ptges3a基因在斑马鱼早期胚胎发育过程中的表达

目的克隆斑马鱼前列腺素E合酶3a(prostaglandin E synthase 3a,ptges3a)基因,研究其在斑马鱼胚胎早期发育中的表达情况。方法提取斑马鱼胚胎的总RNA,制备DIG标记的ptges3a RNA反义探针,整胚原位杂交研究ptges3a在斑马鱼胚胎早期发育过程的表达。结果 ptges3a在shield期前普遍性表达,10体节期在后脑神经龙骨处有特异性表达,18体节期在后脑有特异性表达,在26 hpf时期头部表达较多,并且在肾小管有特异性表达,36 hpf ptges3a在头部较高表达。结论 ptges3a可能参与了脑部发育和肾小管形成。     

Nodal信号通路相关基因NOMO1在斑马鱼早期胚胎发育过程中的表达

目的:研究斑马鱼NOMO1基因在早期胚胎发育过程中的时空表达情况?方法:首先克隆斑马鱼NOMO1同源基因全长cDNA,然后运用半定量RT－PCR技术初步检测NOMO1基因在斑马鱼早期胚胎的表达情况,最后通过原位杂交技术检测NOMO1基因在斑马鱼早期胚胎发育过程中的时空表达情况?结果:通过半定量RT－PCR及原位杂交技术显示NOMO1从受精卵时期开始即有表达,在24 hpf(受精后24 h)之前,NOMO1基因表达广泛,并主要集中在中?内胚层?从24 hpf开始其表达主要集中于神经系统如前脑?中脑?小脑?脊索前板?眼和耳囊等处?在心脏处也有少量表达?结论:NOMO1基因对斑马鱼早期胚胎发育具有一定的作用,推测NOMO1基因影响早期心脏发育?     

Rap1基因在斑马鱼胚胎早期发育过程中的时空表达谱研究

目的：选择斑马鱼作为实验动物模型,研究Rap1基因在胚胎早期发育过程中的时空表达规律。方法从斑马鱼胚胎cDNA中克隆Rap1基因片段,将Rap1基因片段和pCS2＋质粒进行体外连接重组,重组质粒经双酶切、菌落聚合酶链反应（PCR）及测序鉴定正确后,经T3RNA体外转录体系合成DIG标记的Rap1基因反义mRNA探针,采用整胚原位杂交方法检测Rap1在斑马鱼胚胎早期发育过程的表达情况。结果在斑马鱼胚胎0．75 hpf的细胞分裂连接处、3．70 hpf和6．00 hpf的动物极、12．00～72．00 hpf的脊索神经部位均可见Rap1基因的阳性杂交信号。结论 Rap1基因在斑马鱼脊索神经系统的早期发育过程中可能起到重要的调控作用。     

HOXC4基因在斑马鱼早期胚胎发育过程中的表达

目的 探讨HOXC4基因在斑马鱼早期胚胎发育过程中的作用机制,从而为进一步研究其在造血发育中的功能奠定基础.方法 提取斑马鱼总RNA,利用RT-PCR克隆得到HOXC4基因片段,将克隆得到的基因片段和载体pCS2+用限制性内切酶BamHⅠ和Xho Ⅰ双酶切后,把基因片段插入pCS2+中,重组质粒经双酶切及测序鉴定后,采用T3 RNA聚合酶体外转录体系制备地高辛标记的HOXC4基因反义mRNA探针,然后行全胚胎原位杂交.结果 构建HOXC4-pCS2+重组质粒,获得地高辛标记的反义mRNA探针并且完成其在野生型斑马鱼中的全胚胎原位杂交,显示HOXC4基因在Tuebingen野生型斑马鱼神经系统高表达.结论 得到HOXC4基因在斑马鱼早期胚胎发育过程中的基本表达情况,为进一步研究该基因在造血发育过程中的功能奠定了基础.     

腺苷酸活化的蛋白激酶在食管鳞癌中的表达及其临床意义

【摘要】 目的探讨HOXC4基因在斑马鱼早期胚胎发育过程中的作用机制,从而为进一步研究其在造血发育中的功能奠定基础。方法提取斑马鱼总RNA,利用RT-PCR克隆得到HOXC4基因片段,将克隆得到的基因片段和载体pCS2+用限制性内切酶BamHⅠ和XhoⅠ双酶切后,把基因片段插入pCS2+中,重组质粒经双酶切及测序鉴定后,采用T3RNA聚合酶体外转录体系制备地高辛标记的HOXC4基因反义mRNA探针,然后行全胚胎原位杂交。结果构建HOXC4-pCS2+重组质粒,获得地高辛标记的反义mRNA探针并且完成其在野生型斑马鱼中的全胚胎原位杂交,显示HOXC4基因在Tuebingen野生型斑马鱼神经系统高表达。结论得到HOXC4基因在斑马鱼早期胚胎发育过程中的基本表达情况,为进一步研究该基因在造血发育过程中的功能奠定了基础。     

hoxb4转基因斑马鱼造血发育中rap1b基因的表达

目的 为了发现在早期造血发育中关键的调控因子,利用hoxb4转基因斑马鱼研究rap1b基因的表达变化情况,以期明确hoxb4与rap1b在早期造血发育中的关系.方法 选取过表达hoxb4的斑马鱼系为研究对象,分为3组:实验组(表达hoxb4-EGFP的斑马鱼),实验对照组(表达EGFP的斑马鱼),空白对照组(野生型斑马鱼).通过流式分选技术将实验对照组和实验组18hpf(斑马鱼胚胎受精发育18h)、24、30、36、48hpf胚胎中带有绿色荧光(enhanced green fluorescent protein,EGFP)信号的细胞分选出来,利用实时荧光定量PCR检测分选出的细胞中的rap1b基因的表达变化;然后收集野生型斑马鱼多时相胚胎,制备rap1b基因的反义mRNA探针,通过胚胎原位杂交观察探针在3组斑马鱼胚胎18、24、30、36、48hpf杂交信号表达部位.结果 qRT-PCR结果显示实验组30、36、48hpf的斑马鱼胚胎的rap1b基因的表达明显增强(P＜0.05);制备了rap1b基因的反义mRNA探针,胚胎整体原位杂交结果显示:rap1b基因在3组斑马鱼胚胎18 ～ 48 hpf之间神经发育和造血发育部位都有表达.结论 在过表达hoxb4转基因斑马鱼中rap1b基因表达有明显的升高趋势,提示rap1b基因与hoxb4基因可能共同参与调节早期造血发育过程.     

地高辛标记斑马鱼cd99l2基因RNA探针的制备

目的 制备用于斑马鱼胚胎早期cd99l2基因时空表达检测的地高辛标记RNA探针.方法 设计引物,构建cd99l2/pGM-T重组质粒,用SacII和SalI分别进行酶切得到线性化DNA片段,以Sp6 RNA聚合酶和T7RNA聚合酶转录合成地反义和正义地高辛标记的RNA探针,用整体原位杂交法检测斑马鱼胚胎早期cd99l2基因的表达.结果 成功构建了cd99l2/pGM-T重组质粒,体外转录获得反义和正义RNA探针,反义探针杂交检测证实cd99l2基因在斑马鱼胚胎早期发育过程中中枢神经系统呈现高表达,正义探针未检测到表达信号.结论 本研究制备的反义cd99l2 RNA探针,兼顾了特异性和敏感性,能有效检测斑马鱼胚胎早期cd99l2基因的定位表达,而正义探针可以作为阴性对照,为进一步探究cd99l2基因在斑马鱼发育过程中的作用机制奠定了基础.     

野生型斑马鱼胚胎中hoxd3基因mRNA的表达谱

目的:为探讨hoxd3基因在斑马鱼发育过程中与血管形成可能的作用机制,用hoxd3基因的反义mRNA探针进行斑马鱼全胚胎原位杂交,观测hoxd3基因在野生型斑马鱼胚胎发育过程中的表达情况。方法:提取斑马鱼胚胎总RNA,经RT-PCR扩增斑马鱼hoxd3基因片段,将得到的hoxd3基因片段和pCS2+质粒经EcoRⅠ、XbaⅠ双酶切后插入pCS2+质粒中,挑选阳性克隆,通过双酶切、菌落PCR以及测序鉴定;将pCS2+-hoxd3重组子经EcoRⅠ酶切线性化,经T3RNA体外转录体系合成地高辛标记的hoxd3基因的反义mRNA探针。用hoxd3基因的反义mRNA探针进行斑马鱼全胚胎原位杂交。结果:构建和鉴定了pCS2+-hoxd3重组质粒,经斑马鱼全胚胎原位杂交检测hoxd3基因的表达,发现在Tuebingen野生型斑马鱼受精后24 h～72 h胚胎的中脑后脑交界处以及后脑中可以观察到hoxd3基因的表达。结论:hoxd3基因在Tuebingen野生型斑马鱼胚胎发育早期的神经系统高表达,未发现在血管生成区域的表达。     

野生型斑马鱼胚胎中hoxd3基因mRNA的表达谱

目的:为探讨hoxd3基因在斑马鱼发育过程中与血管形成可能的作用机制,用hoxd3基因的反义mRNA探针进行斑马鱼全胚胎原位杂交,观测hoxd3基因在野生型斑马鱼胚胎发育过程中的表达情况。方法:提取斑马鱼胚胎总RNA,经RT-PCR扩增斑马鱼hoxd3基因片段,将得到的hoxd3基因片段和pCS2+质粒经EcoR I、Xba I双酶切后插入pCS2+质粒中,挑选阳性克隆,通过双酶切、菌落PCR以及测序鉴定;将pCS2+-hoxd3重组子经EcoR I酶切线性化,经T3RNA体外转录体系合成地高辛标记hoxd3基因的反义mRNA探针。用hoxd3基因的反义mRNA探针进行斑马鱼全胚胎原位杂交。结果:构建和鉴定了pCS2+-hoxd3重组质粒,经斑马鱼全胚胎原位杂交检测hoxd3基因的表达,发现在Tuebingen野生型斑马鱼24 hpf-72 hpf胚胎的中脑后脑交界处以及后脑中可以观察到hoxd3基因的表达。结论:hoxd3基因在Tuebingen野生型斑马鱼胚胎发育早期的神经系统高表达,未发现在血管生成区域的表达。     

ripply1在斑马鱼早期胚胎背腹发育中的作用

目的 探究ripply1基因在斑马鱼早期背腹轴发生过程中的作用。方法 利用斑马鱼整封原位杂交技术揭示ripply1基因在斑马鱼早期胚胎发育过程中的表达模式，通过显微注射技术在胚胎1细胞期注射ripply1的mRNA来高表达Ripply1蛋白并在后期观察胚胎背腹标记基因的变化及胚胎形态变化。利用Tol2转基因技术构建ripply1启动子驱动的GFP转基因鱼。结果 原位杂交结果显示ripply1基因在斑马鱼原肠早期胚盾期特异表达在胚盾处，即预定的背部。高表达ripply1后，在胚盾期背部标记基因表达范围扩大，腹部标记基因表达减弱，受精后24小时胚胎表现出严重的背部化表型：头部增大，腹部卵黄延伸减弱，尾部躯干及尾部区域减少，有的甚至形成了第二个体轴。得到的转基因鱼揭示ripply1母源表达，并且转录起始位点上游1200个碱基驱动的GFP能模拟内源基因的表达图式。结论 ripply1可能参与斑马鱼胚胎早期背腹轴的发生。     

Celebrex对体内外卵巢癌细胞生长的抑制效应

目的探讨选择性COX-2抑制剂Celebrex体外对人卵巢癌细胞株HO8910增殖及体内对裸鼠卵巢癌原位移植瘤模型生长的抑制效应。方法采用四甲基偶氮唑盐（MTT）法检测Celebrex对人卵巢癌细胞株HO8910生长的影响。建立人卵巢癌原位移植瘤模型,给予Celebrex8周,采用免疫组织化学法和RT-PCR法检测移植瘤组织中COX-2的表达。结果 （1）MTT检测结果显示,COX-2抑制剂与HO8910细胞增殖之间有剂量-效应和时间-效应依赖性;（2）Celebrex干预可抑制裸鼠卵巢癌原位移植瘤生长;（3）免疫组织化学染色和RT-PCR检测结果表明,Ce-lebrex干预组COX-2表达下调（P〈0.05）。结论 COX-2在裸鼠卵巢癌原位移植瘤中表达,COX-2抑制剂在体内体外对卵巢癌细胞生长均有抑制作用。     

塞来昔布对嘌呤氨基核苷诱导的足细胞凋亡中COX-2表达水平的影响

目的:旨在通过特异性环氧合酶-2(COX-2)抑制剂塞来昔布对嘌呤氨基核苷诱导的足细胞凋亡中足细胞COX-2表达水平变化的影响,初步探讨特异性COX-2抑制剂对足细胞保护作用的机制。方法:以条件永生性小鼠足细胞为研究对象,分为6组:正常对照组(CON)、嘌呤霉素氨基核苷组(PA)、地塞米松组(DEX)、塞来昔布组(CELE)、地塞米松+嘌呤氨基核苷组(DEX+PA)、塞来昔布+嘌呤氨基核苷组(CELE+PA),分别于0h、8h、24h和48h四个时间点用Hoechst 33258染色检测足细胞凋亡率,24h抽提蛋白用于Western blot检测COX-2的蛋白表达。结果:PA组与正常对照组相比细胞凋亡率明显增多(P<0.001),DEX+PA、CELE+PA组与PA组比较细胞凋亡率明显减少(P<0.05);正常对照组表达COX-2,用PA诱导凋亡后,24h时COX-2表达明显增加,用CELE、DEX干预后COX-2表达水平有所减少(P<0.05)。结论:特异性COX-2抑制剂CELE可以减少PA诱导的足细胞的凋亡率;CELE抑制PA诱导的足细胞凋亡的作用机制可能与CELE对足细胞所表达的COX-2水平变化的影响有一定的相关性。     

小檗碱通过ERK,JNK信号转导途径对COX-2的抑制作用

目的：研究中药小檗碱是否通过ERK,JNK信号转导途径抑制人外周血单核细胞COX-2mRNA及蛋白表达.方法：取人外周静脉血分离及培养单核细胞,分为对照组、LPS组、LPS＋小檗碱25μmol/L组、LPS＋小檗碱50μmol/L组、LPS＋小檗碱100μmol/L组.分别在培养后30min,6,12,24h提取细胞,行RT-PCR法测定COX-2mRNA水平,行Western Blot法测定ERK,p-ERK,JNK,p-JNK及COX-2蛋白水平.同时加入选择性ERK,JNK抑制剂,分别测定COX-2mRNA及蛋白水平.结果：与LPS组相比,小檗碱组COX-2mRNA及蛋白表达明显抑制（P〈0.05）.与LPS组相比,小檗碱组ERK活性水平有统计学差异（P〈0.05）.但是与LPS组相比,低、中浓度小檗碱组（25,50μmol/L）JNK活性水平无统计学差异,高浓度小檗碱组（100μmol/L）JNK活性水平有明显统计学差异（P〈0.05）.加入ERK,JNK抑制剂之后,COX-2mRNA及蛋白水平降低明显（P〈0.05）.结论：小檗碱能抑制人外周血单核细胞COX-2mRNA及蛋白水平,其作用程度呈浓度依赖性.小檗碱可能通过ERK信号转导途径抑制人外周血单核细胞COX-2mRNA及蛋白表达.高浓度小檗碱可能通过JNK信号转导途径抑制人外周血单核细胞COX-2mRNA及蛋白表达.     

COX-2在乳腺癌组织中的超微结构定位及其意义

目的：观察COX-2蛋白在乳腺癌组织中的超微结构定位及其意义。方法：采用胶体金标记免疫电镜方法检测22例乳腺癌组织标本,观察COX-2蛋白在乳腺癌组织中的定位。结果：胶体金标记免疫电镜显示,59.1%的乳腺癌组织中存在黑色、圆形、集中的胶体金颗粒。结论：COX-2蛋白超微结构定位于乳腺癌细胞的内质网与核膜上,可能与乳腺癌形成过程中蛋白质的合成和转运有关。     

血小板活化因子及相关因子在机械性颅脑损伤中的表达和意义

【目的】研究机械性颅脑损伤后PAFR、COX-2和GluR2之间的相互关系以及与脑损伤时序性变化的相关性。【方法】采用SD大鼠复制Marmarou＇s闭合性颅脑损伤模型，于损伤后4、8、12、24和48h用RT—PCR检测大鼠大脑海马中PAFR、COX-2和GluR2的基因表达情况。【结果】脑损伤后，PAFR和GluR2表达减弱，12h达最低，损伤后各组与对照组相比差别均有显著性（P〈0．01）；COX-2表达增强，8h达最高值，损伤后4、8、12和24h组与对照组相比差别有显著性（P〈0．01）。【结论】PAFR、COX-2和GluR2三者在闭合性颅脑损伤中表达的时序性变化特点基本一致，关系密切，共同参与脑损伤病理生理过程。     

腮腺良恶性多形性腺瘤中COX-2与Survivin表达的相关性研究

［摘要］ 目的检测腮腺多形性腺瘤及恶性多形性腺瘤中COX-2与Survivin蛋白的表达情况,探讨COX-2、Survivin与腮腺多形性腺瘤发生、发展及恶变的相关性。 方法按照Seifert分型标准将多形性腺瘤标本分为4组。A组,基质丰富型20例;B组,其他型24例;C组,细胞丰富型22例;D组,恶性多形性腺瘤18例。采用免疫组织化学法检测各组COX-2和Survivin蛋白的表达情况,分析COX-2和Survivin蛋白的表达在腮腺良恶性多形性腺瘤生成及转归中的相关性。 结果COX-2蛋白于肿瘤细胞的细胞浆中阳性表达,偶尔于细胞膜和细胞核中阳性表达。C组和D组COX-2蛋白阳性表达率高于A组（P＜0.05）。Survivin蛋白在腺管样导管上皮细胞及黏液样组织中阳性表达,于细胞浆和（或）细胞核中可见棕褐色颗粒状阳性表达。D组Survivin蛋白阳性表达率高于A组（P＜0.05）。经Spearman相关性分析,COX-2与Survivin表达呈正相关(rs=0.560,P＜0.01),Survivin表达水平越高的组织细胞中,COX-2表达水平增高。 结论COX-2、Survivin在腮腺良恶性多形性腺瘤中的表达存在相关性,为多形性腺瘤临床病理诊断提供了一定的理论依据,并可能成为新的生物标志物和治疗基因靶点。     

COX-2在口腔白斑、口腔扁平苔藓及口腔鳞状细胞癌中的表达

目的通过观察COX-2在口腔黏膜白斑(OLK)、口腔扁平苔藓(OLP)及口腔鳞状细胞癌(SCC)中的表达情况,探讨其在口腔癌发生过程中的意义。方法用免疫组化方法检测COX-2在51例口腔黏膜白斑(单纯增生15例,伴异常增生36例)、34例口腔扁平苔藓(单纯扁平苔藓19例,伴异常增生15例)、52例口腔鳞状细胞癌、10例正常口腔黏膜中的表达情况。采用图像分析系统计数阳性细胞率。应用统计学方法分析COX-2在不同病变中的表达。结果COX-2在白斑单纯增生组6.7%(1/15)为强阳性表达,白斑异常增生组强阳性的表达率为50%(18/36);在单纯扁平苔藓组15.8%(3/19)为强阳性表达;扁平苔藓异常增生组强阳性的表达率为33.3%(5/15);鳞状细胞癌有7.7%(4/52)呈强阳性表达。COX-2在白斑异常增生组强阳性的表达率显著高于单纯白斑和鳞状细胞癌组(P<0.01),在扁平苔藓异常增生组明显高于单纯扁平苔藓和鳞状细胞癌组(P<0.05)。单纯白斑、扁平苔藓组与鳞癌组相比较,COX-2的表达无明显差异(P>0.05)。结论COX-2在口腔癌变过程中是一个早期事件,可能成为化学预防作用的重要靶点。     

原代培养大鼠海马神经元液压冲击后PAFR、COX-2和GluR2基因表达比较研究

【目的】研究海马神经元在中度液压冲击损伤后PAFR、COX-2和2GluR2基因表达时序性变化的相关性。【方法】原代培养大鼠海马神经元,复制改良Scott’s中度液压冲击神经元损伤模型,采用免疫荧光双标技术鉴定神经元纯度,应用RT-PCR技术对PAFRmRNA、COX-2mRNA和GluR2mR．NA的表达进行定量研究。【结果】对照组COX-2mRNA呈低表达,损伤后表达逐渐增高,12h达最高值,损伤后12h组与对照组相比差别有显著性（P〈0．05）;对照组GluR2mRNA呈高表达,损伤后表达逐渐减弱,8h达最低值,损伤后8h、12h组与对照组相比差别有显著性（P〈0．05）;对照组PAFRmRNA呈高表达,损伤后表达逐渐减弱,8h达最低值,损伤后8h、12h组与对照组相比差别有显著性（P〈0．05）。【结论】正常时COX-2mRNA在体外培养神经元中仅有少量表达,损伤后4h表达增加,12h达最高值,钙h时仍高于正常。正常时GluR2mRNA在体外培养神经元有较多表达,损伤后4h表达下降,8h达最低值,48h时仍低于正常。正常时PAFRmRNA在体外培养神经元中有较多表达,损伤后4h表达下降,8h达最低,48h时仍低于正常。PAFRmRNA、COX-2mRNA和GluR2mRNA在体外海马神经元中度液压冲击损伤中表达的时序性变化特点基本一致,三者关系密切,共同参与脑损伤病理生理过程。