人巨细胞病毒感染对宿主细胞周期蛋白表达影响的实验研究

目的观察人巨细胞病毒（HCMV）感染对宿主细胞周期蛋白（Cyclins）表达的影响。方法用HCMV感染同步化于G0/G1期的人胚肺成纤维细胞（HEL）,分别于感染后0 h、3 h、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h、96 h终止培养。用免疫蛋白印迹法（Western Blot）检测CyclinE、CyclinA、CyclinD1蛋白的表达。结果HCMV感染接触抑制细胞12 h时CyclinE蛋白被诱导,感染后24 h出现CyclinE峰值;HCMV不能诱导CyclinA蛋白表达;CyclinD1没有被诱导,且在感染后24 h开始下降。结论HCMV感染同步化于G0/G1期的细胞后,诱导CyclinE蛋白明显升高,激活CyclinE/Cdk2激酶,使细胞周期越过G1/S限制点,将细胞周期阻止于晚G1期。     

人巨细胞病毒感染对宿主细胞周期素依赖性蛋白激酶2的影响

目的 观察HCMV感染细胞周期素依赖性蛋白激酶2（Cdk2）的亚细胞定位，研究HCMV感染对Cdk2蛋白水平及对细胞周期蛋白E（CyclinE）／Cdk2激酶活性的影响。方法通过密度抑制使细胞同步化于G0／G1期，用HCMV AD169毒株感染人胚肺成纤维细胞（HEL），用免疫细胞化学技术分别测定HCMV感染前及感染后24 h Cdk2亚细胞定位；Western Blot法测定HCMV Cdk2蛋白丰度；用免疫沉淀，激酶活性分析法检测HCMV感染细胞内Cdk2的活性。结果 接触抑制阻止在Go期细胞Cdk2游离在细胞质，HCMV感染24h内导致Cdk2从细胞质移位到细胞核。同时HCMV感染可引起cvclinE／Cdk2激酶的强烈激活，但HCMV感染并不诱导Cdk2蛋白丰度增加。结论HCMV感染G0／G1细胞，在24h内导致Cdk2从细胞质移位到细胞核，使之与细胞核内的调节亚单位CyclinE结合，激活CyclinE／Cdk2激酶，使细胞周期越过G1，S限制点，进展至晚G1期。     

人巨细胞病毒感染对宿主细胞CyclinE/Cdk2激酶活性影响的实验研究

目的研究HCMV感染对Cdk2蛋白水平及对CyclinE/Cdk2激酶活性的影响。方法通过接触抑制使细胞同步化于G0/G1期,用MOI=5PFU/per cell HCMV AD169毒株感染人胚肺成纤维细胞（HEL）;用免疫沉淀,激酶活性分析法检测HCMV感染细胞Cdk2的活性。结果HCMV感染可引起CyclinE/Cdk2激酶的强烈激活,但HCMV感染并不诱导Cdk2蛋白丰度增加。结论HCMV感染G0/G1细胞,激活CyclinE/Cdk2激酶。使细胞周期越过G1/S限制点,进展至晚Gl期。     

巨细胞病毒对细胞周期的影响及其机制

HCMV感染对细胞周期有很大的影响，处于不同细胞周期的细胞感染HCMV，皆可导致细胞周期的改变。在G0期及G1期感染HCMV可导致细胞周期进展到了G1/S限制点，在S期细胞感染HCMV可导致细胞周期受阻。细胞将不能进行有丝分裂，HCMV影响细胞周期主要是其极早期蛋白IE1-72及IE-86的作用，以IE2-86为主。其机制包括：使CyclinE的转录活性增加；把Cdk2从细胞浆转移到细胞核；细胞核中CKIs水平的下降。     

人巨细胞病毒感染对体外培养成纤维细胞E2F1表达的时序性影响

目的 研究人巨细胞病毒（human cytomegalovirus,HCMV）感染对体外培养成纤维细胞E2F1表达的时序性影响,进一步揭示HCMV的致病机制.方法 用高和低感染复数（multiplicity of infection,MOI）HCMV病毒感染体外培养的成纤维细胞,在不同时间点用Western blot法检测细胞E2F1蛋白表达水平.结果 低MOI和高MOI感染都可时序性上调宿主细胞E2F1蛋白表达,均以感染后2h上调幅度最高（2～3倍）.高MOI感染的上调作用强于低MOI感染.结论 HCMV在感染初期即可激发宿主细胞E2F1表达明显增加,并在24h内呈时序性上调,提示E2F1在病毒感染早期诱导宿主细胞向S期和G2/M期偏移,进而在营造有利于病毒复制微环境的机制中起关键作用.     

巨细胞病毒对细胞周期的影响及其机制

HCMV感染对细胞周期有很大的影响,处于不同细胞周期的细胞感染HCMV,皆可导致细胞周期的改变,在G0期及G1期感染HCMV可导致细胞周期进展到了G1/S限制点,在S期细胞感染HCMV可导致细胞周期受阻,细胞将不能进行有丝分裂.HCMV影响细胞周期主要是其极早期蛋白IE1-72及IE2-86的作用,以IE2-86为主,其机制包括使CyclinE的转录活性增加;把Cdk2从细胞浆转移到细胞核;细胞核中CKIs水平的下降.     

起始识别复合物1基因在血管平滑肌细胞DNA复制中的作用

目的探讨起始识别复合物1（ORC1）在血管平滑肌细胞（VSMC）DNA复制中的表达及其意义。方法采用组织块贴片法原代培养的大鼠胸主动脉VSMC,利用双胸苷阻断、秋水仙素阻抑法和血清饥饿法使VSMC达到细胞周期同步化,用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）技术和Western blot检测不同细胞周期的VSMC ORC1 mRNA和蛋白表达。结果同步化的VSMC DNA含量百分比,血清饥饿法以G0G1期为主（P〈0．01）,双胸苷阻断14h以G0G0期为主（P〈0．01）,双胸苷阻断14h后10％胎牛血清刺激6h以S期为主（P〈0．01）,秋水仙素培养12h以G2／M期为主（P〈0．05）。静止状态VSMC的ORC1 mRNA和蛋白质无表达,处于G1／S期VSMC的ORC1 mRNA表达量显著高于S期和G2／M期。VSMC的ORC1蛋白质表达量与ORC1 mRNA变化规律相似。结论ORC1随细胞的分裂周期而表达,ORC1可能是启动VSMC DNA复制的关键因子。     

17-β-雌二醇对HMGB1过表达THP1细胞的细胞周期进程的影响

目的:研究17-β-雌二醇联合HMGB1的过表达对人单核细胞系THP1细胞细胞周期和NF-κB转录因子的影响。方法:血清饥饿法同步化细胞周期后,利用脂质体法将pFLAG-CMV-HMGB1转染THP1细胞;10-9mol/L17-β-雌二醇刺激同步化THP1细胞16、30小时后,流式细胞术检测细胞周期分布,RT-qPCR检测Cyclin A、Cyclin D1的mRNA表达水平,免疫印迹检测HMGB1蛋白的表达;荧光素酶报告基因检测NF-κB的活性。结果:HMGB1过表达的THP1细胞中HMGB1蛋白的表达水平比正常THP1细胞要高3.7倍,血清饥饿法成功将THP1细胞周期同步化,同步化后G0/G1期细胞百分数由53%上升到78%;17-β-雌二醇刺激HMGB1过表达细胞30小时后出现Cyclin AmRNA表达上升为原来的7.9倍,而Cyclin D1 mRNA表达明显下降,G1期细胞百分比由53.11%下降为33.33%,S期细胞百分比由35.43%上升为53.91%,此改变在刺激后30小时达到最大值;NF-κB活性在17-β-雌二醇刺激HMGB1过表达细胞明显升高,且时间上提前于细胞周期动力学改变。结论:雌激素对THP1细胞周期调节依赖HMGB1,NF-κB可能参与其中。     

人巨细胞病毒对体外培养的人涎腺导管上皮细胞周期的影响及其相关机制

目的 研究人巨细胞病毒（HCMV）对人涎腺导管上皮细胞（HSG）细胞周期的影响及其相关机制.方法 体外培养HSG;用RT-PCR及nest-RT-PCR法检测感染HCMV的HSG中立即早期基因（ie1/ie2）的转录;用流式细胞仪检测HCMV对HSG细胞周期的影响;用蛋白印迹技术检测HCMV感染细胞中周期素D1的表达.结果 感染HCMV的HSG中可检测到HCMV ie1/ie2的转录;HCMV通过影响细胞周期的G1/S关卡,使HSG阻滞于G1期;感染HCMV的HSG周期素D1表达下调.结论 在体外HCMV通过作用于细胞周期的G1/S关卡及下调周期素D1抑制涎腺导管上皮细胞的增殖.     

MR1 siRNA抑制人肝癌细胞BEL-7402的增殖

目的 研究MR1基因对肝癌细胞增殖的影响及机制。 方法 化学合成MR1 siRNA,用脂质体lipofectamine 2000转染肝癌细胞系BEL-7402细胞,RT-PCR检测MR1 siRNA基因沉默效果。用SRB法、集落形成法和生长曲线法检测MR1 siRNA对BEL-7402细胞增殖的影响。流式细胞术检测BEL-7402细胞周期,用细胞同步化的方法,即与G2期阻滞药物噻氨酯哒唑（nocodazole）联合应用,以间接反映MR1 siRNA对肿瘤细胞周期的影响。Western blot法检测Cyclin D1蛋白。结果（1）300nmol/L MR1 siRNA处理BEL-7402细胞24h后,MR1基因的mRNA水平明显降低。（2）经siRNA处理后,BEL-7402细胞存活细胞数明显下降,细胞生长速度明显减慢,集落形成率显著下降,Cyclin D1表达水平明显降低。（3）MR1 siRNA与nocodazole联合处理BEL-7402细胞后,G2期细胞比例显著减少,而G1期细胞明显增多。结论 MR1基因与人肝癌BEL-7402细胞增殖相关,抑制MR1表达,能够引起细胞的增殖抑制,其作用机制与诱导细胞的G1期阻滞有关。     

TNFα和IL-10在巨细胞病毒感染人胚肺成纤维细胞中的作用

目的:研究TNFα和IL-10对人巨细胞病毒(HCMV)感染人胚肺成纤维细胞(HEL)的影响,以及感染细胞产生TNFα的变化,探讨有关细胞因子在HCMV感染免疫中的作用。方法:用不同浓度的TNFα和IL-10作用于HEL,24h后感染病毒,研究TNFα和IL-10对HCMV感染HEL的影响。用HCMV感染HEL,感染后(4、24、48、72、96h)分别收集培养上清液,用ELISA法检测TNFα含量。结果:在病毒感染前,中、高浓度TNFα或低、中浓度IL-10可抑制HCMV在HEL内的增殖。HCMV感染HEL后,细胞产生TNFα的量无明显改变。结论:TNFα和IL-10在HCMV感染免疫过程中起作用。     

大蒜新素对巨细胞病毒感染细胞周期蛋白基因表达谱的影响

目的 探讨人巨细胞病毒(human cytomegalovirus，HCMV)对感染细胞周期蛋白基因表达谱的影响及大蒜新素的干预效应。方法 利用基因芯片技术对比分析大剂量大蒜新素处理正常细胞和感染细胞(MOI=2．5)72h以及同期培养的感染和正常细胞周期相关蛋白基因(239条)表达谱的变化。结果 感染细胞有24条(10．04％)基因发生有意义的差异性表达；其中9条表达增加，15条表达降低。大蒜新素对ll条HCMV感染所致表达改变的基因无影响；使HCMV感染下调作用消除的基因有ll条；使HCMV感染上调作用消除的基因有2条。另外，药物对感染细胞和正常细胞基因表达均有影响的有2条；仅引起正常细胞基因表达改变的有3条。结论 HCMV感染使部分细胞周期相关蛋白基因差异性表达可能是HCMV导致宿主细胞周期紊乱的原因之一。大蒜新素至少可使HCMV所致13条基因差异性表达作用消除，提示药物干预了病毒对细胞周期的影响。     

巨细胞病毒感染后晚期mRNA表达与细胞病变相关性的研究

目的 研究巨细胞病毒(HCMV)感染后晚期mRNA的表达与致细胞病变作用(CPE)及感染细胞的超微结构变化。方法 用HCMV AD169株感染人胚肺成纤维细胞，通过半定量RT-PCR检测HCMV晚期mRNA的表达水平，同时动态观察CPE的改变，电镜观察细胞的超微结构变化。结果 HCMV晚期mRNA在感染后12h开始表达，随时间的延长水平逐渐升高；而CPE在48h后才出现，并逐渐加重。电镜下可见内质网早期囊腔扩张，晚期呈空泡变，线粒体肿胀，线粒体嵴数目减少，甚至缺失，感染晚期细胞核中有大量成熟待出壳的病毒核衣壳。结论 细胞超微结构变化与HCMV晚期mRNA表达密切相关，在病毒循环中起重要作用。晚期mRNA可作为观察治疗。HCMV活动性感染的临床疗效指标。     

Identification and characterization of deoxyribonucleoprotein complexes containing the major DNA-binding protein of herpes simplex virus type 1

The stimulation of host cell DNA synthesis was studied in permissive human embryonic lung (HEL) cells and in nonpermissive rabbit kidney (RK) cells infected with human cytomegalovirus (HCMV). Host cell DNA synthesis was induced by HCMV infection in resting cells of both types. In permissive cultures the stimulation of cellular DNA synthesis was detectable mainly in those cells which had not become productively infected and in which virus antigens were not detectable. In abortively infected RK cells, on the other hand, stimulation of host cell DNA synthesis and the expression of virus antigens were detected in the same cells. Infection of actively growing permissive HEL cells resulted in a shutdown of cellular DNA synthesis beginning approximately 10 hr postinfection. Shutdown of cellular DNA synthesis also occurred when the infected cells were treated with phosphonoacetic acid and was thus classified as an "early" virus function. In actively growing, abortively infected RK cells, on the other hand, host cell DNA synthesis was not affected, indicating that the early virus function(s) responsible for inhibition of cellular DNA synthesis was not expressed in these cells. Virus-encoded DNA polymerase activity, another early virus gene function, was also not detected in these abortively infected cultures. In RK cells the cellular DNA synthesized as a result of infection was capable of undergoing at least one further round of replication, indicating that the HCMV gene expression which occurred in abortively infected RK cells was not lethal for these cells.     

Rabbit kidney cells abortively infected with human cytomegalovirus are arrested in mitotic phase

Summary In rabbit kidney epithelial cells (RK₁₃) abortively infected with human cytomegalovirus (HCMV), DNA synthesis at 1 or 2 days post-infection was enhanced 4 to 5 fold, compared to mock-infected cells. DNA analysis by isopycnic centrifugation revealed that the DNA newly synthesized in the virus infected RK₁₃ cells was of cellular origin. HCMV infection also caused a marked increase in the mitotic activity of RK₁₃ cells. When semi-confluent RK₁₃ cells were infected more than 20 per cent of cells demonstrated mitosis at 72 hours post-infection although the rate of cell growth was considerably reduced compared to that of uninfected cells. The most frequent chromosomal change observed was fragmentation although other aberrations, gap, break, deletion etc. occurred also.Two immediate-early viral polypeptides with apparent molecular weights 72,000 (72K) and 76,000 (76K) daltons were produced in both RK₁₃ cells and human embryonic lung cells (HEL) by 3 hours post-infection. Synthesis of the 76K polypeptide was greater than that of the 72K polypeptide in non-permissive RK₁₃ cells whereas the reverse occurred in permissive HEL cells. Furthermore, of three early polypeptides which were expressed in productively infected HEL cells two, 88K and 80K, were not detected in abortively infected RK₁₃ cells.These results suggest that the arrest in mitosis of the abortively infected RK₁₃ cells and the subsequent chromosomal changes are associated with the altered expression of immediate-early or early virus functions in these cells.Following HCMV infection permissive HEL cells undergo a characteristic sequence of morphological changes (3) of which cell rounding and contraction are observed in the early stages and could be related to either the action of cellular contractile proteins or changes in the plasma membrane permeability and a concomitant Ca⁺⁺ influx (2). Relaxation and cell enlargement are other changes considered to be initiated by early virus functions although they occur after the commencement of virus DNA synthesis. Thus, the expression of immediate-early and early virus functions has an important role in controlling the sequential morphological changes in infected cells and may also be important in determining whether infection with HCMV will be productive or abortive.With 4 Figures     

人巨细胞病毒蛋白pp65诱导特异性免疫应答的研究

目的研究人巨细胞病毒(human cytomegalovirus,HCMV)蛋白pp65(HCMV pp65)蛋白对特异性免疫应答的诱导作用。方法采用T细胞体外激活试验检测重组HCMVpp65蛋白对人外周血单个核细胞(perpheral blood mononuclear cells,PBMC)的刺激作用,并对激活的淋巴细胞进行传代培养,观察细胞的增殖;收集传代增殖的淋巴细胞,检测其对受HCMV感染的人胚肺成纤维细胞(human embryo lung fibro-blasts,HEL)的杀伤作用和对受感染后不同时段的HEL的杀伤功能。结果重组HCMV pp65蛋白在体外能激活PBMC,并使激活的细胞增殖;增殖的淋巴细胞可特异性地杀伤受HCMV感染的HEL细胞,但对未受感染的HEL细胞无杀伤作用,且其对受染2h后的HEL即有杀伤作用。结论重组HCMV pp65蛋白可诱导CD8 T细胞的激活与增殖,对受HCMV感染细胞产生特异性的杀伤作用,此作用不需要病毒转录和蛋白合成,对于HCMV的免疫治疗将有重要的作用。