苦参碱对人视网膜母细胞瘤细胞生长与端粒酶活性影响的实验研究

目的探讨苦参碱（Ma）对体外培养的人视网膜母细胞瘤HXO-Rb44细胞的生长抑制作用及其机制。方法培养的人HXO—Rb44细胞经不同浓度的Ma作用后,采用噻唑蓝比色法（MTT法）测定细胞的生长状况;采用苏木素-伊红染色、流式细胞技术及核苷酸末端转移酶介导的dUTP缺口标记法检测细胞凋亡率和形态学变化;采用端粒重复扩增法检测端粒酶活性的变化。结果一定浓度范围内Ma可抑制HXO—Rb44细胞的生长（P〈0．01）,24h内呈浓度依赖性。0．4mmol／LMa作用12h,可观察到HXO—Rb44细胞凋亡的形态改变,细胞凋亡率开始增加（P〈0．01）,端粒酶活性下降（P〈0．01）,两者在48h内均呈时间依赖性,并具有一定相关性（r=-0．961,P〈0．01）。结论Ma可抑制HXO—Rb44细胞生长,诱导其凋亡,端粒酶活性下降可能是Ma诱发HXO—Rb44细胞凋亡机制之一,提示Ma对视网膜母细胞瘤的综合治疗具有一定的应用前景。     

8-溴-环腺苷酸对视网膜母细胞瘤细胞系端粒酶活性及动力学影响的研究

目的 探讨8-溴-环腺苷酸（8-Br-cAMP）对视网膜母细胞瘤（RB）细胞系端粒酶活性及细胞周期变化的影响。 方法 将培养的RB细胞系分为对照组及实验组（加8-Br-cAMP培养组），分别进行体外培养2 4、48、72 h后，以聚合酶链反应-酶标免疫吸附实验方法检测其端粒酶活性,流式细胞仪检测细胞周期变化。 结果 各实验组RB细胞端粒酶活性与 对照组相比，差异均有显著性的意义（P<0.01）。8-Br-cAMP作用不同时间实验组的 端粒酶活 性吸光度[A，旧称光密度（OD）]值与作用时间之间，呈显著负相关（r=-0.778 9，F=33.936，P<0.01）。实验组细胞周期变化：G1期比率上升，S期比率下降。 结论 8-Br-cAMP可减弱RB细胞系端粒酶活性，影响其周期变化，抑制RB细胞系增生。 （中华眼底病杂志，2004，20：358-360）     

榄香烯乳对视网膜母细胞瘤HXO-RB44细胞survivin表达及端粒酶活性的影响

目的观察榄香烯乳对视网膜母细胞瘤（Rb）HXO-RB44细胞凋亡抑制蛋白survivin表达及端粒酶活性的影响，探讨榄香烯乳对RbHXO-RB44细胞的作用机制。方法用不同浓度榄香烯乳作用于HXO-RB44细胞，采用四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法测定细胞增生活性；RT-PCR检测survivinmRNA的表达；聚合酶链反应方法检测端粒酶活性。结果榄香烯乳处理后HXO-RB44细胞受到不同程度的抑制，survivinmRNA表达下降；RB细胞系端粒酶活性减弱。结论榄香烯乳诱导HXO—RB44细胞凋亡与survivin有关；可减弱RB细胞系端粒酶活性，影响其周期变化，抑制RB细胞系增生。     

全反式维甲酸对Rb细胞的生长及Cx43蛋白分子表达的影响

目的研究全反式维甲酸（ATRA）对视网膜母细胞瘤（Rb）细胞的生长及细胞间隙连接蛋白（Cx）43分子表达的影响，探讨其作用机制。方法设立3种浓度（10^-3mol／L、10^-6mol／L和10^-7mol／L）ATRA分别作用于Rb细胞，采用四甲基偶氮唑蓝（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）比色法检测细胞生长抑制率，流式细胞术检测细胞周期改变及凋亡率，免疫组织化学方法检测细胞Cx43蛋白的表达。结果经ATRA作用后，Rb细胞增生率下降，G0／G1期细胞比例增高而S期比例相对下降，细胞凋亡率升高，Cx43蛋白表达上调。上述效应均呈药物浓度及作用时间依赖性。结论ATRA通过将Rb细胞生长周期阻滞于G0／G1期并促进凋亡而抑制其生长，同时可诱导细胞Cx43分子表达上调。     

KAI1对HXO—Rb44细胞同质性黏附、迁移和侵袭能力的影响

目的研究肿瘤转移抑制基因KAI1对人视网膜母细胞瘤HXO．Rb44细胞黏附力、运动力和侵袭力的影响。方法实验研究。应用脂质体转染法将含KAI1的真核表达质粒pCMV—KAI1转染人HXO—Rb44细胞株,命名为HXO—Rb44-KAI1,使其KAI1蛋白过表达。以转染空载体质粒pcDNA3．1（＋）及未转染质粒的HXO—Rb44细胞作为对照,分别命名为HXO—Rb44．KAI1／zero及HXO—Rb44。质粒转染48h后,吹散细胞,显微镜下观察三组细胞的同质性黏附情况;应用Transwell小室及其联合Matrigel分别进行迁移和侵袭实验。100倍光镜下观察进入Transwell下室的细胞并随机选取5个视野进行细胞计数,采单因素方差分析对三组细胞的迁移和侵袭能力进行比较。结果质粒转染48h后,PCR及WesternBlot显示HX0-Rb44-KAI1细胞的KAI1表达明显强于HXO-Rb44-KAI1／zero及HXO—Rb44细胞。HXO—Rb44-KAI1细胞的同质性黏附力明显强于HXO-Rb44-KAI1／zero及HXO—Rb44细胞。Transwell迁移实验显示,100倍镜下下室中平均每视野细胞数,HXO—Rb44-KAI1组为（20．4±4．0）个,HXO-Rb44-KAI1／zero组为（46．0±4．5）个,HXO-Rb44组为（52．1±3．6）个,差异有统计学意义（F=256．71,P〈0．01）。侵袭实验显示100倍镜下下室中平均每视野细胞数,HXO—Rb44-KAI1组为（16．7±3．3）个,HXO—Rb4J4．KAI1／zero组为（42．5±3．7）个,HXO—Rb44组为（47．3±5．2）个,差异有统计学意义（F=235．12．P〈0．01）。结论KAI1可显著增强HXO—Rb44细胞同质性黏附力,抑制其运动力和侵袭力。     

HXO-Rb44视网膜母细胞瘤株多药耐药现象的基因研究

目的 研究视网膜母细胞瘤（retinoblastoma,Rb)细胞系HXO－Rb44细胞多药耐药基因（multidrug resistance gene,MDR1)和多药耐药相关蛋白（multidrug associated protein,MRP）基因的表达,探讨Rb多药耐药现象的发生机制。方法 用逆转聚合酶链反应检测HXO－Rb44细胞的MDR1和MRP基因的表达,并用免疫组织化学方法对其蛋白产物P－gp和P190进行检测。结果 HXO－Rb44系同时存在MDR1和MRP基因,并呈现P-gp和P190的过度表达（96％和97％）。结论 MDR1和MDRP基因的过度表达是Rb多药耐药现象发生的重要机制。     

视网膜母细胞瘤基因对视网膜母细胞瘤移植瘤细胞周期的影响

目的 观察外源性视网膜母细胞瘤基因(Rb基因)对视网膜母细胞瘤(retinoblastoma,RB)移植瘤细胞周期的影响。 方法 在建立裸鼠眼玻璃体腔RB移植瘤模型及构建Rb基因的逆转录病毒表达载体PBabe-Rb的基础上,用脂质体Dosper介导法将Rb基因导入裸鼠RB移植瘤,流式细胞仪检测RB移植瘤细胞周期变化。 结果 Rb基因在RB移植瘤内的表达使RB移植瘤G₁期细胞数明显增加,DNA指数及S期百分比值有所降低。 结论 外源性Rb基因可部分抑制RB移植瘤细胞周期的进程。（中华眼底病杂志,2000,16：1-70）     

人参皂甙Rg3诱导视网膜母细胞瘤HXO-RB44细胞凋亡

目的观察人参皂甙Rg3对体外视网膜母细胞瘤（Rb）HXO—RB44细胞凋亡的作用。方法不同质量浓度的Rg3处理HXO—RB44细胞后，应用MTT比色法分析其细胞生长抑制作用。HOECHST33258染色法观察细胞的形态学改变，流式细胞仪测定48h细胞凋亡率。结果人参皂甙Rg3在一定范围内抑制体外培养的HXO-RB44细胞生长，其抑制率具有时间、质量浓度依赖性（P〈0.01）。HOECHST染色可见实验组HXO-RB44细胞中致密强荧光。流式细胞仪检测凋亡率随药物质量浓度增加而增加。结论人参皂甙Rg3主要通过诱导HXO—RB44细胞凋亡达到抑制作用。     

视网膜母细胞瘤的DNA含量研究

目的 :研究不同类型视网膜母细胞瘤 (Retinoblastoma ,Rb)标本中的DNA含量及细胞周期各时相分布 ;探讨影响Rb增殖和分化的因素。方法 :应用流式细胞学技术检测 2 0例Rb标本的DNA含量及细胞周期各时相分布 ,定量分析其增殖指数 ,并将各指标进行比较。结果 :正常视网膜组织细胞与不同分化类型Rb的DNA组方图明显不同。Rb的DNA指数 (DI)及S期细胞百分比 (SPF)在不同的Rb视神经侵犯程度、分化类型中具有显著的统计学差异 :Rb累及视神经筛板后的Rb组的DI和SPF值均高于未累及筛板组 (P <0 0 5 ) ;分化型Rb的DI明显低于未分化型组 (P <0 0 1) ,而SPF明显高于未分化组 (P<0 0 1)。结论 :视网膜母细胞瘤DNA含量的研究有助于认识Rb的发生、发展规律 ,具有一定的理论价值与应用前景     

8-Br-cAMP对视网膜母细胞瘤株增殖的影响

目的 从细胞水平上探讨8-Br-cAMP对视网膜母细胞瘤株增殖的影响。方法 采用8-Br-cAMP对视网膜母细胞瘤株HXO-Rb_(44)细胞进行体外实验,通过蛋白斑点印迹方法检测HXO-Rb_(44)细胞PCNA-IR的OD值,观察其增殖情况,流式细胞术检测细胞周期变化。结果 HXO-Rb_(44)细胞增殖受抑制,PCNA OD值与药物作用时间呈显著负相关(P<0.01),且细胞周期发生改变,被阻滞于G_0/G_1期,S期比率下降,亦与药物作用时间有关。结论 8-Br-cAMP具有抑制Rb_(44)细胞增殖作用,使其阻滞于G_1期,为临床治疗视网膜母细胞瘤提供了新的途径。     

miR-130b在人视网膜母细胞瘤中的表达及促癌机制研究

目的：检测miR-130b在人视网膜母细胞瘤(RB)中的表达并初步探究其促癌机制。

方法：采用qRT-PCR检测miR-130b在人RB癌组织及癌旁组织、人RB细胞系(HXO-Rb44与Y79)中的表达; 采用qRT-PCR、Western Blot及免疫荧光实验检测miR-130b过表达及干扰前后HXO-Rb44与Y79细胞中PTEN的表达水平; 采用双荧光素酶报告基因试验验证miR-130b与PTEN的靶向关系; 采用共转染实验考察PTEN与miR-130b影响RB细胞系PI3K/Akt信号通路表达的关系。

结果：miR-130b在RB癌组织中的表达水平显著高于癌旁组织(P<0.05)。与ACBRI-181细胞比较,miR-130b在HXO-Rb44与Y79细胞中的表达水平显著增高(P<0.05)。与RB癌组织比较,PTEN在其癌旁组织中的表达水平显著增高(P<0.05); miR-130b表达水平与PTEN表达水平呈负相关性(P<0.001)。过表达miR-130b后的HXO-Rb44细胞PTEN mRNA与蛋白表达水平均显著降低,而干扰miR-130b后的Y79细胞PTEN mRNA与蛋白表达水平均显著升高(P<0.05)。与miR-130b mimics+PTEN-NC组比较,miR-130b mimics+wt-PTEN组荧光素酶活性明显降低(P<0.05)。共转染miR-130b mimics+PTEN-NC HXO-Rb44细胞p-Akt 308与p-Akt 473蛋白表达水平显著增高(P<0.05),PTEN蛋白表达水平显著降低(P<0.05); 共转染miR-130b mimics+PTEN HXO-Rb44细胞中,以上三种蛋白表达水平均未发生明显改变。

结论：miR-130b在RB组织及细胞系中呈高水平表达,PTEN为miR-130b的靶基因,miR-130b可能是经负向调控PTEN对PI3K/Akt信号通路的表达产生影响,最终发挥促癌作用。     

8-Br-cAMP可上调人视网膜母细胞瘤HX O-Rb44细胞抑癌基因的表达

目的 探讨８－Ｂｒ－ｃＡＭＰ对人网膜母细胞瘤ＨＸＯ－Ｒｂ４４细胞抑癌基因表达的效应，方法 应用ＲＮＡ斑点印迹技术检测细胞ｐ１６、ｐ２１ｗａｆｌ、ｗｐ５３、ｍｐ５３和Ｒｂ的ｍＲＮＡ、应用免疫组化斑点印迷技术检测细胞Ｐ１６、Ｐ２１ｗａｆｌ、ＰＲｂ、ｃｄｋ２、ｃｄｋ４和ＰＣＮＡ蛋白质表达的免疫反应（ＩＲ）。结果 在斑点印迹标本上，人ＨＸＯ－Ｂｂ４４细胞ｐ１６、ｐ２１ｗａｆｌ、ｗｐ５３及Ｒｂ的ｍＲＮＡ信号     

沉默LncRNA DLGAP1-AS2对人视网膜母细胞瘤增殖和迁移及侵袭的影响

目的:探讨沉默LncRNA DLGAP1-AS2对人视网膜母细胞瘤HXO-Rb44增殖、迁移和侵袭的影响及其可能作用机制。方法:收集病理确诊且临床资料完整的视网膜母细胞瘤组织标本25例,同时选取因外伤摘除眼球的正常视网膜组织9例为对照;qRT-PCR法检测正常视网膜组织、视网膜母细胞瘤组织、人正常视网膜血管内皮细胞ACBRI-181、视网膜母细胞瘤细胞HXO-Rb44中DLGAP1-AS2、miR-1193的表达量;将si-NC、si-DLGAP1-AS2、miR-NC、miR-1193 mimic、si-DLGAP1-AS2与miR-1193 inhibitor(共转染)分别转染至HXO-Rb44细胞;双荧光素酶报告实验检测DLGAP1-AS2与miR-1193的靶向关系;CCK-8法、平板克隆形成实验与Transwell实验分别检测细胞增殖、集落形成数、迁移及侵袭;Western blot法检测E-cadherin、N-cadherin蛋白表达量。结果:视网膜母细胞瘤组织中DLGAP1-AS2的表达量高于正常视网膜组织(P<0.05),而miR-1193的表达量低于正常视网膜...     

Characteristics of an Established Retinoblastoma Cell Line HXO—Rb44

Purpose: To study the retinoblastoma cell culture and to establish a new retinoblastoma cell line.Methods: 22 retinoblastomas were cultured by using the method of single cell suspension. Characteristics of the cultured cells were studied in the following programs: tumor cell morphology in vitro, electron microscopic, growth curve, cloning in soft agar,immunohistochemistry,karyotype and tumorigenicity. Results: 22 retinoblastomas were cultured successfully in vitro,only a continued cell line HXO-Rb44 was established (more than 3 years). The characteristics of this cell line are that it grew as a suspension of round cell in graps like clusters in vitro, its population doubling time was 44 hours,and it could be cloned in soft a-gar. Histopathologic and ultrastructured pictures showed the characteristics of Rb. HXO-Rb44 cell was positive to NSE and negative to GFAP in immunohis-tochemical staining. A subcutaneous injection of HXO-Rb44 cells produced a retinoblastoma in BALB/C athumic nude mice.Conclusions:     

顺铂对视网膜母细胞瘤细胞B7-H1表达的影响

　　目的　观察顺铂对视网膜母细胞瘤（RB）细胞B7-H1表达的影响,并探讨其作用机制。方法　分别采用浓度为0.375、0.750、1.500、3.000、6.000 μg/ml顺铂处理人RB细胞HXO-Rb₄₄细胞,作为不同浓度实验组;以RPMI 1640细胞培养液处理HXO-Rb44细胞作为空白对照组。采用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）和荧光定量聚合酶链反应（PCR）检测HXO-Rb₄₄细胞B7-H1 mRNA的表达;免疫荧光染色和流式细胞术检测HXO-Rb₄₄细胞B7-H1蛋白表达。采用1.500 μg/ml顺铂处理HXO-Rb₄₄细胞0、15、30、60、120 min,蛋白免疫印迹（Western blot）检测细胞外信号调节激酶1/2（ERK1/2）的磷酸化水平。结果　0.375、0.750、1.500、3.000、6.000 μg/ml组HXO-Rb₄₄细胞B7-H1 mRNA表达均较空白对照组高,差异有统计学意义（F=395.478,P=0.000）。0.375、0.750、1.500、3.000、6.000 μg/ml组HXO-Rb₄₄细胞B7-H1蛋白表达均较空白对照组高,差异有统计学意义（F=112.03,P=0.000）。 Western blot 检测显示,1.500 μg/ml顺铂激活HXO-Rb₄₄细胞ERK1/2蛋白的磷酸化水平;随时间延长,其磷酸化水平逐渐增高,至30 min达高峰,以后又逐步下降。结论　顺铂能促进RB细胞B7-H1 mRNA和蛋白的表达;ERK1/2信号通路可能参与了这一过程。      

低强度2450 MHz微波阻断兔晶状体上皮细胞周期及对相关基因表达的影响

目的　探讨不同剂量微波辐射对兔晶状体上皮细胞 (RLEC)细胞周期的阻断作用 ,以及微波辐射对细胞周期调控基因P2 1WAF1、P2 7Kip1及c myc表达的影响。 方法　应用频率为 2 4 5 0MHz、功率密度分别为 0 10 (A组 )、0 2 5 (B组 )、0 5 0 (C组 )、1 0 0 (D组 )及 2 0 0mW /cm2 (E组 )的微波连续辐射体外培养的RLEC 8h ,光镜下观察辐射前、后细胞形态学的改变 ,采用流式细胞技术测定细胞周期 ,Western印迹法检测功率密度 2 0 0mW /cm2 的微波辐射 4、6及 8h对P2 1WAF1、P2 7Kip1及c myc基因表达的影响。以无微波辐射对照者为F组 ,进行对照研究。结果　微波辐射 8h后 ,C、D及E组RLEC肿胀和聚集 ,甚至出现细胞固缩和脱壁现象 ,G0 /G1期细胞所占比例明显升高 (P <0 0 5 )。功率密度 2 0 0mW /cm2 的微波辐射 4h ,P2 7Kip1表达水平即开始明显升高 ,而c myc表达水平开始逐渐下降 ,P2 1WAF1表达无变化。结论　功率密度≥ 0 5 0mW/cm2 的微波可阻断RLEC细胞周期 ,并使细胞停滞于G0 /G1期 ;这种阻断作用可能是通过调节调控细胞周期转换的基因P2 7Kip1和c myc而实现。