沉默YAP逆转肺癌PC9细胞多柔比星耐药性及其机制研究

背景与目的：耐药性是导致肺癌患者化疗失败的主要原因。探讨YAP对人肺癌PC9细胞多柔比星耐药的逆转作用及其机制。方法：利用体外筛选方法从多柔比星敏感性肺癌细胞系PC9获得耐药细胞克隆,并检测YAP的表达水平;利用shRNA沉默细胞中YAP的表达,应用MTS法检测肿瘤细胞药物敏感性,流式细胞术检测细胞周期、凋亡及对Rh-123的吸收能力,蛋白[质]印迹法(Western blot)和实时定量聚合酶链式反应(quantitative real-time polymerase chain reaction,QRT-PCR)技术检测ABCB1、ABCC1、p53、Runx2、ITGB2和ErbB4的表达水平及丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(serine/threonine kinase,AKT)的磷酸化水平变化。结果：经体外诱导获得多柔比星耐药细胞克隆PC9/Adr,且YAP蛋白在其中高表达,利用shRNA得到不同YAP沉默程度的PC9/Adr。YAP沉默后,细胞生长速度降低,细胞对多柔比星的敏感性显著增加,细胞周期被阻滞在G0/G1期,多柔比星诱导的细胞凋亡增多,细胞吸收Rh-123也增多,并与YAP的沉默程度呈正相关。Western blot和QRT-PCR结果显示,YAP沉默后,ABCB1、ABCC1、Runx2、ITGB2和ErbB4蛋白表达下调,而p53的表达上调,AKT的磷酸化水平则下降。结论：YAP过表达与PC9/Adr的耐药性相关,沉默YAP可恢复PC9/Adr对多柔比星的敏感性。这一作用与调节耐药相关基因的表达、促进细胞凋亡有关。     

Leptin基因沉默对胆囊癌GBC-SD和OCUG细胞系侵袭和迁移能力的影响

背景与目的：研究表明,与肥胖症密切相关的源自脂肪细胞的细胞因子瘦素（leptin）在癌变和肿瘤发生中起着重要作用。通过体外实验观察leptin对人胆囊癌细胞系GBC-SD和OCUG侵袭和迁移能力的影响,探讨其可能的作用机制。方法：将胆囊癌GBC-SD和OCUG细胞分为对照组和实验组。实验组利用小干扰RNA（small interfering RNA,siRNA）技术靶向沉默胆囊癌GBC-SD和OCUG细胞的leptin表达,应用实时荧光定量聚合酶链反应（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,RTFQ-PCR）检测转染效率,通过细胞划痕实验和transwell小室法检测胆囊癌GBC-SD和OCUG细胞的迁移和侵袭能力,采用免疫荧光和免疫细胞化学实验检测siRNA干扰后胆囊癌GBC-SD和OCUG细胞的leptin蛋白水平,利用蛋白质印迹法（Western blot）检测干扰后GBC-SD和OCUG细胞的leptin和p-AKT蛋白表达。结果：细胞划痕实验结果显示,利用siRNA靶向沉默leptin后GBC-SD和OCUG细胞的迁移能力下降（t=26.614,P ＜ 0.01;t=19.338,P ＜ 0.01）。Transwell迁移实验结果显示,利用siRNA靶向沉默leptin后GBC-SD和OCUG细胞的迁移能力也下降（t=7.185,P=0.002;t=8.889,P=0.003）。Transwell侵袭实验结果显示,干扰后GBC-SD和OCUG细胞的侵袭能力下降（t=10.183,P=0.001;t=9.697,P=0.001）。免疫荧光和免疫细胞化学实验结果显示,干扰后GBC-SD和OCUG细胞的leptin蛋白表达下降,Westernblot检测结果表明,靶向沉默GBC-SD细胞后leptin和p-AKT蛋白表达下调（t=26.463,P ＜ 0.01;t=13.904,P ＜ 0.01）,靶向沉默OCUG细胞后leptin和p-AKT蛋白表达也下调（t=21.335,P ＜ 0.01;t=17.914,P ＜ 0.01）。结论：下调GBC-SD和OCUG细胞的leptin表达可抑制细胞侵袭和转移能力,并可能通过AKT信号通路调控胆囊癌细胞的侵袭和迁移。Leptin有望成为胆囊癌治疗的一个重要靶点。     

雷帕霉素对人淋巴瘤Raji细胞株增殖影响及其机制的探讨

目的:探讨雷帕霉素(宜欣可)对人淋巴瘤细胞株Raji细胞体外增殖及细胞周期的影响,并分析其分子作用机制.方法:采用MTT法检测不同浓度(0、1、5、10、20、40、50和100 nmol/L)雷帕霉素作用不同时间(24、48和72 h)对Raji细胞增殖的影响.用流式细胞仪测定雷帕霉素对Raji细胞周期分布和凋亡的影响.应用蛋白质印迹法检测雷帕霉素对Raji细胞周期蛋白Cyclin D1、Cyclin E、Cyclin A和p27及凋亡蛋白抑制因子Survivin蛋白表达的影响.结果:雷帕霉素浓度＞5 nmol/L对Raji细胞增殖有明显的抑制作用(P＜0.05).且呈现明显的剂量-效应和时间-效应依赖关系.雷帕霉素处理后,可明显抑制Raji细胞周期发展(P＜0.05),随着药物浓度的加大、作用时间的延长,处于G0/G1期细胞逐渐增多,S期和G2/M期细胞则逐渐减少.但Raji细胞没有发生明显的凋亡现象(P＞0.05).50 nmol/L雷帕霉素处理后,Raji细胞的Cyclin D1、Cyclin E、p27表达水平没有明显变化(P＞0.05),但Cyclin A和Survivin表达水平被明显抑制(P＜0.05).结论:雷帕霉素通过阻滞细胞周期发展抑制Raji细胞增殖,其作用机制可能与下调细胞Cyclin A和Survivin表达有关.     

siRNA沉默Rac1表达促进增生期血管瘤内皮细胞内质网应激和抑制细胞增殖的作用与机制研究

目的:研究慢病毒介导Rac1沉默对增生期血管瘤内皮细胞内质网应激及Caspase-12活化水平的影响。方法:用Rac1 siRNA慢病毒载体和阴性对照慢病毒载体感染人增生期血管瘤内皮细胞,用Realtime PCR和Western blot检测细胞中Rac1表达变化。MTT法测定细胞增殖能力,PI单染法检测细胞周期变化,Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡变化,Western blot检测细胞中周期蛋白p21、细胞周期蛋白D1（Cyclin D1）和凋亡蛋白活化的Caspase-3（C-Caspase-3）表达水平,同时检测细胞中内质网应激相关蛋白CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白(CHOP)、活化的Caspase-12（C-Caspase-12）表达水平。结果:Rac1 siRNA慢病毒载体感染后的血管瘤内皮细胞中Rac1表达水平明显降低,阴性对照慢病毒对细胞中Rac1表达水平没有影响。沉默Rac1后的增生期血管瘤内皮细胞增殖能力下降,细胞G0/G1比例升高,p21蛋白水平升高,Cyclin D1蛋白水平下降,凋亡率升高,C-Caspase-3蛋白水平升高,CHOP、C-Caspase-12蛋白水平也升高,与没有感染慢病毒的细胞比较,差异有统计学意义（P＜0.05）。阴性对照慢病毒感染对血管瘤内皮细胞增殖、凋亡、细胞周期及细胞中p21、Cyclin D1、C-Caspase-3、CHOP、C-Caspase-12蛋白水平没有影响。结论:慢病毒介导Rac1沉默诱导增生期血管瘤内皮细胞凋亡,阻滞细胞周期,诱导内质网应激发生,诱导Caspase-12活化。     

去甲斑蝥素对人胆囊癌GBC-SD细胞系生长的影响及其机制探讨

目的探讨去甲斑蝥素(NCTD)对人胆囊癌GBC-SD细胞系生长的影响及其机制.方法实验分NCTD组 (7个浓度梯度组,每组6孔)和对照组(n=6),分别应用MTT、流式细胞术、光学和电子显微镜、SABC法检测NCTD对体外培养GBC-SD细胞的杀伤抑制率、细胞周期和凋亡、细胞形态学改变和增殖相关基因蛋白PCNA、Ki-67表达.结果 NCTD在浓度10 μg/ml、时间6 h时即对GBC-SD细胞生长有抑制作用,随浓度升高、时间延长作用增强,呈剂量-时间效应关系.在实验组,流式细胞仪示GBC-SD细胞的G2 M期细胞明显增多,S期细胞减少,凋亡率上升;光镜下出现细胞固缩,胞膜突出,核碎裂和凋亡小体;电镜示微绒毛卷缩、高尔基体、线粒体等细胞器衰退现象和典型凋亡细胞;SABC法检测示PCNA、Ki-67表达阳性的细胞数和阳性指数明显少于对照组(PCNA:0.932±0.031 vs 0.318±0.023;Ki-67:0.964±0.092 vs 0.297±0.018;P<0.001).结论 NCTD能抑制人原发性胆囊癌GBC-SD细胞的生长;其机制可能与其抑制GBC-SD细胞增殖、干扰生长周期、抑制DNA合成代谢、诱导细胞凋亡和影响细胞增殖相关基因蛋白PCNA、Ki-67表达有关.     

沉默MCM7基因介导AKT信号通路参与黑色素瘤细胞增殖及凋亡的实验

目的 探讨MCM7基因沉默介导AKT信号通路参与人皮肤黑色素瘤细胞的增殖及凋亡。方法 构建MCM7基因和沉默MCM7基因表达的慢病毒RNA（LV-shRNA-MCM7）的表达载体;将A375细胞分为Control组、Empty vector转染组（空载质粒转染组）、siRNA（LV-shRNA-MCM7）转染组、siRNA NC（LV-shRNA-MCM7 negative control）转染组;MTT法检测每组细胞增殖;流式细胞术检测细胞周期、细胞凋亡情况;划痕实验法检测细胞迁移能力;qRT-PCR法测定细胞中MCM7基因、AKT信号通路相关基因、Cyclin D1及凋亡相关基因Bcl-2、Bax、caspase-3的相对表达量;Western blot法测定蛋白相对表达量。结果 沉默MCM7后,黑色素瘤细胞中的MCM7基因、CyclinD1、Bcl-2、AKT信号通路相关基因AKT3的mRNA和蛋白相对表达量显著下调（P<0.05）;凋亡相关基因Bax、caspase-3的mRNA和蛋白表达量显著上调（P<0.05）;siRNA转染组凋亡率显著上升,G₀/G₁期细胞数目明显增多,S期细胞数目明显减少;细胞增殖、迁移能力显著下降（P<0.05）。结论 沉默MCM7基因抑制AKT信号通路的激活,从而抑制A375黑色素瘤细胞增殖、迁移,促进A375黑色素瘤细胞凋亡。     

沉默MALAT1上调miR-1表达增加胆囊癌对5-FU的敏感性

目的:明确MALAT1调控miR-1影响胆囊癌（gallbladder carcinoma,GBC）细胞对5-FU敏感性的机制。方法:qRT-PCR检测MALAT1和miR-1在GBC细胞GBC-SD、NOZ和SGC-996中的表达;MTT法和流式细胞术检测正常和5-FU处理的GBC细胞的增殖和凋亡;双荧光素酶报告基因实验检测MALAT1和miR-1的靶向关系。结果:qRT-PCR检测结果显示,与人正常胆囊上皮细胞H69相比,MALAT1在GBC细胞GBC-SD、NOZ和SGC-996中表达上调;双荧光素酶报告基因实验结果显示,MALAT1可靶向调控miR-1,负性调节miR-1的表达;MTT法和流式细胞术检测结果显示,敲低MALAT1抑制GBC细胞的增殖和诱导凋亡,增加GBC细胞对5-FU的敏感性,过表达miR-1结果与敲低MALAT1一致;沉默MALAT1可部分逆转敲低miR-1 inhibitor 对GBC细胞活力、凋亡以及对5-FU药物敏感性的影响。结论:沉默MALAT1 上调miR-1表达,增加GBC细胞对5-FU的敏感性。     

新型拓扑异构酶抑制剂抗肿瘤活性及其机制研究

目的 拓扑异构酶是近年来发现的多种肿瘤化疗的重要靶点,与肿瘤细胞的发生、增殖和发展密切相关.本研究分析两种新型拓扑酶抑制剂的体外抗肿瘤活性,并初步探讨其作用机制.方法 采用MTT法检测两种受试物对人肿瘤细胞增殖的抑制作用;质粒pBR322解旋反应检测抑制剂对TopoⅠ催化活性的影响,蛋白质印迹法检测细胞中Topo Ⅰ和TopoⅡ的蛋白表达变化;Hoechst 33258荧光染色、AO荧光染色、彗星实验和流式细胞术等方法观察两种受试物对HEp-2细胞凋亡和细胞周期的影响.结果 MTT法的结果显示,受试物1和2对9种人肿瘤细胞株均有显著的抗肿瘤活性(P＜0.05),并呈现浓度依赖性;受试物1和2可抑制Topo Ⅰ介导的质粒DNA超螺旋的解旋,并且两种受试物都可下调细胞中Topo Ⅰ、Ⅱ的蛋白表达,P＜0.05;Hoechst 33258荧光染色表明受试物可诱导HEp-2细胞凋亡,AO染色也得到相同的结果;彗星实验检测出两种受试物可导致DNA损伤;流式细胞仪检测的结果表明,处理组的细胞凋亡率高于对照组(P＜0.05),并且,受试物1使HEp-2细胞周期在S期和G2/M期发生阻滞(P＜0.01),而受试物2使其阻滞在G1期(72 h),P＜0.05;蛋白质印迹法结果显示促凋亡蛋白Bid、Bax和JNK表达增加(P＜0.01),抗凋亡蛋白Bcl-2表达减少(P＜0.01),细胞周期蛋白Cyclin B1和Cyclin D1表达减少(P＜0.05).结论 受试物1和2可以抑制HEp-2细胞的生长,这可能与以下机制有关:通过抑制Topo Ⅰ的催化活性并下调细胞中TopoⅠ和TopoⅡ的表达;调控凋亡相关基因的表达,诱导其凋亡;造成肿瘤细胞周期紊乱,促进凋亡.     

组蛋白去乙酰化酶在食管鳞癌中的表达及其表达下调对EC9706细胞生物特性的影响

目的:探讨组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase2,HDAC2)在食管鳞癌组织中的表达,并研究其表达下调对食管鳞癌EC9706细胞增殖、细胞周期和细胞凋亡的影响,以及分析其相关的分子机制。方法:采用免疫组织化学法检测食管鳞癌组织中HDAC2蛋白的表达。将特异性针对HDAC2基因的小分子干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)和对照siRNA分别转染食管鳞癌EC9706细胞,实验分3组:未处理组、对照siRNA组和HDAC2siRNA组。蛋白质印迹法检测各组EC9706细胞中HDAC2蛋白的表达。CCK-8计数法检测转染前后细胞的增殖情况。FCM法检测细胞周期和细胞凋亡的变化。蛋白质印迹法检测与细胞增殖、细胞周期和细胞凋亡相关蛋白的表达变化。结果:HDAC2蛋白在食管鳞癌组织中表达的阳性率为79.71%,显著高于癌旁不典型增生组织的51.11%和正常食管黏膜组织的23.19%,3者之间差异具有统计学意义(χ2=44.121,P=0.000);此外,HDAC2蛋白表达与患者的年龄和性别无关(P均>0.05),但是与组织学分级、浸润深度、TNM分期和淋巴结转移均显著相关(P均<0.05)。HDAC2siRNA能有效下调食管鳞癌EC9706细胞中HDAC2蛋白的表达,明显抑制食管鳞癌EC9706细胞的增殖,促使细胞周期静止在G0/G1期,并诱导细胞凋亡。蛋白质印迹法检测结果显示,HDAC2表达下调能明显提高p21和凋亡相关蛋白bax的表达量,同时降低细胞周期蛋白cyclin D1和bcl-2的表达量。结论:HDAC2可能在食管鳞癌的发生、发展中具有重要作用,其表达下调介导的食管鳞癌细胞增殖抑制、细胞周期静止以及细胞凋亡可能与p21、bax的表达升高和cyclin D1、bcl-2表达降低密切相关。     

新藤黄酸诱导人结肠癌HCT116细胞凋亡的作用机制研究

目的:探讨新藤黄酸诱导人结肠癌HCT116细胞凋亡的作用及其可能的分子机制。方法:采用MTT法检测新藤黄酸对人结肠癌HCT116细胞增殖的抑制作用;DAPI染色及荧光显微镜观察细胞凋亡情况;FCM法检测细胞周期分布;蛋白质印迹法检测新藤黄酸对cyclin D1、cyclin E、P21、P27和多聚ADP核糖聚合酶[poly(ADP-ribose)polymerase,PARP]蛋白表达的影响。结果:新藤黄酸对HCT116细胞增殖有明显的抑制作用,并呈浓度和时间依赖性。DAPI染色后荧光显微镜观察发现,新藤黄酸能明显诱导HCT116细胞凋亡。FCM法检测发现,新藤黄酸可以使HCT116细胞G0/G1期比例显著升高,S期比例相应降低,表明细胞周期阻滞于G0/G1期。蛋白质印迹法检测结果表明,新藤黄酸下调了细胞周期蛋白cyclin D1和cyclin E的表达,上调了P21和P27的蛋白表达,诱导了PARP蛋白的剪切。结论:新藤黄酸通过下调细胞周期蛋白cyclin D1、cyclin E的表达和上调P21、P27的表达,使HCT116细胞阻滞在G0/G1期,进而显著抑制HCT116细胞的增殖,并诱导其凋亡。     

miR-21沉默下调β-catenin表达对食管癌细胞增殖和凋亡的影响

目的:探讨miR-21沉默对食管癌细胞增殖和凋亡的影响及其与β-catenin表达的关系。方法:通过脂质体转染法沉默食管癌Eca9706细胞株中的miR-21,采用荧光定量（RT-PCR）检测miR-21、β-catenin mRNA的相对表达水平;蛋白质印迹法（Western blot）检测β-catenin蛋白的相对表达水平。MTT法检测细胞增殖能力,流式细胞仪检测细胞凋亡和细胞周期。结果:转染48 h后,与对照组和NC组相比,miR-21组Eca9706细胞中miR-21、β-catenin mRNA和β-catenin蛋白的相对表达水平均明显降低。MTT检测miR-21组细胞的光密度值（OD值）较对照组和NC组明显下降。与NC组和对照组相比,流式细胞仪检测miR-21组中细胞的凋亡率明显上升,G0/G1期细胞所占比例明显升高,S期细胞所占比例明显下降。结论:沉默miR-21能够通过下调β-catenin的表达来抑制食管癌Eca9706细胞增殖及诱导其凋亡。     

miR-214通过PTEN调控AKT信号通路抑制鼻咽癌细胞凋亡CSCD

目的探讨miR-214通过PTEN调控下游AKT信号通路激活对鼻咽癌细胞凋亡的影响。方法miR-214抑制剂转染鼻咽癌5-8F和6-10B细胞。MTT法评估细胞增殖情况。Annexin-V/PI染色法检测两种鼻咽癌细胞凋亡情况。Western blot和real-time PCR检测miR-214抑制剂对PTEN基因转录和蛋白表达以及对AKT信号通路和凋亡相关蛋白表达水平的影响。检测shRNA沉默PTEN基因转录和蛋白表达后,miR-214抑制剂对鼻咽癌细胞凋亡影响。结果miR-214抑制剂可抑制鼻咽癌细胞生长,诱导5-8F和6-10B细胞凋亡。miR-214通过靶向3'-UTR区域调控PTEN基因转录和蛋白表达。抑制miR-214可促进PTEN的表达,抑制AKT信号通路激活,进而调控下游细胞周期和凋亡相关蛋白表达。沉默PTEN基因转录和蛋白表达可逆转miR-214抑制剂对鼻咽癌细胞AKT信号通路活性和凋亡的影响。结论miR-214可通过直接靶向PTEN基因转录促进AKT信号通路激活抑制鼻咽癌细胞凋亡。     

Celecoxib对胆囊癌细胞GBC-SD增殖的抑制作用

目的研究Celecoxib对人胆囊癌细胞GBC-SD生长和凋亡的影响及其作用机制.方法采用免疫细胞化学SABC法检测GBC-SD环氧合酶-2(Cox-2)蛋白表达,采用四唑氮蓝(MTT)比色法检测细胞增殖,流式细胞仪测定细胞周期和凋亡,酶联免疫吸附试验(LISA)检测前列腺素E2(PGE2)含量.结果 Celecoxib可下调GBC-SD细胞Cox-2蛋白表达.Celecoxib抑制GBC-SD细胞增殖作用呈时间依赖性,作用2天后就有轻度抑制,第3、第4和第5天抑制作用已相当明显(P<0.05,与对照组相比),并且这种增殖抑制作用能被200 g/ml GE2拮抗.Celecoxib诱导GBC-SD细胞G1-S期阻滞,40 μmol/L(P<0.05)和20 μmol/L(P<0.05)Celecoxib组G0-G1 期细胞含量比对照组( μmol/L)明显增高,而S期和G2/M期细胞含量比对照组明显降低(P<0.05).40 μmol/L(P<0.05)和20 μmol/L(P<0.05)Celecoxib处理48 后GBC-SD细胞凋亡率明显上升.结论 Celecoxib通过Cox-2和PGE2途径抑制GBC-SD细胞生长和诱导凋亡.     

生理范围直流电场对肺癌细胞凋亡及细胞周期影响的观察

目的:研究生理范围直流电场对人肺腺癌细胞系A549细胞的凋亡及细胞周期的影响。方法:按A549肺癌细胞是否暴露于1.5 V/cm直流电场及暴露时间分为A,B,C 3组,A组为未暴露电场的对照组,B组暴露于电场12 h,C组暴露于电场24 h。Hochest33258荧光染色及流式细胞仪检测各组细胞凋亡值及凋亡比率。流式细胞仪检测各组细胞周期,Western blot检测各组细胞中ERK、AKT及两者矿磷酸化水平pERK、pAKT的量,同时检测各组细胞中细胞周期蛋白Cyclin D1与Cyclin E,细胞周期抑制蛋白p21与p27的表达量。结果:荧光染色结果显示A、B、C 3组凋亡细胞比率分别为0.89%、1.15%及0.98%,差异无统计学意义,P>0.05。流式细胞结果显示A、B、C 3组凋亡细胞比率分别为1.06%、1.18%及0.92%,差异无统计学意义,P>0.05;与A组细胞相比,B、C 2组细胞周期S期和G2期的比例升高明显B组两者和升高9.72%,C组升高20.08%。Western blot检测提示电场促进ERK与AKT蛋白磷酸化水平,同时促进细胞周期蛋白Cyclin D1与CyclinE的表达,抑制了细胞周期抑制蛋白p21与p27的表达。结论:肺癌A549细胞暴露于1.5 V/cm大小的体外直流电场后,凋亡比率无变化,细胞周期明显改变,且细胞增生更为活跃,此变化可能是由于电场激活了ERK与AKT信号通路,从而影响细胞周期相关蛋白有关。     

TNF-α诱导Molt-4细胞Bcl-2蛋白磷酸化的周期特异性

目的以肿瘤坏死因子-α诱导的Molt-4细胞凋亡为模式,观察Bcl-2蛋白磷酸化有无细胞周期特异性,探讨膜受体途径介导的细胞凋亡的周期特异性发生机制。方法TNF-α诱导Molt-4细胞凋亡,API法检测细胞凋亡的细胞周期特异性。流式细胞仪分选各个细胞周期时相的细胞群,蛋白免疫印迹检测Bcl-2蛋白的细胞周期特异性表达。结果TNF-α诱导Molt-4细胞凋亡主要发生在细胞周期的G1期。Bcl-2蛋白在TNF-α诱导后表达增加,G1期Molt-4细胞中bcl-2部分磷酸化,在时间上与凋亡发生的时间一致。结论加入TNF-α培养的Molt-4细胞Bcl-2蛋白磷酸化失活与细胞凋亡的细胞周期时相一致,具有细胞周期特异性。     

Gefitinib抑制人胶质瘤U251细胞生长分子机制研究

目的:研究Gefitinib对人胶质瘤U251细胞的生长抑制作用及相关机制.方法:用四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法检测不同浓度Gefitinib对U251细胞增殖活性的效应.流式细胞术(FCM)分析Gefitinib对U251细胞周期以及凋亡的影响,蛋白质印迹法检测周期、凋亡相关蛋白表达量的变化.罗丹明123/PI双染流式细胞术与吖啶橙(AO)染色荧光显微镜分析凋亡.结果:Gefitinib能显著抑制U251细胞的增殖,并呈剂量依赖关系,半数抑制浓度(IC50)为18.01 μmol/L.通过流式、荧光染色以及蛋白质印迹检测分析发现,随着浓度的增加,Gefitinib能明显阻滞U251细胞于G0/G1期,主要通过降低线粒体膜电位诱导细胞凋亡,0、10、20和40 μmol/L浓度处理后细胞凋亡率分别为1.28％、4.48％、77.97％和90.59％.Gefitinib对U251细胞的周期阻止与诱导凋亡主要是下调细胞周期依赖蛋白激酶CDK2、CDK4和CDK6的表达,同时上调p27Kip1的表达,引起细胞周期阻滞.上调、活化凋亡相关蛋白Bax,下调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达,导致线粒体膜电位降低,活化Caspase-9,诱导细胞凋亡.结论:Gefitinib在15～60 μmol/L浓度范围内,能明显抑制U251细胞的增殖并能通过周期阻滞诱导其凋亡,其作用呈浓度依赖关系.主要通过下调周期依赖蛋白激酶的表达阻滞U251细胞于G0/G1期,降低线粒体膜电位,活化Caspase途径诱导U251细胞凋亡.     

ERK/MAPK信号通路活性表达与鼻咽癌细胞增殖凋亡的关系

目的:探讨鼻咽癌细胞中ERK/MAPK信号传导通路异常激活与细胞增殖凋亡的关系.方法:SP法检测36例鼻咽癌、42例对照鼻咽黏膜上皮中p-ERK,Cyelin D1 和Ki-67蛋白的表达.用不同浓度阻滞刺PD98059处理CNE-2Z细胞,Hoechst33342/PI荧光双染法观察细胞凋亡,流式细胞仪检测凋亡,蛋白质印迹法检测Cyclin D1蛋白表达,免疫细胞化学法检测tyERK、Cyclin D1 和Ki-67蛋白的表达.结果:鼻咽癌组织中p-ERK、Cyclin D1和Ki-67的阳性表达率分别为69.44%(25/36)、80.56%(29/36)和80.56%(29/36),鼻咽黏膜上皮组织中则分别为23.80%(10/42)、19.05%(8/42)和9.52%(4/42),P<0.01.鼻咽癌组织中p-ERK-与Cyelin D1、Ki-67蛋白的表达呈正相关,r分别为0.604和0.668,P均<0.01.不同浓度PD98059作用于CNE-2Z细胞后,可观察到凋亡细胞,检测到凋亡峰,Cyclin D1蛋白表达的减少呈剂量依赖性,p-ERK、Cyclin D1和Ki-67蛋白的阳性表达细胞数减少.结论:鼻咽癌组织及CNE-2Z细胞中存在p-ERK蛋白的高表达和活化异常,p-ERK可能通过上调Cyclin D1和Ki-67的表达促进鼻咽癌细胞增殖并抑制凋亡.ERK信号通路有可能成为鼻咽癌治疗的新靶点.     

蛋白激酶D抑制剂SD-208对非小细胞肺癌细胞增殖及凋亡的影响

目的 探讨蛋白激酶D抑制剂SD-208对非小细胞肺癌细胞增殖、凋亡及细胞周期的影响。方法 采用5、10、20、30 μmol／L SD-208处理非小细胞肺癌细胞A549（设不加SD-208仅添加完全培养基组为对照组）,分别在24、48、72 h 3个不同刺激时间点应用四甲基偶氮唑盐比色（MTT）法检测A549细胞的吸光值并计算增殖抑制率;膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素（Annexin V-FITC）和碘化丙啶（PI）双染色法结合流式细胞术检测不同浓度SD-208处理A549细胞24、48 h后的细胞凋亡情况,PI染色法流式细胞仪检测分析不同浓度SD-208处理A549细胞48 h后细胞周期时相分布情况;Western blotting检测不同浓度SD-208处理48 h后的细胞周期蛋白A（Cyclin A）、Cyclin D1、Cyclin E、细胞周期蛋白依赖性激酶4（CDK4）和p16蛋白的表达水平。结果 SD-208 可抑制A549细胞的增殖,且呈剂量和时间依赖性（P＜0.05）;SD-208处理后A549细胞的凋亡率及G0／G1期细胞比例均高于对照组,而S、G2／M期细胞比例均低于对照组,各浓度间的差异均有统计学意义（P＜0.05）;与对照组比较,SD-208处理后的Cyclin D1和CDK4蛋白水平降低,p16蛋白水平升高,差异均有统计学意义（P＜0.05）。SD-208处理对A549细胞Cyclin A和Cyclin E蛋白水平无影响,与对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。结论 SD-208可抑制A549细胞增殖并诱导细胞凋亡及G0／G1期阻滞,其机制可能与其影响细胞周期及相关调控蛋白水平有关。     

VEGF和Smac/DIABLO对胶质瘤细胞凋亡及化疗敏感性的影响

目的:旨在研究血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)和第二线粒体衍生的caspase激活剂(second mitochondrial activator of caspase,Smac)/低等电点凋亡抑制蛋白直接结合蛋白(direct IAP binding protein with low PI,DIABLO)在胶质瘤发生和发展中的作用。方法:采用慢病毒介导的RNA干扰技术沉默VEGF基因在胶质瘤细胞U251中的表达;分别采用实时荧光定量PCR(real-time?uorogenic quantitative-PCR,RFQ-PCR)和蛋白质印迹法检测VEGF和Smac/DIABLO mRNA及蛋白在U251细胞中的表达水平;采用蛋白质印迹法检测磷酸化细胞外蛋白调节激酶(extracellular regulated protein kinase,ERK)的表达;FCM检测VEGF沉默对细胞周期的影响;MTT法检测VEGF沉默对U251细胞化疗敏感性的影响。结果:VEGF基因沉默可导致VEGF和Smac/DIABLO mRNA及蛋白表达水平的下调,并抑制磷酸化ERK的表达,提示VEGF是Smac/DIABLO的上游调节因子,通过激活ERK的信号通路调节Smac/DIABLO的表达水平。VEGF基因沉默导致U251细胞中处于S期的细胞比例增多,并增强顺铂对U251细胞的凋亡诱导作用。结论:VEGF可影响胶质瘤细胞周期的分布以及对顺铂的化疗敏感性。Smac/DIABLO参与了VEGF信号通路。     

Stellettin B对非小细胞肺癌细胞增殖与凋亡的影响

目的 探讨Stellettin B 对非小细胞肺癌细胞增殖和凋亡的影响及可能的作用机制。方法采用四甲基偶氮唑盐（MTT）比色法检测不同浓度（01、1、10、100μmol／L）Stellettin B处理A549细胞和NCI-H1299细胞24、48、72和92h的增殖抑制率;采用Hoechst染色检测处理A549细胞24、48h后的凋亡指数;流式细胞术Annexin-FITC／PI双染法和PI染色法分别检测处理A549细胞48h后的凋亡率和细胞周期分布情况;采用Western blotting检测处理48h后A549细胞周期相关蛋白（Cyclin A、CDK2及p21CIP1）的表达水平。结果 不同浓度Stellettin B可显著增强对A549细胞的增殖抑制作用,且呈剂量和时间依赖性（P＜0.05）。不同浓度Stellettin B处理24、48h后,A549细胞的凋亡指数、凋亡率均升高且呈剂量依赖性（P＜0.05）。随着Stellettin B浓度的增加,G0／G1期细胞比例及p21CIP1蛋白的表达水平逐渐升高,S和G2／M期细胞比例及Cyclin A和CDK2蛋白的表达水平逐渐降低,差异均有统计学意义（P＜0.05）。结论 Stellettin B 可抑制A549细胞增殖并诱导细胞凋亡及细胞周期阻滞,可能与其对细胞周期相关蛋白表达的调控有关。