋白点用基质辅助激光解吸附离子化飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)进行鉴定。结果通过对2-DE图谱蛋白斑点的匹配及对比分析,与吗啡成瘾相关的差异表达蛋白斑点为87个;经质谱鉴定出2个有意义的差异表达的蛋白斑点:Snap25亚型β-Snap25突触相关蛋白25、β-肌动蛋白。结论吗啡成瘾组与正常对照组大鼠PFC蛋白表达存在差异;初步鉴定了大鼠前额叶皮质中与吗啡成瘾相关的差异蛋白,其表达的变化可能通过多种途经影响PFC神经元功能,为我们研究阿片类物质依赖作用机制提出了新的思路和方向。