PI3K/Akt通路在芍药苷抗Aβ25-35诱导PC12细胞凋亡中的作用

目的:研究PI3K/Akt通路在芍药苷对PC12细胞神经保护中的作用。方法:芍药苷组(5,10,20μmol·L-1)预处理30 min,然后加入Aβ25-35(20μmol·L-1)共同作用24 h;抑制剂LY294002(10μmol·L-1)于芍药苷(10μmol·L-1)作用前预处理30 min。用MTT比色法检测细胞存活率,Annexin-V/PI双染检测细胞凋亡率,以及Western blot法检测p-Akt,Bax,Bcl-2,cleaved caspase-3蛋白表达。结果:芍药苷可抑制Aβ25-35所诱导的PC12细胞毒性和凋亡,其保护作用可能是通过上调Akt磷酸化水平,增加Bcl-2蛋白表达、降低Bax蛋白表达、抑制caspase-3等的激活而实现的;抑制剂LY294002可减弱上述芍药苷的保护作用。结论:芍药苷可通过激活PI3K/Akt信号通路对Aβ25-35诱导PC12细胞损伤具有保护作用。     

黄芩苷对Hela细胞凋亡的影响

目的探讨黄芩苷诱导Hela细胞的凋亡作用及对PI3K/AKT/mTOR通路的影响。方法培养Hela细胞后分为空白组、卡铂组(40μg/mL)及黄芩苷低、高剂量组(40、80μmol/L),处理24 h。MTT法检测细胞增殖,Annexinv-FITC/PI双染色和hoechst 33342染色检测细胞凋亡,Western blot法检测p-PI3K、p-AKT、p-mTOR蛋白表达。结果与空白组比较,黄芩苷(40、80μmol/L)能抑制细胞增殖(P<0.01),增加细胞凋亡率(P<0.01),抑制p-PI3K、p-AKT、p-mTOR蛋白表达(P<0.01),且细胞出现明显的染色质凝集、核萎缩、凋亡小体增多现象。结论黄芩苷可能通过下调PI3K/AKT/mTOR通路,从而具有抑制HeLa细胞增殖、促进凋亡的作用。     

乙酰紫草素联合奥沙利铂对人结肠癌HT29细胞增殖及凋亡的影响

目的探讨乙酰紫草素联合奥沙利铂对人结肠癌HT29细胞增殖及凋亡的影响。方法将人结肠癌HT29细胞分为空白组、乙酰紫草素组(10μmol/L)、奥沙利铂组(1μmol/L)和联合给药组(10μmol/L乙酰紫草素+1μmol/L奥沙利铂),MTT法检测HT29细胞增殖抑制率,流式细胞术检测HT29细胞凋亡率、qRT-PCR法检测HT29细胞Ki-67、Bcl-2及Bax mRNA表达,Western blot法检测磷酸化磷脂酰肌醇-3-羟激酶(p-PI3K)、磷酸化蛋白激酶B (p-Akt)蛋白表达。结果人结肠癌HT29细胞经乙酰紫草素、奥沙利铂和联合给药处理24、48、72 h后,细胞增殖抑制率均增加,其中联合给药组细胞增殖抑制率最高(P<0. 05)。药物处理HT29细胞48 h后,与空白组比较,乙酰紫草素组、奥沙利铂组和联合给药组凋亡率、Bax mRNA表达增加(P<0. 05),而Ki-67、Bcl-2 mRNA表达及p-PI3K、p-Akt蛋白表达降低(P<0. 05);联合给药组的细胞凋亡率、Bax mRNA表达均高于乙酰紫草素组和奥沙利铂组,Ki-67、Bcl-2 mRNA表达及p-PI3K、p-Akt蛋白表达低于乙酰紫草素组和奥沙利铂组。结论乙酰紫草素和奥沙利铂对人结肠癌HT29细胞均具有抑制增殖及诱导凋亡作用,可能与调控PI3K/Akt信号通路有关,且两者联用时效果更好。     

血根碱通过调控PI3K/Akt信号通路诱导胰腺癌细胞凋亡的机制

目的:探讨血根碱对胰腺癌细胞凋亡的影响及其信号通路调控机制。方法:不同浓度血根碱(2,4,6μmol·L~(-1))处理小鼠胰腺癌Panc02细胞不同时间(24,48,72 h)后,采用噻唑蓝(MTT)比色法检测血根碱对细胞生长抑制作用的影响;采用磷脂结合蛋白V/碘化丙啶(Annexin V/PI)双染色试剂盒通过流式细胞仪检测血根碱对Panc02细胞凋亡影响;采用花青染料(JC-1)探针试剂盒荧光染料分析检测线粒体膜电位的变化;采用蛋白免疫印迹法(Western blot)检测B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2),Bcl-2相关X蛋白(Bax),总蛋白激酶B(Akt),磷酸化蛋白激酶B(p-Akt),总磷脂酰肌醇3激酶(PI3K),磷酸化磷脂酰肌醇3激酶(p-PI3K)的表达情况。结果:与空白组比较,不同浓度的血根碱作用同一时间后,随着药物浓度的增加细胞生长抑制率逐渐升高(P0.05),与空白组比较,同一浓度作用不同时间后,随着时间的增加细胞生长抑制率逐渐升高(P0.05);与空白组比较,血根碱2μmol·L~(-1)组的细胞凋亡率无明显升高,与空白组比较,血根碱4,6μmol·L~(-1)组的细胞凋亡率均明显升高(P0.05);与空白组比较,血根碱2μmol·L~(-1)组时红绿荧光无变化,血根碱4,6μmol·L~(-1)组红色荧光减弱,绿色荧光增强,Panc02细胞线粒体膜电位降低;与空白组比较,血根碱2μmol·L~(-1)组处理的Bax,Bcl-2,p-PI3K,p-Akt,Akt和PI3K蛋白表达均无变化,血根碱6μmol·L~(-1)组Bax蛋白表达增高,Bcl-2及PI3K/Akt信号通路中关键蛋白p-PI3K,p-Akt表达降低(P0.05)。结论:血根碱通过抑制PI3K/Akt信号通路有效地诱导小鼠胰腺癌Panc02细胞经线粒体凋亡途径发生凋亡。     

红景天苷对H9c2心肌细胞损伤的保护作用及机制研究

目的观察红景天苷对H2O2诱导的H9c2心肌细胞氧化应激损伤的线粒体保护作用,并探讨其具体的信号转导机制。方法利用大鼠胚胎心脏组织来源的H9c2细胞建立H2O2损伤模型,分别给予100,75,50,25,1μmol/L的红景天苷预处理,MTT法测定细胞存活率,确定红景天苷的最适保护浓度;应用激光扫描共聚焦显微镜成像法,检测线粒体特异性荧光染料四甲基罗丹明乙酯(tetramethyrhodamine ester,TMRE),观察细胞线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential,△Ψm)的变化,证明红景天苷是否通过抑制线粒体通透性转移孔(mitochondrial permeability transition pore,mPTP)的开放而发挥心肌线粒体的保护作用;同时用Western-blot法检测磷酸化Akt,磷酸化GSK-3β蛋白表达,初步探讨其具体信号转导机制。结果与H2O2组比较,红景天苷各浓度组细胞存活率显著提高(P0.05);TMRE荧光减弱程度均明显减低,以浓度50μmol/L时作用最明显(P0.05);红景天苷(50μmol/L)可显著上调Akt及GSK-3β的磷酸化水平(P0.05)。结论红景天苷能够通过线粒体保护途径对抗H2O2诱导的H9c2细胞氧化应激损伤,且该保护作用可能是通过PI3K/Akt通路促进其下游因子GSK-3β的磷酸化,从而抑制mPTP的开放实现的。     

氧化苦参碱通过 PTEN/PI3K/Akt/mTOR 通路对人膀胱癌 T24 细胞增殖、凋亡的影响研究

目的:探讨氧化苦参碱能否通过第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源的基因/3-磷酸肌醇激酶/蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶向基因(Phosphatase and tension homolog deleted on chromosome ten/phosphoinositide 3-kinase/protein kinase B/mammalian target of rapamycin,PTEN/PI3K/Akt/mTOR)通路对人膀胱癌T24细胞的增殖、凋亡产生影响。方法:T24细胞复苏传代后与不同剂量氧化苦参碱共培养,MTT法检测不同剂量氧化苦参碱对T24细胞增殖的影响,流式细胞仪检测氧化苦参碱对T24细胞凋亡的影响,Hoechst光镜观察氧化苦参碱对T24细胞核形态的影响,Western blot检测氧化苦参碱对T24细胞PI3K、Akt、mTOR、PTEN蛋白表达的影响。结果:与0μmol/L组比较,氧化苦参碱各剂量组T24细胞的增殖率下降,凋亡率升高,PI3K、Akt、mTOR蛋白表达下降,PTEN蛋白表达上升,且在一定范围内存在剂量依赖性(P 0.05)。结论:氧化苦参碱可能通过PTEN/PI3K/Akt/mTOR通路抑制T24细胞的增殖,促进其凋亡。     

萜类化合物Telekin通过抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路诱导HGC-27细胞自噬

目的:研究从天名精中分离得到的萜类化合物Telekin诱导的胃癌细胞HGC-27自噬并探讨其分子作用机制。方法:MTT法研究Telekin对不同肿瘤细胞的细胞毒活性;透射电镜观察Telekin诱导的HGC-27细胞自噬;用mRFP-GFP-LC3点状聚集物的形成,评价HGC-27细胞内自噬流的变化;MTT法研究用不同自噬抑制剂氯喹(CQ)、3-甲基腺嘌呤(3-MA)和mTOR抑制剂雷帕霉素(Rapamycin)预处理时,Telekin对HGC-27细胞的细胞毒活性,研究自噬与细胞死亡的关系。Western blot检测PI3K/Akt/mTOR信号通路关键蛋白PI3K、Akt、mTOR、p-PI3K、p-Akt、p-mTOR、p-ULK1、ULK1、Beclin1、p-Beclin1、p62、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ蛋白的表达。结果:MTT实验结果表明Telekin对胃癌细胞HGC-27具有较好的细胞毒活性和一定的选择性;透射电镜和激光共聚焦显微镜观察到Telekin诱导HGC-27细胞发生了明显的自噬和显著的自噬流变化;用Rapamycin预处理时增强了Telekin的细胞毒性,IC_(50)值由22.78μM降为14.4μM。用3-MA和CQ预处理后降低了Telekin的细胞毒性,IC_(50)值从22.78μM增加为30.06μM和29.46μM,说明自噬促进了细胞死亡;Western blot结果显示Telekin降低了p-PI3K、p-Akt、p-mTOR、p62、LC3Ⅰ的表达,增强了p-ULK1、p-Beclin1、LC3Ⅱ的表达,而对PI3K、Akt、mTOR、ULK1、Beclin1总蛋白没有明显影响。结论:Telekin通过降低p-PI3K、p-Akt、p-mTOR、p62、LC3Ⅰ的表达水平,增强p-ULK1、p-Beclin1、LC3Ⅱ的表达水平,来诱导HGC-27细胞发生自噬,从而促进细胞死亡。     

人参皂苷Rg_3调节免疫检查点PD-L1抑制肺癌Lewis细胞增殖的作用及机制研究

目的研究人参皂苷Rg_3对小鼠非小细胞肺癌Lewis细胞(LLC)中免疫检查点程序性死亡分子1配体(PD-L1)的调节作用及其作用机制。方法通过MTT法及细胞长时程动态监测法观察人参皂苷Rg_3对LLC增殖的影响;20 ng/mLγ干扰素(IFN-γ)处理LLC制备PD-L1高表达体外模型,采用人参皂苷Rg_3进行干预,流式细胞术及免疫荧光检测人参皂苷Rg_3对PD-L1表达的影响;采用Western blotting法验证人参皂苷Rg_3对PI3K/蛋白激酶B(Akt)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(m TOR)通路相关蛋白表达的影响。结果人参皂苷Rg_3 16、32、64、128μmol/L能够显著抑制LLC增殖(P0.01)及减少IFN-γ诱导的PD-L1表达(P0.05);人参皂苷Rg_3 32、64μmol/L能够降低PI3K、m TOR蛋白的表达水平(P0.01);人参皂苷Rg_3 16、32、64μmol/L能够抑制Akt蛋白的磷酸化(P0.05)。结论人参皂苷Rg_3能够显著抑制LLC中PD-L1表达,通过抑制PI3K/Akt/m TOR通路,阻断PD-L1介导的肿瘤细胞免疫逃逸,增强T细胞的免疫应答作用,抑制LLC生长。     

丹参酮ⅡA通过抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路促进人喉癌Hep-2细胞凋亡和自噬的研究

目的 研究丹参酮ⅡA对人喉癌Hep-2细胞凋亡和自噬的影响，并基于磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(PI3K/Akt/mTOR)信号通路探讨其可能作用机制。方法 分别以不同浓度丹参酮ⅡA(0,2,4,8,16,32μmol/L)干预对数生长期人喉癌Hep-2细胞48 h, CCK-8法检测细胞增殖抑制率，计算半抑制浓度(IC50)作为后续实验药物浓度。取对数生长期人喉癌Hep-2细胞，设空白组、丹参酮ⅡA组、丹参酮ⅡA+IGF-1(PI3K激活剂)组、丹参酮ⅡA+LY294002(PI3K抑制剂)组，各组给予相应干预48 h后，CCK-8法、Annexin V-FITC/PI双染法、GFP-LC3荧光质粒转染法检测细胞增殖抑制率、凋亡率和自噬体形成情况，Western blot法检测B细胞淋巴瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、激活型半胱氨酸蛋白酶-3(Cleaved Caspase-3)、微管相关蛋白1轻链3(LC3)、PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR蛋白表达情况。结果 丹参酮ⅡA对Hep-2细胞增殖抑制作用呈现...     

α-常春藤皂苷对黑色素瘤B16细胞增殖和凋亡的影响及机制

目的:探讨α-常春藤皂苷(α-HN)对黑色素瘤B16细胞增殖和凋亡的影响及潜在机制。方法:常规培养B16细胞至对数生长期,给予不同浓度α-HN(50,100,200μmol·L~(-1))处理,设未经α-HN处理的B16细胞为空白组;采用噻唑蓝(MTT)比色法检测α-HN处理24,48,72 h后各组细胞的增殖情况,采用膜联蛋白V/碘化丙啶(Annexin V-FITC/PI)凋亡试剂盒检测α-HN处理48 h后的细胞凋亡率,半胱天冬蛋白酶(Caspase)活性检测试剂盒检测Caspase-3和Caspase-9的活性,蛋白免疫印迹法(Western blot)检测B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2),Bcl-2相关X蛋白(Bax),磷酸化磷脂酰肌醇-3-羟激酶(p-PI3K),磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)及磷酸化雷帕霉素靶蛋白(p-mTOR)的表达情况。结果:与空白组相比,经50,100,200μmol·L~(-1)α-HN处理24,48,72 h后,B16细胞增殖抑制率显著增加(P0.01),且随着观察时间的延长,增殖抑制率有逐渐增加趋势,该抑制作用呈时间依赖性和浓度依赖性;与空白组相比,α-HN处理48 h后B16细胞的凋亡率升高,Caspase-3和Caspase-9活性增强,且Bcl-2水平降低而Bax水平升高(P0.01);α-HN处理48 h后的p-PI3K,p-Akt,p-mTOR蛋白表达较空白组降低(P0.05,P0.01)。结论:α-HN具有抑制B16细胞增殖及诱导凋亡作用,其可能通过抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路来发挥细胞毒及诱导凋亡作用,在黑色素瘤治疗中有较好的应用前景。     

基于PI3K/Akt/mTOR信号通路调控巨噬细胞自噬探讨黄芪甲苷抗动脉粥样硬化的作用机制

目的观察黄芪甲苷对磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路的调控,研究黄芪甲苷抗动脉粥样硬化的作用机制。方法体外细胞实验中,将小鼠巨噬细胞RAW264.7随机分为5组,即对照组、黄芪甲苷组、康士得组、雷帕霉素组以及si RNA组。分别用黄芪甲苷含药血清、Akt抑制剂康士得、mTOR抑制剂雷帕霉素及mTOR-si RNA体外处理RAW264.7细胞48 h,透射电镜观察巨噬细胞自噬体的变化,免疫荧光法及Western blotting法检测微管相关蛋白LC3-II表达,实时荧光定量PCR(q RT-PCR)和Western blotting法检测Akt、mTOR及自噬相关蛋白Beclin 1的表达,ELISA检测RAW264.7细胞分泌炎症因子白细胞介素-4(IL-4)、IL-10、IL-2和γ-干扰素(IFN-γ)水平。体内实验采用HE染色检测各组小鼠主动脉横截面病理损伤程度;q RT-PCR和Western blotting法分别检测小鼠主动脉组织中Akt、mTOR的mRNA和蛋白表达。结果体外实验结果显示,与对照组比较,黄芪甲苷含药血清组和各抑制剂组细胞透射电镜下观察到自噬体明显增多(P0.05),LC3-II和Beclin1蛋白的表达水平明显上调(P0.05),而Akt及mTOR的mRNA及蛋白表达水平明显减少(P0.05),巨噬细胞分泌的IL-10明显降低,而分泌的IFN-γ显著增加(P0.05)。小鼠主动脉HE染色结果显示,与模型组比较,黄芪甲苷组小鼠血管各层结构正常,排列整齐,局部有小灶性的钙化颗粒物沉积,病变轻、斑块小,泡沫细胞和脂质减少,弹力板基本完整,病变程度明显较轻,并较各抑制剂组轻。黄芪甲苷组小鼠主动脉组织Akt、mTOR的mRNA和蛋白表达均较低(P0.05)。结论黄芪甲苷抑制动脉粥样硬化斑块的形成机制与调控PI3K/Akt/mTOR信号通路、抑制炎症反应有关。     

加味四君子汤含药血清对肝癌Hep-G2细胞的影响

目的:探讨加味四君子汤含药血清对肝癌Hep-G2细胞增殖、凋亡、周期的影响及其作用机制。方法:不同浓度加味四君子汤含药血清处理Hep-G2细胞后,采用细胞活性检测试剂盒(CCK-8)检测细胞增殖;Annexin V/碘化丙啶(PI)流式细胞术检测细胞凋亡率和周期;hoechst33342荧光染色观察细胞凋亡形态;免疫印迹法(Western blot)检测细胞中磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/雷帕霉素靶蛋白(m TOR)信号通路相关蛋白表达水平。结果:加味四君子汤含药血清呈浓度依赖性抑制肝癌Hep-G2细胞的增殖,诱导Hep-G2细胞凋亡,阻滞细胞于G0/G1期。hoechst33342染色后,随着含药血清浓度的增加,Hep-G2细胞核显著呈碎块状致密浓染。同时,加味四君子汤含药血清能够抑制Hep-G2细胞Akt,m TOR,核糖体S6蛋白激酶(S6),真核翻译起始因子4E结合蛋白1(4EBP1)的磷酸化,从而上调Bcl-2相关X蛋白(Bax)和下调细胞周期蛋白(Cyclin D1),B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)的表达。加味四君子汤含药血清与300 nmol·L-1的PI3K/m TOR双重抑制剂VS-5584联合使用具有协同作用,含药血清能增强PI3K/m TOR双重抑制剂VS-5584对Hep-G2细胞中PI3K/Akt/m TOR信号通路靶点Akt和m TOR磷酸化的抑制作用。结论:加味四君子汤含药血清能抑制Hep-G2细胞的增殖,诱导其凋亡,阻滞其于G0/G1期,其机制可能通过阻断PI3K/Akt/m TOR信号通路而实现。     

葛根素通过调控PI3K/AKT信号通路影响食管鳞状细胞癌体内外生长和转移

目的:探究葛根素对食管鳞状细胞癌体内外生长和转移的影响及机制。方法:MTT实验确定葛根素给药浓度为20、40、80μmol/L,取TE-13细胞,设置空白对照组、葛根素20、40、80μmol/L给药组,CCK-8法检测细胞增殖能力、细胞划痕实验检测细胞迁移能力、细胞侵袭实验检测细胞侵袭能力、软琼脂克隆形成实验检测细胞生长能力、流式细胞术检测细胞凋亡及细胞周期、Western blot检测细胞磷脂酰肌醇-3激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)和蛋白激酶B(Protein Kinase B,PKB,又称Akt)磷酸化水平;构建TE-13细胞裸鼠皮下移植瘤模型,并设置模型对照组、葛根素25mg/kg、50 mg/kg、100 mg/kg灌胃给药组,检测给药期间小鼠瘤体积变化,给药结束后取肿瘤组织称重、Western blot检测瘤组织中PI3K和Akt磷酸化水平,取肺组织拍照,苏木精-伊红染色法(hematoxylin-eosin staining,HE staining)检测肺组织肿瘤转移情况。结果:相较于空白对照组,葛根素20、40、80μmol/L组细胞增殖、迁移、侵袭能力显著下降、克隆形成数目显著减少、细胞凋亡显著增加、细胞周期显著阻滞、PI3K和Akt磷酸化水平明显降低(P <0. 05);相较于模型对照组,葛根素25、50、100μmol/L灌胃给药组小鼠瘤体积生长缓慢、肺组织转移节点显著减少、肿瘤组织PI3K和Akt磷酸化水平明显降低(P <0. 05)。结论:葛根素能够抑制食管鳞状细胞癌的体内外生长和转移,其机制可能为抑制PI3K/AKT信号通路。     

秦皮甲素对高糖诱导大鼠肾小球系膜细胞增殖及纤维连接蛋白表达的影响

目的探讨秦皮甲素对高糖诱导的大鼠肾小球系膜细胞(HBZY-1)增殖及纤维连接蛋白(FN)表达的影响。方法采用CCK-8法检测不同浓度秦皮甲素(10、30、90μmol·L-1)对正常培养条件(含糖5.6 mmol·L-1)和高糖培养条件(含糖25 mmol·L-1)下的HBZY-1细胞增殖的影响;以PI3K抑制剂Wortmannin(1μmol·L-1)干预为对照,采用Western Blot法检测秦皮甲素对高糖培养条件下HBZY-1细胞FN蛋白表达及PI3K/Akt蛋白磷酸化水平变化的影响。结果在正常培养条件下,与正常组比较,秦皮甲素给药组(10、30、90μmol·L-1)的HBZY-1细胞增殖均无明显变化(P>0.05)。在高糖培养条件下,与正常组比较,高糖组的细胞活力明显增加(P<0.05),HBZY-1细胞FN蛋白表达和PI3K/Akt磷酸化水平明显升高(P<0.05);与高糖组比较,90μmol·L-1秦皮甲素给药组的HBZY-1细胞活力明显降低(P<0.05),FN蛋白表达和PI3K/Akt磷酸化水平亦显著下调(P<0.05)。结论秦皮甲素能够抑制高糖诱导的HBZY-1细胞增殖,下调FN蛋白表达,可能与其抑制PI3K/Akt信号通路激活密切相关。     

黄芩苷对HT-29细胞炎症模型PI3K/NF-κB信号通路的影响及机制探讨

目的:观察黄芩苷对人结肠癌上皮细胞株HT~(-2)9的炎症模型中磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/丝氨酸苏氨酸蛋白激酶(Akt)/核转录因子-κB(NF-κB)信号通路的影响,并探讨其机制。方法:以肿瘤坏死因子(TNF)-α及脂多糖(LPS)共同诱导HT~(-2)9细胞,建立细胞炎症模型。实验分为6组,空白组加入完全培养基孵育,实验过程中不予任何药物干预,模型组给予h TNF(20μg·L~(~(-1)))黄芩苷孵育12 h后,再给LPS(1 mg·L~(~(-1)))孵育15 h;柳氮磺胺吡啶组在模型组的基础上,加入柳氮磺胺吡啶(SASP,500μmol·L~(~(-1)));黄芩苷组在模型组基础上给予不同剂量(1,10,100μg·L~(~(-1)))黄芩苷孵育24 h。噻唑蓝(MTT)法检测黄芩苷(1,10,100μg·L~(~(-1)))对细胞生长的影响;免疫印迹(Western blot)法检测黄芩苷(1,10,100μg·L~(~(-1)))对PI3K,Akt,NF-κB等蛋白表达,酶联免疫吸附(ELISA)法检测黄芩苷(1,10,100μg·L~(~(-1)))对细胞上清中TNF-α,白细胞介素(IL)-6等含量的影响。结果:与模型组比较,黄芩苷组、柳氮磺胺吡啶组的细胞上清液中TNF-α,IL-6,IL-8,IL~(~(-1))分泌量明显减少(P0.05),且两药联合应用对TNF-α,IL-6,IL-8,IL~(~(-1))分泌量的减弱效应更强(P0.01)。与模型组比较,黄芩苷组(1,10,100μg·L~(~(-1))),柳氮磺胺吡啶组(500μmol·L~(~(-1)))中的PI3K蛋白磷酸化水平,Akt磷酸化水平,NF-κB活化入核水平,环氧化酶~(-2)(Cox~(-2))蛋白,β-连环蛋白(β-catenin)蛋白,天冬氨酸蛋白水解酶-9(Caspase-9)蛋白,人凋亡相关因子配体(Fas L)蛋白表达均明显减少(P0.05)。结论:黄芩苷能减轻HT~(-2)9细胞炎症反应,抑制PI3K磷酸化,下调Akt的活化,抑制NF-κB的活化入核,从而抑制TNF-α,IL-6等炎症因子的分泌,发挥其抗炎效应,提示黄芩苷可能通过以抑制Akt的活化,抑制NF-κB的核转位,发挥其抗炎作用。     

基于Akt/mTOR信号通路探讨洋地黄毒苷调控甲状腺滤泡上皮细胞自噬与凋亡的机制

目的 探究洋地黄毒苷对脂多糖刺激下的人甲状腺滤泡上皮细胞系Nthy-roi3-1凋亡与自噬的影响及其作用机制。方法 (1)将Nthy-roi3-1细胞分为对照组、脂多糖组、脂多糖+洋地黄毒苷低剂量组、脂多糖+洋地黄毒苷中剂量组及脂多糖+洋地黄毒苷高剂量组,各组进行对应处理后,CCK-8法检测各组细胞活力,免疫荧光染色观察各组细胞自噬标志物微管相关蛋白1轻链3(LC3)表达情况,流式细胞术检测各组细胞凋亡率,Western blot法检测各组细胞中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Bcl-2同源结构域蛋白抗体(Beclin 1)、磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)、蛋白激酶B(Akt)、磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(p-mTOR)、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、p70S6K蛋白表达情况。(2)将Nthy-roi3-1细胞分为对照组、脂多糖组、脂多糖+洋地黄毒苷组、脂多糖+洋地黄毒苷+自噬抑制剂组,各组进行对应处理后,流式细胞术检测各组细胞凋亡率,Western blot法检测各组细胞中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1、p-Akt、Akt、p-mTOR、mTOR及p70S6K蛋白表达情况。结果 (1...     

刺五加苷B介导PI3K/Akt/mTOR通路诱导肺癌细胞凋亡和自噬北大核心CSCD

探讨刺五加苷B对肺癌A549和H460细胞凋亡和自噬的影响及其分子机制。采用噻唑蓝比色法(methyl thiazolyl tetrazolium colorimetric,MTT)检测5、10、15、20、25、30、35、40、45 mmol·L^(-1)刺五加苷B对肺癌细胞的细胞毒作用;台盼蓝排斥实验检测不同时间刺五加苷B对肺癌细胞A549和H460存活率的影响;克隆形成实验检测刺五加苷B对肺癌细胞A549和H460增殖的影响;acridine orange/ethidium bromide(AO/EB)荧光双染、Hoechst 33342荧光染色法检测刺五加苷B对肺癌细胞A549和H460凋亡的影响,并应用Western blot法检测凋亡相关蛋白探究凋亡相关分子机制;应用AO荧光染色、Western blot法检测自噬泡以及自噬相关蛋白P62和微管相关蛋白1轻链3蛋白(microtubule-associated protein 1 light chain 3,LC3)的表达情况。结果显示,与对照组相比,刺五加苷B以浓度依赖的方式抑制肺癌细胞A549和H460的生长,并得到刺五加苷B对肺癌细胞A549和H460最佳作用时间均为24 h,最佳作用浓度分别为28.64、22.16 mmol·L^(-1);刺五加苷B能够抑制肺癌细胞A549和H460集落形成;与对照组相比,在刺五加苷B的作用下能够促进凋亡小体的形成诱导细胞发生凋亡,同时诱导线粒体途径相关蛋白的表达;在刺五加苷B的作用下肺癌细胞中酸性自噬泡增多,LC3Ⅱ表达增加、P62蛋白表达下降,磷脂酰肌醇3-激酶(phosphoinositide 3-kinase,PI3K)/丝氨酸-苏氨酸激酶(serine-threonine kinase,Akt)/哺乳动物雷帕霉素靶标(mammalian target of rapamycin,mTOR)通路中PI3K、p-Akt和p-mTOR蛋白表达下降。研究表明,刺五加苷B能够抑制肺癌细胞生长,减少集落形成,并发现是通过线粒体途径诱导肺癌细胞发生凋亡,此外还可诱导细胞自噬的发生,其作用机制可能与PI3K/Akt/mTOR通路有关。     

基于PI3K/Akt/mTOR信号通路探讨炙甘草汤抗大鼠MIRI致室速和室颤的作用机制

目的:通过磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路,探讨炙甘草汤干预心肌缺血再灌注损伤(MIRI)致心律失常(室速和室颤)的作用及其机制。方法:将72只SD大鼠随机分为假手术组,模型组,炙甘草汤低、中、高剂量组(11.43,22.86,45.72 g·kg~(-1)),稳心颗粒组(2.43 g·kg~(-1)),连续给药干预10 d。末次给药2 h,采用结扎冠状动脉左前降支法制备大鼠MIRI模型,记录心电图的变化。造模成功后采集血液及心脏组织,检测血清中肌酸肌酶(CK),乳酸脱氢酶(LDH)及丙氨酸氨基转移酶(AST)的含量;酶联免疫吸附测定(ELISA)检测心肌肌钙蛋白(CtnI)的含量;免疫组化法检测心肌PI3K,Akt,mTOR的表达;采用蛋白免疫印迹法(Western blot)检测心肌自噬相关蛋白微管相关蛋白1轻链3(LC-3),自噬标志物Beclin1和PI3K/Akt/mTOR信号通路相关蛋白表达及磷酸化p-PI3K,p-Akt,p-mTOR的水平。结果:模型组大鼠100%发生室速,91.67%发生室颤;与假手术组比较,模型组大鼠血清CK,LDH,AST以及CtnI的含量显著升高(P0.01),心肌组织中PI3K,Akt,mTOR表达显著升高(P0.01),LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ与Beclin1的相对表达量显著升高(P0.01),p-PI3K/PI3K,p-Akt/Akt,p-mTOR/mTOR显著降低(P0.01);与模型组比较,炙甘草汤高剂量组室速、室颤发生率显著降低(P0.01),较其他给药组持续时间短(P0.01);炙甘草汤高剂量组CK,LDH,AST水平及CtnI含量显著降低(P0.01);炙甘草汤给药组的PI3K,Akt,mTOR的表达随剂量的增加而显著降低(P0.01);LC-3,Beclin1的表达随炙甘草汤各剂量组的增加有不同程度地下降(P0.01),而PI3K/Akt/mTOR相关蛋白表达比值明显升高(P0.05,P0.01)。结论:炙甘草汤预处理能使异常升高的心肌酶CK,LDH,AST,CtnI降低,抑制细胞的过度自噬,上调PI3K,Akt和mTOR的表达,说明炙甘草汤抗MIRI致心律失常的作用可能与PI3K/Akt/mTOR信号通路有关。     

徐长卿丹皮酚联合顺铂对骨肉瘤细胞迁移和凋亡及相关蛋白表达的影响

目的:探讨徐长卿丹皮酚(Paeonol)联合顺铂对骨肉瘤MG-63细胞迁移和凋亡的影响及其作用机制。方法:培养骨肉瘤MG-63细胞,分别加入不同浓度的徐长卿丹皮酚(0.3,0.6,1.2 mmol/L)和顺铂(4μmol/L)单独及联合作用,采用CKK-8法检测MG-63细胞增殖抑制率,并计算两药相互作用指数(CDI),评价两药相互作用性质,细胞划痕实验和Transwell实验检测MG-63细胞的迁移和侵袭能力,TUNEL法检测MG-63细胞凋亡情况,Western Blot法检测骨肉瘤MG-63细胞中Akt和mTOR蛋白表达及磷酸化水平。结果:徐长卿丹皮酚和顺铂联合给药可以显著抑制骨肉瘤细胞增殖,两药存在协同作用,CDI1,其抑制作用与徐长卿丹皮酚浓度及作用时间相关,差异有统计学意义(P0.05,P0.01);徐长卿丹皮酚不同浓度联合顺铂给药可显著抑制骨肉瘤细胞迁移,并具有一定的浓度依赖性,差异有统计学意义(P0.05,P0.01);徐长卿丹皮酚联合顺铂可以显著抑制骨肉瘤细胞的侵袭能力,并具有一定的浓度依赖性;随着徐长卿丹皮酚浓度的增加,呈红色荧光凋亡细胞有明显增多的趋势,以徐长卿丹皮酚中、高浓度与顺铂联用最明显;徐长卿丹皮酚联合顺铂可显著抑制Akt、mTOR蛋白磷酸化水平,具有一定的浓度依赖性,差异有统计学意义(P0.01)。结论:徐长卿丹皮酚增强顺铂抑制骨肉瘤MG-63细胞增殖、迁移、侵袭和诱导凋亡,可能通过抑制Akt、mTOR蛋白磷酸化,发挥协同抑瘤作用。     

莪术醇诱导人卵巢癌SKOV3细胞凋亡及对PI3K/Akt信号通路相关蛋白的影响

目的观察莪术醇对人卵巢癌SKOV3细胞的凋亡作用及对PI3激酶(PI3K)/丝氨酸/苏氨酸激酶(Akt信号通路相关蛋白的影响。方法采用MTT法检测不同浓度莪术醇以及临床常用抗肿瘤药物顺铂对人卵巢癌SKOV3细胞的生长抑制作用;流式细胞仪检测细胞凋亡率及对细胞周期的影响;Western blotting法检测莪术醇、顺铂及其两者联合诱导人卵巢癌SKOV3细胞凋亡过程中PI3K/Akt信号通路蛋白(PI3K、p-PI3K、Akt、pAkt)的表达。结果莪术醇对人卵巢癌SKOV3细胞具有生殖抑制作用,其生殖抑制作用呈剂量-时间正效应关系;莪术醇可以促进人卵巢癌SKOV3细胞的凋亡,细胞凋亡率随着莪术醇浓度增大而增强;不同质量浓度莪术醇处理SKOV3细胞48 h后,细胞周期分布发生明显改变,药物的作用将肿瘤细胞的生长阻止在G0/G1和S期;莪术醇、顺铂及其两者联合在诱导人卵巢癌SKOV3细胞凋亡时,下调了PI3K/Akt信号通路中p-PI3K、p-Akt蛋白的表达水平,且莪术醇和顺铂联合应用时具有协同效应,联合组p-PI3K、p-Akt蛋白表达下调最为明显。结论莪术醇可能通过抑制PI3K/Akt信号通路的激活来阻滞人卵巢癌SKOV3细胞周期,诱导细胞凋亡,进而阻止肿瘤细胞的生长或诱导其分化。