沙门菌致病岛1蛋白促进神经母细胞瘤Warburg效应的作用及分子机制

目的探讨沙门菌致病岛1(SPI1)蛋白在神经母细胞瘤中调控有氧糖酵解(即Warburg效应)的作用及分子机制。方法运用公用数据库,解析神经母细胞瘤中调控Warburg效应的候选关键转录因子SPI1;经嘌呤霉素筛选,获得稳定过表达/敲低SPI1的SK-N-BE(2)细胞株,分为空载体对照(Mock)组、SPI1过表达(SPI1)组、随机干扰(sh-Scb)组、SPI1干扰(sh-SPI1)组;实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)、染色质免疫共沉淀、双荧光素酶报告基因及蛋白质印迹法(Western blot)检测靶基因启动子活性和表达水平;分光光度计法和糖酵解压力试验检测有氧糖酵解水平;软琼脂克隆形成和基质胶侵袭检测瘤细胞的增殖和侵袭活性。组间比较采用t检验。结果SPI1组己糖激酶2(HK2)表达高于Mock组(3.63±0.53比1.00±0.05,t=17.462,P<0.05),磷酸甘油酸激酶1(PGK1)表达高于Mock组(3.28±0.39比1.00±0.03,t=17.651,P<0.05),细胞外酸化率(ECAR)高于sh-Scb组[(32.17±3.15)mpH/min比(9.82±1.49)mpH/min,t=10.352,P<0.05],克隆形成数高于Mock组[(163.30±7.59)个比(48.02±4.85)个,t=17.840,P<0.05],侵袭细胞数高于Mock组[(184.70±10.58)个比(88.33±5.56)个,t=8.214,P<0.05]。sh-SPI1组HK2表达低于sh-Scb组(0.33±0.02比1.00±0.04,t=14.370,P<0.05),PGK1表达低于sh-Scb组(0.34±0.02比1.00±0.03,t=19.192,P<0.05),ECAR值低于sh-Scb组(3.07±0.48比10.05±1.37,t=7.580,P<0.05),克隆形成数低于sh-Scb组[(21.33±3.96)个比(44.67±5.69)个,t=5.916,P<0.05],侵袭细胞数低于sh-Scb组[(40.67±3.48)个比(88.00±6.89)个,t=4.994,P<0.05],差异均有统计学意义。结论转录因子SPI1通过增强HK2和PGK1表达,促进神经母细胞瘤的Warburg效应和肿瘤进展。     

下调垂体肿瘤转化基因1表达对前列腺癌LNCaP-AI细胞衰老的影响

目的:探讨下调垂体肿瘤转化基因1(PTTG1)的表达对人去势抵抗前列腺癌LNCaP-AI细胞衰老的影响。方法:采用体外诱导的人去势抵抗前列腺癌LNCaP-AI细胞模型, LNCaP-AI细胞转染靶向PTTG1基因的siRNA为siRNA-PTTG1组,只添加转染试剂为Mock组,转染阴性序列为NC组。于含雄激素培养液(FBS)/去除雄激素培养液(CSS)中培养各组细胞,细胞计数实验比较各组细胞数量变化。采用细胞衰老-β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)染色试剂盒检测衰老细胞数目;Western印迹检测β-半乳糖苷酶蛋白1(Glb1)、细胞周期相关蛋白(p-21~(CIP1)、p-27~(Kip1))、异染色质蛋白1γ(HP1γ)的表达情况。结果:siRNA有效抑制了LNCaP-AI细胞中PTTG1的表达。siRNA-PTTG1组在FBS中培养,细胞数量增加,而在CSS中培养,细胞数量呈减少趋势;Mock组及NC组在上述不同培养液中细胞数量均呈增长趋势,siRNA-PTTG1组与Mock组和NC组比较差异有统计学意义(P0.05)。SA-β-Gal染色检测衰老细胞数量,Mock组、NC组、siRNA-PTTG1组细胞染色阳性率分别为(11.3±1.24)%、(12.4±1.15)%、(63.5±2.35)%,siRNA-PTTG1组显著高于Mock组和NC组(P0.05)。Western印迹检测转染效率显示Mock组、NC组及siRNA-PTTG1组中PTTG1相对表达量分别为0.56±0.02、0.61±0.02、0.21±0.01,p-21~(CIP1)相对表达量分别为0.20±0.02、0.21±0.03、0.32±0.03,p-27~(Kip1)相对表达量分别为0.20±0.03、0.22±0.01、0.38±0.02,GlB1相对表达量为0.13±0.01、0.15±0.01、0.24±0.01,HP1γ相对表达量分别为0.26±0.01、0.27±0.02、0.41±0.01;siRNA-PTTG1组与Mock组和NC组比较差异均有统计学意义(P0.05)。结论 :下调PTTG1基因表达可促进人去势抵抗前列腺癌细胞株LNCaP-AI细胞衰老。     

干扰肿瘤微环境基础上调控双唾液酸神经节苷脂表达提高神经母细胞瘤免疫疗效

目的探讨靶向抑制髓系抑制细胞(MDSC)调控双唾液酸神经节苷脂(GD2)表达提高神经母细胞瘤(NB)免疫疗效的可行性和机制。方法采用神经母细胞瘤SK-N-SH细胞注射BALB/c小鼠(河北省实验动物中心)建立NB荷瘤模型, 共120例, 采用随机数字表法随机分组为对照组、多巴胺(DA)50 mg/kg组、阿霉素(DOX)2.5 mg/kg组和DOX 5.0 mg/kg组, 每组30例。在肿瘤细胞接种后7 d和12 d, 分别对各组小鼠实施DA或DOX鼠尾静脉注射, 了解不同用药组瘤体内MDSC浸润比例, 选择调控MDSC最佳药物及浓度;同时检测各组瘤体β1, 4-N-乙酰半乳糖胺转移酶(GalNAcT)水平、GD2抗原表达情况, 观察其与MDSC浸润比例和瘤体生长相关性。进一步在干扰肿瘤微环境基础上实施抗GD2免疫治疗, 对比各组免疫疗效。结果各用药组肿瘤生长曲线(F=11.397, P<0.01)、MDSC比例(F=14.632, P<0.01), GalNAcT mRNA水平(F=157.527, P<0.01)、GD2抗原表达(F=173.134, P<0...     

转录因子E2F-3靶向FOSB对结直肠癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响

目的探究转录因子E2F-3对结直肠癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响。方法在体外培养人的结直肠癌细胞系RKO、SW480、DLD1、LOVO和人的结肠正常上皮细胞NCM460, 并用反转录实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测结肠上皮细胞NCM460和结直肠癌细胞SW480、RKO、DLD1、LOVO中E2F-3的转录水平。分别将E2F-3的siRNA-E2F3和siRNA-NC阴性对照转染于细胞系RKO中, 设为实验组(si-E2F3)与阴性对照组(NC)。采用平板克隆实验细胞与细胞计数试剂盒(CCK-8)检测细胞增殖活性。Transwell迁移和侵袭实验与细胞划痕实验用来检测细胞的迁移及侵袭能力。RT-qPCR和蛋白质印迹法(Western blot)分别可以检测E2F-3靶向蛋白FOSB的表达水平。两样本间对比采取t检验, 多组间差异采用单因素方差分析。结果 miR-210-3p在结直肠癌细胞系中表达均高于人正常结肠上皮细胞, 其中以RKO中升高最为明显, 相较NC[(2.349±0.095)倍比(1.000±0.013)倍, t=65.82, P<0.01], 差异有统...     

E2F1对前列腺癌的细胞周期与凋亡的调控

目的探讨E2F1转录因子对前列腺癌细胞的细胞周期及凋亡的影响。方法从高通量基因芯片结果中获得前列腺癌相关差异表达基因E2F1,进一步通过E2F1抑制及过表达质粒转染前列腺癌细胞,运用流式细胞技术检测转染后前列腺癌细胞的细胞周期及细胞凋亡变化。结果DU145/LNCa P转染质粒后,对照于空白组,转染si E2F1的细胞株,E2F1表达量明显下降(DU145:抑制率=77.30%,P0.01;LNCa P:抑制率=79.89%,P0.01);转染了Hi-E2F1的细胞株,E2F1表达量明显升高(DU145:倍数=8681,P0.01;LNCa P:倍数=14424,P0.01)。细胞周期实验结果显示,与空白组对比,抑制E2F1表达后的DU145及LNCa P细胞株细胞周期明显被抑制(P0.05);高表达E2F1的LNCa P细胞株的细胞周期缩短(P0.05),而在DU145细胞株中无明显差异。细胞凋亡实验发现,抑制E2F1表达后的DU145和LNCa P细胞株细胞凋亡明显增加(DU145 P0.01;LNCa P P0.05);相反,高表达E2F1后,细胞凋亡明显减少(P0.05)。结论 E2F1可使前列腺癌细胞的细胞周期缩短,并抑制前列腺癌细胞凋亡,这说明E2F1在前列腺中确实起着促癌的作用。     

沉默长链非编码RNA特异性核基质结合区结合蛋白1-AS1对前列腺癌细胞增殖和迁移侵袭能力的影响

目的观察沉默长链非编码RNA(lncRNA)特异性核基质结合区结合蛋白1(SATB1)-AS1对前列腺癌细胞增殖和迁移侵袭能力的影响, 探究其机制。方法采用小干扰RNA(siRNA)沉默前列腺癌细胞株(22RV1、LNCAP)内SATB1-AS1表达。采用细胞计数试剂盒(CCK-8)实验检测细胞的体外增殖能力;平板克隆实验检测单细胞克隆形成能力;TransWell实验检测细胞体外迁移侵袭能力;通过蛋白质印迹法(Western blot), 检测细胞经不同处理后上皮-间充质转化(EMT)相关蛋白表达情况。两组间比较采用独立样本t检验, 多组间比较采用单因素方差分析(ANOVA)检验。结果成功沉默22RV1与LNCAP细胞内SATB1-AS1的表达。CCK-8结果显示, 敲低组细胞增殖能力低于相应对照组(0.875±0.021、1.288±0.009和1.237±0.036、1.496±0.041, F=18.657, P<0.05)。平板克隆结果显示, 敲低组细胞的单个细胞克隆形成能力低于相应对照组细胞(45.00±5.21、50.00±3.67和87.00±5.78、108.00...     

RARS2基因表达对胰腺癌细胞增殖、侵袭、迁移及化疗敏感性的影响

目的研究线粒体精氨酰-tRNA合成酶(RARS2)基因表达对胰腺癌细胞增殖、侵袭、迁移及化疗敏感性的影响。方法人胰腺癌细胞株AsPC-1及PANC-1分别设置阴性对照组、RARS2干扰组-1、RARS2干扰组-2、过表达对照组、RARS2过表达组, 通过瞬时转染法降低或过表达RARS2。细胞计数CCK-8法检测细胞增殖以及化疗敏感性, 采用Transwell检测细胞侵袭及迁移。采用Western印迹检测RARS2在不同浓度及不同时间吉西他滨作用下的表达。Western印迹与聚合酶链式反应检测耐药株RARS2表达。结果在胰腺癌细胞AsPC-1及PANC-1中, 干扰降低RARS2的表达可以显著抑制细胞增殖能力, 增强吉西他滨化疗敏感性;过表达RARS2后细胞增殖能力增强, 吉西他滨化疗敏感性降低。在AsPC-1细胞中, 阴性对照组、RARS2干扰组-1、RARS2干扰组-2、过表达对照组、RARS2过表达组迁移细胞数(100倍显微镜下)(586.7±37.4)个/视野、(195.7±18.6)个/视野、(237.0±17.1)个/视野、(157.7±19.1)个/视野、(456.0±23...     

长链非编码RNA MALAT-1通过EZH2-β-catenin信号通路调控肾癌细胞的增殖、凋亡及侵袭

目的探究长链非编码RNA肺腺癌转移相关转录因子1(LncRNA MALAT-1)在肾癌组织及肾细胞癌(RCC)细胞株中的表达情况及其在调控RCC细胞增殖、凋亡及侵袭过程中的作用机制。方法利用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)实验检测正常和RCC组织以及HK-2、786-O、ACHN及Caki-1细胞中MALAT-1的表达情况;将786-O细胞随机分为3组,分别转染MALAT-1-siRNA沉默载体(si-MALAT-1组)及MALAT-1-siRNA阴性表达载体(si-NC组),空白对照组加入PBS(Blank组)。采用CCK-8法、流式细胞术法、Transwell法检测细胞增殖、凋亡及侵袭能力;利用Western blot法检测Zeste基因同源物增强子2(EZH2)及β-catenin的蛋白表达水平。结果与正常组织及细胞株HK-2相比,肾癌组织及细胞株786-O、ACHN及Caki-1中MALAT-1的表达水平明显增加(P<0.05);与Blank组和si-NC组相比,si-MALAT-1组RCC细胞活性和侵袭能力明显降低、细胞凋亡率明显增加、EZH2及β-catenin的蛋白表达水平明显升高(P<0.05)。结论LncRNA MALAT-1在肾癌组织及RCC细胞中表达上调;抑制MALAT-1的表达能够抑制RCC细胞的增殖和侵袭,促进凋亡,其机制可能与下调EZH2-β-catenin信号通路的表达有关。     

微小RNA-20b-5p/E2F转录因子5介导转化生长因子-β1调节前列腺癌细胞上皮-间充质转化的作用机制研究

目的探讨前列腺癌细胞中微小RNA(miR)-20b-5p/E2F转录因子5(E2F5)介导转化生长因子-β1(TGF-β1)调节前列腺癌细胞上皮-间充质转化(EMT), 从而促进前列腺癌发生发展的作用机制。方法分析数据库, 预测miR-20b-5p的靶基因, 双荧光报告基因检测miR-20b-5p对E2F5 mRNA的3’UTR的靶向抑制。E2F5的野生型(WT)及突变型(Mut)的3’端非编码区(3’UTR)分别转染PC3和DU145细胞后, 再做TGF-β处理, 双荧光报告基因检测E2F5是否是TGF-β和miR-20b-5p的共同靶点。蛋白质印迹法(Western blot)检测miR-20b-5p对E2F5的靶调节。PC3和DU145细胞分别转染miR-20b-5p抑制剂和模拟物及其对照RNA后, Western blot检测miR-20b-5p对E2F5的靶调节。分别取两组前列腺增生和前列腺癌组织进行mRNA基因测序, 比较两者E2F5的表达。PC3细胞敲低miR-20b-5p的同时也敲低E2F5, Western blot检测EMT相关基因E-钙黏蛋白(E-cadherin...     

细胞衰老相关分子机制及鉴定的研究进展

细胞衰老指的是细胞发生稳定的、不可逆的细胞周期停滞现象, 是导致机体衰老的基本机制之一。最近的研究表明, 细胞衰老代表了一系列广泛, 动态且具有高度异质性的细胞状态, 发生衰老的细胞具有独特的表型改变。细胞衰老的主要原因是细胞损伤引起的抑癌基因如p16, p21或p53的激活, 从而导致细胞周期的停滞。发生衰老的细胞通过激活NF-κB通路和C/EBP家族通路可以向细胞外分泌细胞因子, 即衰老相关的分泌表型(SASP);其中SASP因子如转化生长因子-β(TGF-β)、胰岛素样生长因子结合蛋白1(IGFBP-1)以及白细胞介素-1α(IL-1α)、白细胞介素-6(IL-6)等炎性因子会以自分泌或旁分泌的方式维持或诱导更多衰老细胞的产生, 而SASP的不断累积也会促进组织的崩解和重构, 从而影响器官功能。衰老细胞与老年性疾病的关系是当今的研究热点, 研究表明, 清除衰老细胞可以延长寿命并延缓心血管、大脑和骨骼退行性疾病的进展。虽然相关研究已取得一定的进展, 但由于衰老细胞的鉴定和分离尚存在困难, 故研究成果需进一步证实。而对细胞衰老的发生机制及鉴定进行综述, 有利于进一步了解细胞衰老的分子...     

过表达肌球蛋白磷酸酶靶亚基1对前列腺癌细胞迁移侵袭能力的影响

目的探讨前列腺癌细胞内肌球蛋白磷酸酶靶亚基1(MYPT1)的表达变化及其对侵袭转移能力的影响。方法设计合成过表达MYPT1基因的慢病毒质粒(pLenti6.3-MYPT1), 转染前列腺癌PC3及DU145细胞48 h, 设定对照组(转染对照pLenti6.3-Ctrl)和过表达组(转染pLenti6.3-MYPT1);采用细胞划痕和Transwell实验检测24 h及48 h细胞迁移和侵袭能力;免疫荧光(IF)染色检测细胞骨架变化;蛋白质印迹法(Western blot)和定量聚合酶链式反应(qPCR)检测细胞株(PC3、DU145)转染后MYPT1和上皮-间充质转化(EMT)相关分子标志物:N-钙黏蛋白(N-cadherin)、基质金属蛋白酶2(MMP-2)、基质金属蛋白酶9(MMP-9)、锌指结构蛋白(Snail)和E盒结合锌指蛋白1(ZEB-1)的mRNA及蛋白相对表达水平。组间统计分析采用独立样本t检验。结果转染pLenti6.3-MYPT1后, PC3和DU145细胞内MYPT1相对表达水平明显上调, 差有统计学意义(Western blot:0.834±0.055、0.8...     

干扰多亮氨酸重复区免疫球蛋白样蛋白1促进人胶质母细胞瘤U251细胞株侵袭性的机制

目的 探讨干扰多亮氨酸重复区免疫球蛋白样蛋白1(LRIG1)基因表达促进人胶质母细胞瘤U251细胞株侵袭性的机制.方法 用携带U6启动子的LRIG1特异性短发夹RNA (shRNA)序列的质粒载体pGenesil2-LRIG1-shRNA (siRNA)及含非特异shRNA编码序列的对照质粒pGenesil2-negative shRNA(neg)转染U251细胞株,通过G418筛选,鉴定得到稳定转染细胞株.采用侵袭实验验证干扰LRIG1对U251侵袭性的影响,通过明胶酶谱实验检测基质金属蛋白激酶(MMP)-2、MMP-9的活性,Western blot法检测表皮生长因子(EGFR)及其下游丝裂原激活蛋白激酶/细胞外信号调节激酶(MAPK/ERK)、磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B( P13K/AKT)信号通路蛋白的表达差异.结果 含U6启动子LRIG1 shRNA序列的质粒转染干扰组LRIG1 mRNA降低至对照组(35.3％～39.2％,P＜0.05).干扰LRIG1表达组U251细胞侵袭数[(159±15)～ (188±9)/视野],较空白对照组细胞侵袭数[(28±9)/视野]明显增多(P＜0.05);干扰LRIG1激活EGFR通路传导;干扰LRIG1后干扰组MMP-2较对照组活性增加(1.66±0.11～1.96±0.12,P＜0.01),MMP-9干扰组较对照组活性增加(4.82±0.27～4.47±0.29).结论 LRIG1表达下调后MMP-2、MMP-9活性增强,从而促进U251细胞的侵袭性,可能通过激活EGFR信号通路引起.     

腺病毒介导的RNA干扰对大肠癌HCT116细胞株β-连环蛋白表达的抑制作用

目的 构建针对人β-连环蛋白(catenin)的腺病毒载体pAdHl-shβ-catenin-GFP,应用RNA干扰(RNAi)的方法,观察其在体内和体外对人大肠癌细胞株HCT116生长的抑制作用.方法 设计合成针对β-catenin的shRNA,并克隆至腺病毒表达载体AdH1-GFP上,制备针对β-catenin的腺病毒载体AdH1-GFP-shβ-catenin-GFP,与腺病毒骨架载体共转染293A细胞包装病毒,采用空斑法测定病毒滴度为5×109pfu/ml,感染HCT116细胞.应用Western bolt和报告基因检测HCT116细胞β-cmemn表达水平和转录活性,噻唑蓝(MTT)比色法测定活细胞数并绘制细胞生长曲线,建立软琼脂克隆形成实验观察肿瘤体外成瘤能力,同时建立裸鼠HCT116细胞移植瘤模型,观察肿瘤生长情况.结果 成功构建针对β-catenin基因的RNAi腺病毒表达载体,与AdH1-GFP组比较AdH1-shβ-catenin-GFP组在感染24 h和48 h HCT116细胞β-catenin表达水平和转录活性显著降低,细胞的增殖和克隆形成能力则下降50%(P<0.01).体内实验表明重组腺病毒载体介导的β-catenin shRNA明显抑制肿瘤生长(P<0.01).结论 腺病毒介导的RNAi技术可有效降低β-catenin在大肠癌细胞中的表达水平,抑制肿瘤细胞在体内外的增殖活性.     

Rac1基因沉默对髓母细胞瘤细胞侵袭移动的影响

目的 观察Rac1基因沉默后对髓母细胞瘤细胞侵袭移动的影响.方法 用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot方法检测Rac1 mRNA和蛋白在髓母细胞瘤Daoy细胞株中的表达;通过转染Rac1 shRNA观察Rac1基因沉默后Daoy细胞骨架的变化,再转染Rac1 N17和Rac1 L61,观察Rac1基因缺失和表达增强后对Daoy细胞侵袭、移动的影响.结果 Rac1 mRNA和蛋白在Daoy细胞株中均有高表达;Rac1基因沉默后Daoy细胞交联的F-actin网和细胞膜伪足形成减少;单层细胞划痕24 h后,Rac1 shRNA组、Rac1 N17组、对照质粒(control)组细胞迁移数分别是86±4、97±6、198±7;Rac1 shRNA和Rac1 N17两组分别与control组比较,差异均有统计学意义(P<0.01).在侵袭实验中,Rac1 shRNA组、Rac1 N17组、对照质粒组细胞侵袭数分别是30±4、45±6、78±7;Rac1 shRNA组和Rac1 N17两组与对照组比较,差异均有统计学意义(P<0.01).结论 Rac1基因与Daoy细胞骨架形成密切相关,RNA干扰沉默Rac1基因可以抑制Daoy细胞的侵袭移动.     

性别决定区相关高迁移率族盒蛋白4促进结直肠癌耐药的研究

目的观察性别决定区相关高迁移率族盒蛋白4(SOX4)对结直肠癌化疗耐药的影响, 并探讨其分子机制。方法检测化疗敏感及耐药结直肠组织和细胞株中SOX4的表达。构建稳定高表达SOX4的结直肠癌细胞系, 利用细胞计数试剂盒(CCK-8)检测细胞在化疗药物作用下的细胞增殖能力, 用β-半乳糖苷酶染色观察细胞衰老的变化。用实时定量聚合酶链反应(Real-time PCR)以及蛋白质免疫印迹(Western blot)方法检测细胞衰老基因p21 mRNA以及蛋白水平, 用Western blot检测p53的蛋白水平变化。在p53缺失结直肠癌细胞中, Western blot检测检测高表达SOX4后, p21蛋白水平的变化。结果与化疗敏感结直肠癌组织相比, 耐药组织中SOX4表达明显升高(敏感组3例升高, 耐药组7例升高)。在细胞实验中得出一致结果(耐药组比对照组1.783±0.021, t=13.20, P<0.05]。在结直肠癌细胞系中高表达SOX4后, 加入5-Fu化疗药物, 观察到细胞耐药性增加(对照组细胞活力26%, 实验组分别为74%及70%), 衰老作用降低(衰老细胞比率对照组4...     

下调OCT4基因对人骨肉瘤F5M2细胞系增殖能力的影响

目的 探讨下调八聚体结合转录因子4(OCT4)基因对骨肉瘤细胞F5M2增殖能力的影响.方法 采用RNA干扰技术将OCT4基因特异性小干扰RNA(siOCT4)转染到处于对数生长期的F5M2骨肉瘤细胞中作为siOCT4组,并设立siNC组(转染siNC)及空白对照组.采用实时荧光定量PCR及蛋白免疫印迹法检测并比较siOCT4组和siNC组细胞中的OCT4 mRNA水平及蛋白表达水平;采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法及5-乙炔基-2′-脱氧尿苷(EdU)法检测并比较各组细胞的增殖能力;采用克隆形成试验检测并比较三组细胞的克隆形成能力.结果 siOCT4组中OCT4的mRNA表达水平及蛋白表达水平均较siNC组显著降低;MTT法的实验结果显示:与siNC组及空白对照组比较,siOCT4组细胞的生长曲线显著右移,增殖能力显著低于其他两组;EdU法检测结果显示:siNC组细胞的24 h平均增殖率为48.50％±4.54％,而siOCT4组细胞的24 h平均增殖率为32.30％±1.72％;与空白对照组及siNC组细胞比较,siOCT4组的克隆形成能力显著降低;以上差异均具有统计学意义(P均<0.05).结论 下调骨肉瘤细胞F5M2中OCT4的表达能抑制其细胞的增殖能力.     

过表达NDRG2基因促进人髓核细胞衰老的体外实验研究

[目的]研究NDRG2(N-Myc downstream-regulated gene 2)对人髓核细胞衰老的影响,进而探讨NDRG2在椎间盘退变中的作用。[方法]通过慢病毒过表达NDRG2基因稳定感染髓核细胞。设立正常髓核细胞组(空白组)、红色荧光蛋白标记的慢病毒感染髓核细胞组(对照组)及过表达NDRG2慢病毒感染髓核细胞组(实验组)。Western blot检测NDRG2蛋白表达水平,细胞衰老相关β半乳糖苷酶(senescence associated-β-galactosidase,SA-β-ga1)染色检测髓核细胞衰老变化,流式细胞仪检测髓核细胞周期变化,MTT法绘制生长曲线,并分析髓核细胞的增殖情况。[结果]正常髓核细胞感染过表达NDRG2慢病毒48 h后荧光显微镜下观察基因感染效率在95%以上;感染72 h后Western blot检测示NDRG2表达明显升高(P0.01);实验组SA-β-gal染色阳性率明显高于对照组和空白组(P0.01);MTT生长曲线显示慢病毒感染后髓核细胞增殖速度较对照组和空白组均减慢,潜伏期延长,缓慢进入对数期;细胞周期结果示实验组G0/G1期百分比明显高于对照组和空白组,S期明显低于对照组和空白组,差异有统计学意义(P0.05)。[结论]NDRG2基因过表达的髓核细胞衰老速度明显加快,提示NDRG2可能通过调控髓核细胞的衰老参与椎间盘退变过程,为椎间盘的退变生物学治疗提供依据。     

Bmi-1在神经母细胞瘤中的表达及意义

目的 通过检测原癌基因Bmi-1在神经母细胞瘤(NB)中的表达以及观察其表达水平对神经母细胞瘤的影响,探讨其在神经母细胞瘤中的作用.方法 用免疫组织化学和免疫印迹法检测方法分别检测人神经母细胞瘤标本和神经母细胞瘤细胞系细胞中Bmi-1的表达情况;采用逆转录病毒转染法将目的基因Bmi-1/si转染至Ⅰ型神经母细胞瘤细胞系BE-2-C细胞,通过Western免疫印迹法监测转染效果,并用软琼脂实验观察转染后的BE-2-C克隆形成能力.结果 在32例人神经母细胞瘤标本中29例有Bmi-1的高表达(90.63%),且Bmi-1的表达程度的高低和NB的临床分期和临床预后密切相关(P＜0.05),Western免疫印迹实验也显示9种不同病理类型的神经母细胞瘤细胞系细胞中均有Bmi-1的高表达,其表达水平和病理类型有密切相关.在软琼脂实验中,与对照组(空白载体转染组)比较,Bmi-1/si转染后的BE-2-C细胞所形成的克隆数目不仅显著减少,克隆也明显变小.结论 Bmi-1在神经母细胞瘤中高表达,其表达水平与肿瘤恶性程度密切相关,它在神经母细胞瘤的形成中起重要作用.     

低氧上调甲基转移酶RNA结合蛋白15通过AGAP2-AS1促乳腺癌侵袭的机制

目的探索低氧诱导乳腺癌细胞RNA结合蛋白15(RBM15)表达上调促进癌侵袭的作用及机制。方法分析基因型-组织表达(GTEx)和癌症基因图谱(TCGA)数据库中乳腺癌组织甲基转移酶RBM15和低氧诱导因子-1α(HIF-1α)表达水平及患者预后。使用实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)、Western blot比较常氧(20%O2)和低氧(1%O2)培养乳腺癌细胞MCF7、MDA-MB-231、BT20和HCC1143的RBM15、AGAP2反义RNA 1(AGAP2-AS1)表达, 采用甲基化转录组RNA免疫共沉淀结合qPCR(MeRIP-qPCR)检测AGAP2-AS1的RNA甲基化修饰;采用Transwell实验检测细胞侵袭能力。后用小干扰RNA(siRNA)或质粒敲低或过表达RBM15, 在敲低RBM15的细胞中同时过表达AGAP2-AS1, 检测AGAP2-AS1甲基化修饰水平和表达水平变化, 采用Transwell检测各组细胞侵袭能力变化。两样本间的比较采用t检验。结果 GTEx和TCGA数据库乳腺癌组织RBM15呈过表达(P<0.05), 且与不良预后——无病生存...     

E2F1对H2O2诱导的人乳腺癌细胞凋亡的影响

目的 观察E2F1对H2O2诱导的人乳腺癌细胞MDA-MB435凋亡的影响.方法 通过脂质体法转染目的质粒pcDNA3.1(+)/E2F1进人人乳腺癌细胞株MDA-MB435,筛选稳定表达E2F1的细胞克隆,通过Western blot法鉴定高表达E2F-1的MB435细胞克隆C1、C2和C3,并应用锥虫蓝染色法检测100 μmol/L H2O2处理后细胞的存活率变化.结果 在细胞克隆MB435/E2F1-C1、C2和C3中有高水平的E2F1表达,这些高表达E2F1的肿瘤细胞经100 μmol/L H2O2刺激后细胞存活率(分别为63.4％、54.2％和32.9％)相对于对照组(90.9％)均明显降低,且其降低的水平与E2F1的表达水平成正比,差异有统计学意义(P＜0.01).结论 E2F1对H2O2诱导的人乳腺癌细胞凋亡有促进作用.